Utilisation de la séquence d'arrêt SecM comme un outil pour isoler les polypeptides Ribosome Bound

Biology

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Summary

Nous décrivons ici une technique qui est maintenant couramment utilisé pour isoler de manière stable liés ribosome complexes de la chaîne naissante (RNC). Cette technique tire parti de la découverte que de 17 acides aminés de long "séquence d'arrêt" SecM peut arrêter élongation de la traduction dans un procaryote (

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Jha, S. S., Komar, A. A. Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides. J. Vis. Exp. (64), e4027, doi:10.3791/4027 (2012).

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Abstract

Des recherches approfondies ont fourni des preuves suffisantes indiquant que repliement des protéines dans la cellule est un processus de co-traductionnelle 1-5. Toutefois, la voie exacte que la chaîne polypeptide suit au cours de co-traductionnelle de pliage pour réaliser sa forme fonctionnelle est encore une énigme. Afin de comprendre ce processus et de déterminer la conformation exacte des intermédiaires co-traductionnelles de pliage, il est essentiel de développer des techniques qui permettent l'isolement des porteurs de chaînes naissantes RNC de tailles prédéterminées afin de permettre leur analyse ultérieure structurelle.

SecM (moniteur sécrétion) est un acide aminé 170 E. protéines coli qui régule l'expression de l'aval Seca (conduite sécrétion) ATPase dans l'opéron SECM-secA 6. Nakatogawa et Ito initialement que une séquence de 17 acides aminés de longueur (G 150-FSTPVWISQA QGIRA P-166) dans la région C-terminale de la protéine SecM est nécessaire et suffisant pourprovoquer de décrochage de l'allongement SecM à Gly165, produisant ainsi peptidyl-glycyl-ARNt stable lié à la ribosomal P place 7-9. Plus important encore, il a été constaté que cette séquence de 17 acides aminés de long peut être fusionné à l'extrémité C-terminale de pratiquement n'importe quelle protéine de pleine longueur et / ou tronquée permettant ainsi la production de RNC porteurs de chaînes naissantes de tailles prédéterminées 7. Ainsi, lorsqu'il est fondu ou est insérée dans la protéine cible, la séquence de décrochage SecM produit arrêt de l'allongement de la chaîne polypeptidique et génère RNC stables in vivo dans E. coli et les cellules in vitro dans un système acellulaire. Centrifugation en gradient de saccharose est en outre utilisé pour isoler RNC.

Les RNC isolés peuvent être utilisés pour analyser les caractéristiques structurales et fonctionnelles des intermédiaires co-traductionnelles de pliage. Récemment, cette technique a été utilisée avec succès pour mieux comprendre la structure de plusieurs chaînes de ribosomes liés naissantes 10,11. Ici on décrit l'isolement de bovin gamma-B cristallin fusionné à RNC SecM et généré dans un système de traduction in vitro.

Protocol

1. Préparation Patron de l'ADN et la transcription in vitro

  1. Le gène d'intérêt est cloné dans un T7 et / ou, par exemple sur la base promoteur SP6 plasmide. Pour obtenir RNC d'intérêt, C-terminale du polypeptide cible est étendu par adjonction séquence inducteur d'arrêt de SecM FXXXXWIXXXXGIRAGP 7. Afin d'assurer que le fragment polypeptide d'intérêt se extruder hors du tunnel ribosomique, la partie C-terminale de la protéine cible doit être augmentée d'au moins 30 acides aminés 12-14. Un flexible glycine-sérine lieur riche peut être introduite entre la protéine et la séquence d'arrêt SecM à éviter toutes contraintes possibles de conformation.
  2. Pour la transcription in vitro, l'ADN modèle doit être linéarisé par l'enzyme de restriction coupe en aval de l'ORF. Il faut vérifier linéarisation complète de l'ADN plasmidique en exécutant le produit de digestion de restriction à l'électrophorèse sur gel d'agarose.
  3. Le plasma linéariséIdentifiant est en outre utilisée dans la réaction de transcription in vitro. Concentration différente de la matrice ADN peuvent être testés pour déterminer la concentration d'ADN optimale requise pour la transcription in vitro. En général, avec Ambion Trousse MEGAscript à haut rendement de transcription (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY), 1 pg d'ADN linéarisé donne 40-60 ARNm pg. La transcription in vitro se fait suivant les instructions du fabricant (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY) .
  4. Après transcription in vitro, l'ARNm est purifié par précipitation au chlorure de lithium selon les instructions du fabricant (Ambion de MEGAscript Kit Haut de transcription rendement, Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY).
  5. l'intégrité ARNm est encore vérifiée par électrophorèse utilisant de l'acrylamide ou des gels d'agarose.

2. La traduction in vitro

Pour la traduction in vitro en utilisant le RTS 100 E. coli HY Kit (5 Premier, Gaithersburg, MD), suivez les étapes ci-dessous:

  1. Préparer 100 ul d'instruction dans le fabricant de réaction de traduction in vitro suivante. En bref, dans la nucléase l'eau libre ajouter 24 ul mélange d'acides aminés moins méthionine (1 mM), 10 unités d'inhibiteur de ribonucléase (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), 20 pCi de matières radioactives [35 S]-méthionine (MP Biomedicals, Solon, OH), 20 pl mélange réactionnel, 24 pl de tampon de reconstitution et 24 pi de E. coli lysat.
  2. Incuber la réaction à 30 ° C pendant 5 min à l'avance au chaud la réaction de traduction. Ajouter 1-2 ug d'ARNm de la réaction de traduction et incuber à 30 ° C pendant 10-15 min.
  3. Arrêter la réaction en plaçant la réaction de traduction sur la glace.

3. Isolement de polypeptide naissant de réaction de traduction in vitro

  1. Pour isoler RNC, la réaction de traduction est posée sur le dessus de 4,5 ml de gradient de saccharose 5-30% dans 20 mM HEPES-KOH pH 70,5, 15 mM MgCl 2, 100 mM d'acétate de potassium, DTT 1 mM et centrifugé à l'aide Beckman Coulter SW55-Ti rotor à 41000 rpm, 4 ° C pendant 2 heures.
  2. Après centrifugation, gradient de saccharose est fractionné pour isoler les différentes populations ribosomique et associés des chaînes naissantes. La séparation est contrôlée à l'aide de la CITP système programmable gradient de densité avec un enregistrement en continu à 254 nm en utilisant un détecteur de CITP UA-6 absorbance.
  3. La fraction (s) contenant des ribosomes 70S sont recueillies et analysées en outre en fonction du but de l'expérience.

4. Observation de la protéine liée à ribosome avec Tris-tricine SDS-PAGE

Pour vérifier si la protéine SecM prolongée reste attaché aux 70S du ribosome, fractions du gradient ont été collectées et traitées comme suit:

  1. La protéine dans chaque fraction a été précipité par addition d'acide trichloracétique (TCA) à une concentration finale de 10% et incubées à 4 ° C overniGHT.
  2. Après une nuit d'incubation, les échantillons ont été centrifugés à 14.000 X g pendant 15 min à la pastille de la protéine. Surnageant de centrifugation suivant a été éliminé et le culot lavé deux fois avec de l'acétone solution contenant: 1 mM de Tris-HCl pH 7,6 (4:1). Pellet était de l'air encore séché et dissous dans un tampon de chargement SDS-PAGE.
  3. L'échantillon traité a été résolu et analysé par Tris-tricine SDS-PAGE.
  4. Après l'électrophorèse, les gels ont été fixés, séché à l'aide de gel sous vide teinturier et soumis à une autoradiographie. La distribution des polypeptides naissants ont été observées à l'aide phosphoimaging.

5. Les résultats représentatifs

Nous présentons ici une expérience décrivant l'isolement de la pleine longueur bovine Gamma-B cristallin stable lié aux ribosomes 70S. La figure 1 illustre les étapes impliquées dans l'isolement de l'espèce bovine RNC cristallines Gamma-B. Le C-terminale de la Gamma-cristallin B a été prolongé d'ensemble de 32 acides aminés to s'assurer que les extrusions de protéines pleine longueur la sortie du tunnel du ribosome, ce qui inclut également la séquence SecM décrochage mis à la très extrémité C-terminale du polypeptide de fusion. Après la traduction in vitro, les ribosomes 70S ont été isolées par centrifugation sur gradient de saccharose (Figure 2.1). Afin de veiller à ce que la protéine reste stable lié au ribosome, les 70S contenant fractions ont été réunies, dessalée, un échange de tampon et soumis à une série supplémentaire de centrifugation en gradient de saccharose (Figure 2.2). Le résultat présenté dans la figure 2 montre clairement que SecM peut induire efficacement arrestation de translation des RNC cristallines Gamma-B.

Figure 1
Figure 1. Explication schématique des étapes impliquées dans l'isolement de RNC. C-terminale de bovins Gamma-B cristallin a été prolongée de 32 séquence d'acides aminés. Cette étendueC-terminales des régions inclut également la séquence d'arrêt SecM. Gamma-B cristallin avec une séquence SecM a été cloné dans PIVEX 2.3 (basé sur T7) plasmide. Pour la transcription in vitro de l'ADN modèle a été linéarisé par XbaI. Modèle linéarisé a en outre été utilisé pour la transcription in vitro. Le T7 dans la matrice d'ADN est reconnu par l'ARN polymérase T7 qui transcrit en aval gamma-B cristallin gène situées du promoteur T7. ARNm a été purifié en utilisant la méthode de précipitation au chlorure de lithium. L'ARNm purifié a ensuite été utilisé pour la traduction in vitro. Après l'incubation, la réaction de traduction a été superposé au-dessus de gradient de saccharose 5-30% et centrifugé dans Beckman Coulter SW55-Ti rotor à 41000 rpm, 4 ° C pendant 2 heures.

Figure 2
Figure 2. Isolement de bovins Gamma-B cristallin stable RNC liés au ribosome 70S. 1 ug d'ARNm a été mélangé dans 100 ul de réaction E. Système coli Extrait S30 tel que mentionné dans la section du protocole avec 20 pCi de [35 S]-méthionine et incubées à 30 ° C pendant 15 min. Après l'incubation, la réaction de traduction a été superposé au-dessus de gradient de saccharose 5-30% dans 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 15 mM MgCl 2, 100 mM d'acétate de potassium, DTT 1 mM et centrifugé dans Beckman Coulter SW55-Ti rotor à 41000 rpm, 4 ° C pendant 2 heures. Après la sédimentation de vitesse, le gradient a été déchargé et le ribosome pro le a été obtenu. Les données ont été enregistrées par le programme PeakTrak (gradient de densité CITP fractionnement dégradé système). Les fractions ont été recueillies, la protéine a été précipité TCA et résolu sur T 16,5%, 6% C Tris-Tricine PAGE gel à 15. Le gel a été séché et exposé pour autoradiographie. Après l'exposition du gel a été numérisé à l'aide du scanner Typhoon imagerie 9410. Figure 2.1 montre que sur toute la longueur Gamma-B cristallin est présent dans 70S du ribosome fractions. Ainsi, la séquence SecM décrochage permet l'isolement de l'écurie de l'espèce bovine RNC cristallines Gamma-B. Les données de la figure 2.2 indiquent clairement que les RNC isolés sont en effet stables. Dans l'expérience en cours des fractions 70S après première série de centrifugation en gradient de saccharose ont été regroupés et le saccharose a été éliminé à l'aide Amicon ultra-4 Unité de filtre centrifuge (Millipore), suivie par un tampon d'échange en solution contenant 20 mM de HEPES KOH pH 7,5, 15 mM MgCl 2, 100 mM acétate de potassium, DTT 1 mM. Cet échantillon a été ensuite soumis à une série supplémentaire de centrifugation à travers gradient de saccharose 5-30% et fractionnés. Chaque fraction a été traité et analysé comme dans la Figure 2.1.

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Discussion

Pour obtenir des résultats reproductibles, la qualité et la concentration des composants utilisés pour la transcription in vitro et la traduction sont essentielles. Nous avons utilisé commercialement disponibles dans la transcription in vitro et des extraits de la traduction et elles donnent des résultats efficaces et reproductibles, s'il est manipulé avec soin. Qualité de l'ARNm peut affecter la traduction, de sorte qu'il est d'une importance capitale pour tester l'intégrité de l'ARNm avant de l'utiliser pour la traduction in vitro. Le temps d'incubation de la traduction in vitro varie avec la longueur de la protéine. En outre, le temps / la vitesse de centrifugation peut être ajusté en conséquence, en cas, la fraction 70S du ribosome n'est pas bien réglée et séparée des 50S. En outre, ribosome complexes protéiques liés doivent être manipulés avec soin pour éviter la contamination de RNase. En outre, les conditions de tampon doivent être étroitement surveillés et des agents chélateurs qui pourraient chélatent Mg 2 + devrait être évitée.

Arrestation SecMséquence, sur sa traduction interagit avec les protéines ribosomales L4 et L22 ainsi que ARNr 23S dans le tunnel ribosomique 7,8. Un certain nombre de résidus critiques, constituant le motif d'arrestation SecM, F XXXX XXXX WI GIRAGP 7 (en caractères gras) sont d'une importance immense, en veillant à l'efficacité de l'arrestation de translation. Des mutations ou délétions de ces résidus critiques peuvent conduire à l'allégement de l'arrestation élongation de la traduction 7,8. Ainsi, le maintien de la séquence du motif d'arrestation SecM F XXXX XXXX WI GIRAGP 7 intacte est absolument essentielle pour s'assurer que la protéine à l'étude resterait stable lié au ribosome.

Cette technique peut être utilisée pour l'analyse de la structure de co-traductionnelles des intermédiaires et des co-traductionnelle de pliage de protéines différentes. Il a été récemment utilisée avec succès pour déterminer la structure exacte of plusieurs ribosomes reliés les chaînes naissantes avec l'aide de la RMN 10-11. En outre, cette technique peut également être utilisé pour générer des peptides naissants de tailles prédéterminées pour l'analyse de leurs interactions avec les protéines accessoires tertiaires, des cofacteurs ou des ligands.

Une approche alternative pour produire des complexes RNC impliquerait l'utilisation d'ARNm tronqués dépourvus codon stop. Cette approche a été largement utilisé par de nombreux chercheurs d'étudier le repliement des protéines co-traductionnelle voir, par exemple 12,16. Toutefois, il a un certain nombre d'inconvénients. Cette approche ne peut pas être utilisé in vivo et également problématique pour l'utilisation in vitro avec E. coli extraire en raison de la présence de E. coli du système qui assure la médiation ssrA ajout de la balise peptide C-terminal (AANDENYALAA) aux protéines traduites à partir des ARNm sans codons stop dans leur cadre, conduisant à leur dégradation 17. Par conséquent, dans le cas plus tard, on doit utiliser une reconstitution complètementsystème tituée et / ou un système, manque / supprimer ssrA-tagging machines. SECM-dirigé décrochage est efficace et unique, car il a été prouvé à produire l'impasse complexes ribosome in vivo et in vitro avec une efficacité à peu près semblable 18.

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Disclosures

Pas de conflits d'intérêt déclarés.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par Human Frontier Science Program de subvention RGP0024.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MEGAscript T7 High yield Transcription Kit Ambion AM1333
RTS 100 E.coli HY Kit 5 Prime 2401100
Ribonuclease Inhibitor Invitrogen 15518012
Trans [35S]-Label MP Biomedicals 0151006
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit Millipore UFC801008
Storage phosphor autoradiography GE Healthcare Typhoon 9410 variable mode imager
Density Gradient Fractionation Systems Teledyne Isco, Inc. ISCO Programmable Density Gradient System
Sucrose Gradient Centrifugation Beckman Coulter Optima L-90 K Preparative Ultracentrifuge

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References

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