זיקה טיהור של נגיף השפעת תסביכים Ribonucleoprotein של הכרומטין של תאים נגועים

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

נגיפי שפעת לשכפל גנום הרנ"א שלהם בשיתוף עם הכרומטין מארח תאים. כאן, אנו מציגים שיטה לטיהור שלמים מתחמי ribonucleoprotein ויראלי של הכרומטין של תאים נגועים. מטוהרים מתחמי ויראלי יכול להיות מנותח על ידי כתם הן המערבי תחל הרחבה של חלבון ותוכן RNA, בהתאמה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Chase, G. P., Schwemmle, M. Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells. J. Vis. Exp. (64), e4028, doi:10.3791/4028 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

כמו כל הווירוסים שלילי גדיל RNA, הגנום של נגיפי שפעת ארוז בצורה של מתחמי ribonucleoprotein נגיפיים (vRNP), שבו הגנום חד גדילי הוא encapsidated ידי nucleoprotein (NP), הקשורים עם מורכבות פולימראז trimeric המורכב של הרשות הפלסטינית, PB1 ו PB2 יחידות משנה. עם זאת, בניגוד לרוב וירוסים RNA, נגיפי שפעת לבצע סינתזה של רנ"א נגיפי בגרעין של תאים נגועים. מעניין לציין, סינתזה mRNA ויראלי עושה שימוש הסלולר מראש mRNAs כמו primers, והוא הוצע כי תהליך זה מתרחש על הכרומטין 1. יחסי הגומלין בין פולימראז ויראלי המארח RNA פולימראז II, כמו גם בין NP ו nucleosomes המארחות יש גם לאפיין 1,2.

לאחרונה, דור של נגיפי שפעת רקומביננטי קידוד אחד סטרפטוקוקוס-Tag התמזגו גנטית הסופית-C של למקטע PB2 של פולימראז ויראלי (rWSN-PB2-סטרפטוקוקוס 3) יש להיותen תיאר. אלה וירוסים רקומביננטי לאפשר טיהור PB2 המכילים קומפלקסים, כולל vRNPs, מן התאים הנגועים. כדי להשיג מטוהרים vRNPs, בתרביות תאים נגועים, ו vRNPs הם זיקה מטוהרים מן lysates שמקורם בתאים אלה. עם זאת, ההליכים תמוגה בשימוש עד כה התבססו על צעד אחד תמוגה חומרי ניקוי, אשר, למרות נוכחותם של nuclease כללי, פעמים רבות לחלץ הכרומטין החומר הנכנס רק לא יעיל.

עבודה ראשונית שלנו הראו כי חלק גדול vRNPs גרעיני לא הופקו במהלך תמוגה התא המסורתי, ולכן לא יכולה להיות זיקה מטוהרים. כדי להגביר את יעילות מיצוי, וכדי להפריד הכרומטין, חייב מן הלא הכרומטין הנכנס vRNPs גרעיני, התאמנו את פרוטוקול צעד חכם החילוץ subcellular שפעת הווירוסים נגוע תאים. בקצרה, הליך זה 1 מפריד הגרעינים מהתא ואז מוציא חלבונים גרעיניים מסיסים (שמכונה כאן חלק "nucleoplasmic").החומר הנותר גרעינית מסיס מתעכל אז עם Benzonase, נוקבים DNA / RNA nuclease, ואחריו שני צעדים תעשיית מלח: 1 משתמש 150 מ"מ NaCl (המכונה "ch150"), ואז NaCl 500 מ"מ ("ch500") (איור 1 ). מיצוי הפעולות הבאות מלח נבחרו בהתבסס על תצפיות שלנו 500 מ"מ NaCl היה מספיק כדי solubilize מעל 85% vRNPs גרעיני אך עדיין לאפשר המחייב של vRNPs מתוייגים למטריצה ​​את הזיקה.

לאחר חלוקה subcellular של תאים נגועים, אפשר vRNPs זיקה לטהר PB2-מתוייגים של חלק בנפרד ולנתח את החלבון שלהם ואת מרכיבי רנ"א באמצעות כתם המערבי והרחבה פריימר, בהתאמה. לאחרונה, השתמשנו בשיטה זו כדי לגלות בצורה מתחמי vRNP הייצוא במהלך נקודות המאוחרות לאחר ההדבקה על חלק הכרומטין חילוץ עם 500 mM NaCl (ch500) 3.

Protocol

תרשים זרימה סכימטי של פרוטוקול מוצג איור. 1, לוח ריאגנטים מוצגת להלן.

1. זיהום (16 - 24 ש)

  1. זרע את התאים הלה 5 150 מ"מ פלסטיק תרבות מנות תא בינוני שונה Dulbecco של הנשרים (DMEM) בגובה בינוני גלוקוז, כך שהם יגיעו כ 80% confluency למחרת (כ 5 x 10 8 תאים). חשוב כי התאים אינם מגיעים 100% confluency.
  2. למחרת, לדלל את סטרפטוקוקוס-מתויג וירוס השפעת לתוך המניה פוספט בופר סליין (PBS) המכיל 0.3% אלבומין בסרום שור (BSA) על ריבוי של זיהום של 3.
  3. הסר בינוני צמיחה מן התאים, לשטוף פעם אחת עם PBS, ולהוסיף 10 מ"ל PBS המכילים את הנגיף לתאים. דגירה של H 1 בטמפרטורת החדר.
  4. החלף את זיהום בינוני עם גלוקוז DMEM גבוהה, ולהמשיך הדגירה על 37 ° C.
"> משך הדגירה תלוי בשלב של זיהום להיחקר (ראה דיון).

2. ההיפוך חלוקה subcellular (3 שעות)

  1. לשטוף את התאים פעם מקור PBS ולאחר מכן להקפיא תאים PBS קר עם מגרד גומי העברת צינור חרוטי 50 מ"ל.
  2. תאים גלולה צנטריפוגות בטבלה העליונה של 5 דקות על סל"ד 1000 ולאחר מכן לשאוב PBS.
  3. Resuspend תא גלולה ב 10 חיץ סוכרוז קר מ"ל (10 mM HEPES pH 7.9, 10 mM KCl, 2 מ"ג mM אצטט (MgOAc), 3 מ"מ CaCl 2, סוכרוז 340 מ"מ, 1 mM dithiothreitol (DTT), 1% מעכב פרוטאז תערובת) . לאחר ההשעיה, עוברים התאים דרך עצה 200 μl פיפטה מחוברת פיפטה 10 מ"ל פלסטיק סרום לשבש גושים סלולריים.
  4. דגירה 10 דק 'על הקרח. בעדינות להפוך מדי פעם כדי resuspend תאים.
  5. הוסף Nonidet P-40 (NP-40) לריכוז סופי של 0.5% ו מערבולת במהירות גבוהה במשך 15 שניות. מיד סרכזת דקות 10 XG ב 3500 ב 4 ° C בטבלה העליונה centrifuGE.
  6. הסר supernatant וחנות ב 4 ° C. זהו חלק cytoplasmic. גלולה צריך להיות קטן יותר לבן מאשר גלולה התא המקורי. שברים כל יכול להיות מאוחסן במשך שעות לפחות 4 על 4 ° C.
  7. לשטוף גלולה ב 5 מ"ל חיץ קר סוכרוז צנטריפוגות מחדש, כמו בשלב 2.5 וזורקים supernatant.
  8. Resuspend גלולה (המכיל גרעינים) ב 1.5 מ"ל קר חיץ החילוץ nucleoplasmic (50 HEPES ה-pH 7.9 מ"מ, 150 מ"מ, 1.5 מ"מ KOAc MgCl 2, 0.1% NP-40, 1 mM DTT, 1% מעכב פרוטאז תערובת).
  9. העברה צונן, כל זכוכית 4 מ"ל Dounce homogenizer עם העלי צמודה ו homogenize גרעינים עם 20 חבטות.
    הימנע קצף במהלך homogenization. ההתנגדות צריכה להגדיל לאחר כ 10 משיכות. Homogenization יעיל ניתן לאשר תחת מיקרוסקופ לעומת שלב.
  10. העברת גרעין הומוגני כדי צינור 1.5 microcentrifuge מ"ל ו דגירה 20 דקות על גלגל מסתובב ב 4 °ג
  11. סרכזת על 16,000 X גרם microcentrifuge על 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
  12. הסר supernatant וחנות ב 4 ° C. זהו חלק nucleoplasmic.
  13. Resuspend גלולה במאגר 1.5 מ"ל העיכול (50 HEPES ה-pH 7.9 מ"מ, 10 mM NaCl, 1.5 מ"מ MgCl 2, 1 mM DTT, 1% מעכב פרוטאז לערבב, 100 יח' / מ"ל (Benzonase לניתוח RNA, תחליף עם 20 יח' / מ"ל RNase ללא DNase אני)) מראש לחמם 37 ° C, דגירה 10 דק 'ב 37 ° C.
  14. הוסף 42 μl של 5 M NaCl (ריכוז סופי של 150 מ"מ NaCl) ו דגירה 20 דקות נוספות ב 4 ° C.
  15. סרכזת על 16,000 X גרם microcentrifuge על 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
  16. הסר supernatant וחנות ב 4 ° C. זהו חלק ch150.
  17. Resuspend גלולה ב 1.5 חיץ מ"ל קר מלח גבוהה (50 mM HEPES pH 7.9, 500 מ"מ NaCl, 1.5 מ"מ MgCl 2, 0.1% NP-40, 1 mM DTT, 1% מעכב פרוטאז תערובת) ו דגירה 20 דק 'על הקרח.
  18. סרכזת על 16,000 X גרם </ Em> ב microcentrifuge על 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
  19. הסר supernatant וחנות ב 4 ° C. זהו חלק ch500.

3. סטרפטוקוקוס-תג טיהור (2 ח)

  1. הוסף 300 μl של 5 M NaCl לשבר cytoplasmic (ריכוז סופי של 150 מ"מ NaCl).
  2. 100 aliquot μl של חרוזים ארוזים סטרפטוקוקוס-Tactin Sepharose לכל שבריר של צינור מ"ל 15 חרוטי.
  3. הוסף 10 כרכים של חיץ לשטוף דלקת (20 mM HEPES pH 7.9, 150 מ"מ NaCl (500 mM NaCl עבור ch500 דגימות), 1 mM EDTA) על חרוזים, ללא מרחב גליל לערבב, ו סרכזת 5 דקות ב 1000 x גרם השולחן סרכזת.
  4. מחק supernatant, חזור על שלב 3.3 פעמיים ואז resuspend גלולה חרוז בנפח שווה של חיץ לשטוף דלקת.
  5. הוסף 200 μl של slurry שטוף חרוז סטרפטוקוקוס-Tactin לשבר כל אחד (ב -1.5 microcentrifuge צינורות מ"ל עבור nuceloplasmic, ch150 ו ch500 שברים ו צינור חרוטי 15 מ"ל לשבריר cytoplasmic).
  6. לסובבצינורות 1h ב 4 ° C על גלגל מסתובב.
  7. סרכזת צינורות 1 דקות ב 1000 x גרם ב 4 ° C. מחק supernatant.
  8. הוסף 1 מ"ל למאגר הקר לשטוף דלקת לצינור אחד. העברת החרוזים מהצינור 15 מ"ל (חלק cytoplasmic) לצינור 1.5 מ"ל. לשטוף את כל צינורות 1 דקות ב 4 ° C, צנטריפוגה אחרי כמו בשלב 3.7. חזור על פעולה זו פעמיים בכביסה.
  9. לאחר שלב הכביסה האחרונה, להסיר את כל עקבות של חיץ לשטוף באמצעות פיפטה קצה שטוח. הוסף 100 μl elution המאגר (מאגר דלקת רחצה המכיל 2.5 מ"מ desthiobiotin) ומערבבים בעדינות.
  10. דגירה 15 דק 'על הקרח. מערבבים מדי פעם בעדינות חרוזים ידי הקשה על החלק התחתון של הצינורות.
  11. צינורות צנטריפוגות 1 דקות ב 1000 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס microcentrifuge. איסוף supernatant eluted המכילים סטרפטוקוקוס-מתוייגים vRNPs.

4. נציג תוצאות

היעילות של חלוקה נשפט הטובה ביותר על ידי ניתוח כתם המערבי של lysates לבורסקאות באמצעות antibסמנים ספציפיים subcellular (איור 2) odies. באופן ספציפי, חלוקה subnuclear מוצלח צריך להראות מעט או ללא נייד RNA פולימראז II (POL II) nucleoplasmic, או חלק גרעינית מסיסים 4, ורוב צריך לחלץ מ"מ 150 NaCl 5. השפלה של Pol II הוא גם ציין reproducibly בתאים הנגועים בווירוס שפעת לעומת תאים נגוע, עולה בקנה אחד עם הספרות 6.

טיהור vRNPs נשפט הטובה ביותר על ידי כסף או מכתים Coomassie, כפי שמוצג על eluate cytoplasmic באיור. 3. מניסיוננו, רוב סטרפטוקוקוס-PB2 מטוהרים ב כחלק vRNP מלא בנוי, כלומר פולימראז מסיסים מעט הוא נתפס. הדבר בא לידי ביטוי NP גבוה: PA/PB1/PB2 יחס שנצפו על ידי כסף או מכתים Coomassie. יחס נמוך יותר מצביע על זיהום חיץ עם RNases, כמו בכל מקום RNases מספר (כגון RNase) ידועים רנ"א נגיפי לדבוק בצורה כזאת כמו dissociאכלו פולימראז מ NP multimers 7. מעניין לציין, כי הטיפול Benzonase בלבד, בעוד מספיק לעכל RNA ויראלי, נראה כי אין השפעה על יחסי stochiometric של חלבונים vRNP. למרות שאנחנו לא יכולים להסביר את התופעה, צפינו שיבוש vRNPs לאחר עיכול עם RNases אחרים (מידע לא מוצג), טוען כי Benzonase יכולים להשאיר מסוימים באזורים חשובים מבחינה מבנית רנ"א ללא פגע. לאחר טיהור vRNPs מן הציטופלסמה לבין nucleoplasm (שבוצעה ללא העיכול nuclease), 8 להקות קלוש אך דיסקרטית בכל המשקלים המולקולריים הגבוהים ניתן לראות על ידי צביעה כסף, אשר מתאימות את המשקולות מולקולריים החזויים של 8 קטעים הגנום שפעת (ראה השופט. 3 ).

הסכומים היחסיים של vRNPs מטוהרים מן חלק זה של זיהום H 9 בהודעה מוצגים בתרשים. 4. חלוקת vRNPs משתנה במהלך זיהום, עם הצטברות החזק ביותר בשבריר ch150 בנקודות זמן המוקדמות,הצטברות מוגברת nucleoplasm ו הציטופלסמה בנקודות זמן המאוחרות.

איור 1
1. תרשים זרימה תרשים של חלוקה subcellular. מעובד מתוך REF. 3.

איור 2
איור 2. ניתוח המערבי כתם של שברים subcellular משפעת הווירוסים נגוע תאים. 10 9 תאים הלה נדבקו WSN נגיף השפעת המתח על 9 שעות לפני חלוקה subcellular. כמויות שוות של חלבון הכולל הועמסו בנתיב זה ונותחו באמצעות נוגדנים המוצגים. RNA פולימראז II (POL II) זוהה באמצעות שיבוט 8WG16, אשר מכיר את כל צורות תחום בטרמינל C-(הלהקה hypophosphorylated הוא הבולט ביותר). מעובד מתוך REF. 3.

איור 3
איור 3.ניתוח כתם כסף מטוהרים vRNPs. תאים הלה נדבקו rWSN (כביקורת שלילית) או rWSN-PB2-דלקת של 9 שעות, ואחריו טיהור דלקת של חלק cytoplasmic. הכוכבית מציינת להקות שאינם גלויים לאחר עיכול RNase. מעובד מתוך REF. 3.

איור 4
איור 4. ניתוח כתם כסף של vRNPs מטוהרים מן שברים סלולריים שונים. 10 9 תאים הלה נדבקו rWSN-PB2, דלקת או rWSN עבור 9 שעות לאחר מכן חלוקה subcellular וטיהור דלקת. כמויות שוות של כל חלק מן eluate הועמסו. מעובד מתוך REF. 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעוד שמחקרים רבים זיהו לאחרונה חלבונים בודדים או רשתות הסלולר המעורבים זיהום בנגיף שפעת 8, משמעות תפקודית של רוב האינטראקציות הללו עדיין לא ברור. לאור התלות המוחלטת של הכרומטין מבוססי פונקציות עבור סינתזה שפעת RNA וירוס הטבע biophysical ו ביוכימיים מורכבים של גרעין 9, טכניקות חדשות יידרשו להבהיר את הפונקציות האלה. חלוקה subnuclear אנו מציגים כאן, יחד עם טיהור הזיקה של vRNPs, מאפשר אפיון של מפעלים חיוניים רנ"א נגיפי אשר היו נגישים קודם לכן.

פרוטוקולים רבים חלוקה subcellular תוארו בעבר בספרות. הבחנו כי רוב אלה השיטות המסורתיות לגרום דליפה מוקדמת של vRNPs מהגרעין, התופעה המתוארת גם Pol II 10. באמצעות דגירה קצרה של תאים טרום תפח עם C נמוךoncentration של חומר ניקוי חלש, NP-40, תמוגה יעילה הממברנה הפלסמטית התרחש ללא דליפה גרעינית משמעותית. מעניין לציין, כי ביצוע חלוקה subcellular שלנו באמצעות A549 ותאי HEK293T ולא התאים הלה הוביל דליפה גרעינית חזקה של vRNPs בשתי שורות תאים. הורדת ריכוז NP-40 ל% כ 0.2 הפחית את הבעיה, עם זאת, בשל השתנות כמה שורות תאים אלה, תנאים אופטימליים יש לקבוע באופן אמפירי. עוד altermative אפשרי הוא השימוש של שורות תאים לא אנושיים, שפעת וירוסים רגישים כגון תאים MDCK או Vero.

תעשיית מלח שלנו פרוטוקול שונה מסורתיים מיצוי הליכים הכרומטין אשר לעתים קרובות משתמשים ריכוזי מלח נמוכים ו / או גבוהים ריכוזי EDTA. פרוטוקול שלנו מפריד הכרומטין לשני שברים מסוימים, חלק II-high/histone-low פול והדדית שלה. עם זאת, שיטות אחרות החילוץ הכרומטין עשוי גם להיות תואם טיהור הזיקה של vRNתהלים. מאחר שרוב תהליכי מיצוי הכרומטין התמקדו אינטראקציות חלבון דנ"א לעומת אינטראקציות בין חלבונים, טכניקות חדשות נדרשים לחלץ בחוזקה הכרומטין הנכנס חלבון רב מתחמי 11.

באופן כללי, אורך של זיהום יש לקבוע באופן אמפירי בגלל וריאציות בין זני וירוסים שורות תאים. באמצעות מאמץ rWSN-PB2-דלקת ב משרד הפנים של 3, יש לנו לבצע חלוקה subcellular בנקודות זמן שונות בין 3 ל 10 שעות שלאחר זיהום. מניסיוננו, פחות מ 3 שעות של זיהום מניב vRNPs מטוהרים מעט מדי לניתוח שימושי כתם המערבי, תוך זיהום יותר מ -3 תוצאות ח בתוקף cytopathic חזק ערבוב הבאות של שברים.

היכולת לבודד ללא פגע בחוזקה הכרומטין הנכנס מתחמי ויראלי פותחת אפשרויות אחדות. בעוד אנו מנוצל וירוס רקומביננטי להביע סטרפטוקוקוס-מתויג PB2, תגי קרבה אחרים יכולים לשמש, כמו גם טראדimmunoprecipitation itional מיקוד חלבונים נגיפיים אחרים. יתר על כן, בזמן הניתוח שלנו של vRNPs הוגבלה אפיון של החלבון שלהם רכיבים RNA, מתחמי את מטוהרים יכול לשמש גם כדי לבצע תפקודי מבחני חוץ גופית סינתזה. לבסוף, הפרדת vRNPs למינים תפקודית גסות באמצעות חלוקה subnuclear עשוי גם לאפשר את המחקר קרוב של כמה פוסט של תרגום שינויים לאחרונה המתוארים של חלבונים נגיפיים הדרושים לסינתזה יעיל רנ"א נגיפי 12,13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגוד עניינים הצהיר.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות נדא Naffakh ומארי אן Rameix-Welti (מכון פסטר) על וירוס rWSN-PB2-סטרפטוקוקוס.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM-high glucose GIBCO, by Life Technologies 11965-092
BSA Sigma-Aldrich A9418
Protease inhibitor Mix G SERVA Electrophoresis 39101
Benzonase Nuclease Novagen, EMD Millipore 71206 25 U/μl
DNase I, RNase-free Thermo Fisher Scientific, Inc. EN0523 50 U/μl
Dounce homogenizer Wheaton 432-1271 Use type "B" pestle
Strep-Tactin Sepharose IBA GmbH 2-1201-025 50% suspension column format can also be used
Desthiobiotin IBA GmbH 2-1000-002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Engelhardt, O. G., Smith, M., Fodor, E. Association of the influenza A virus RNA-dependent RNA polymerase with cellular RNA polymerase II. J. Virol. 79, 5812-5812 (2005).
  2. Garcia-Robles, I., Akarsu, H., Müller, C. W., Ruigrok, R., Baudin, F. Interaction of influenza virus proteins with nucleosomes. Virology. 332, 329 (2005).
  3. Chase, G. P., Rameix-Welti, M. A., Zvirbilene, A., Zvirblis, G., Götz, V., Wolff, T., Naffakh, N., Schwemmle, M. Influenza virus ribonucleoprotein complexes gain preferential access to cellular export machinery through chromatin targeting. PLoS Pathogens. 7, e1002187 (2011).
  4. Kimura, H., Tao, Y., Roeder, R. G., Cook, P. R. Quantitation of RNA polymerase II and its transcription factors in an HeLa cell: little soluble holoenzyme but significant amounts of polymerases attached to the nuclear substructure. Mol. Cell. Biol. 19, 5383-5383 (1999).
  5. Henikoff, S., Henikoff, J. G., Sakai, A., Loeb, G. B., Ahmad, K. Genome-wide profiling of salt fractions maps physical properties of chromatin. Genome Res. 19, 460 (2009).
  6. Rodriguez, A., Perez-Gonzalez, A., Nieto, A. Influenza virus infection causes specific degradation of the largest subunit of cellular RNA polymerase II. J. Virol. 81, 5315-5315 (2007).
  7. Ye, Z., Liu, T., Offringa, D. P., McInnis, J., Levandowski, R. A. Association of influenza virus matrix protein with ribonucleoproteins. J. Virol. 73, 7467-7467 (1999).
  8. Watanabe, T., Watanabe, S., Kawaoka, T., Y, Cellular networks involved in the influenza virus life cycle. Cell Host Microbe. 7, 427 (2010).
  9. Engelhardt, O. G., Fodor, E. Functional association between viral and cellular transcription during influenza virus infection. Rev. Med. Virol. 16, 329-345 (2006).
  10. Schwartz, L. B., Sklar, V. E., Jaehning, J. A., Weinmann, R., Roeder, R. G. Isolation and partial characterization of the multiple forms of deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase in the mouse myeloma, MOPC 315. J. Biol. Chem. 249, 5889 (1974).
  11. Lambert, J. P., Baetz, K., Figeys, D. Of proteins and DNA--proteomic role in the field of chromatin research. Mol. Biosyst. 6, 30 (2010).
  12. Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus. J. Virol. 85, 6618 (2011).
  13. Liao, T. L., Wu, C. Y., Su, W. C., Jeng, K. S., Lai, M. M. Ubiquitination and deubiquitination of NP protein regulates influenza A virus RNA replication. EMBO J. 29, 3879 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics