从中枢神经系统转导细胞的慢病毒载体生产

Neuroscience

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Summary

在这个协议中,我们描述了慢病毒载体的生产,提纯和滴定。我们提供了一个在原代培养的神经元和神经胶质细胞的慢病毒载体介导的基因传递的例子。我们的方法也适用于其他类型的细胞

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Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System. J. Vis. Exp. (63), e4031, doi:10.3791/4031 (2012).

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Abstract

在中枢神经系统(CNS)的高效基因传递是非常重要的研究基因功能,神经系统疾病的建模和开发治疗方法。慢病毒载体在中枢神经系统的神经元和其他类型的细胞转导分裂和非分裂细胞,支持转基因的持续表达,因为他们转导有吸引力的工具,并有比较大的包装能力和毒性低1-3。慢病毒载体已成功地使用在4-6 体外转导许多神经细胞类型,并在动物7-10。

已作出很大努力,发展与改善生物安全和基因传递效率慢病毒载体。 图1描述了目前的第三代(SIN)的复制缺陷和自我失活慢病毒载体。分裂成四个质粒载体包装所需的要素。在慢病毒转FER质粒,在5'长末端重复序列(LTR)的U3区与另一种病毒的强启动子取代。这一修改,允许艾滋病毒艾滋病毒基因表达11,通常需要1 Tat蛋白的独立的向量序列的转录。包装信号(Ψ)包壳和牧师响应元素(RRE的)是必不可少的需要生产高滴度的载体。中央polypurine道(cPPT)是非常重要的载体DNA,核进口转导非分裂细胞12所必需的功能。在3'LTR的顺式调控序列被完全删除从U3的地区。删除复制后5'LTR的反转录,从而导致转录失活两公升。的质粒pMDLg / pRRE包含HIV-1基因,GAG / POL提供结构蛋白和逆转录酶。 PRSV-REV编码冯结合RRE的高效RNA从细胞核出口。 PCMV-Ğ编码水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G的)替换HIV-1病毒包膜。 VSV-G的扩展取向的载体,并允许通过超速13的浓度。所有的基因蛋白质编码的附件,包括VIF,VPR,VPU,和NEF被排除在包装系统。慢病毒载体的生产和操作应根据NIH的研究指引,涉及重组DNA( http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf )开展。使用慢病毒载体之前,可能需要从个别机构的生物和化学安全委员会批准。慢病毒载体转染293T细胞与慢病毒转移质粒和辅助质粒载体包装所需的蛋白质编码产生的。许多慢病毒转移质粒和辅助质粒可以得到来自Addgene,非非营利质粒库( http://www.addgene.org/~~V )。一些稳定的包装细胞系已发达,但这些系统提供了灵活性和他们的包装效率普遍下降14随着时间的推移,15。市售的转染试剂盒,可支持转16的高效率,但也可以是非常昂贵的大型载体制剂。磷酸钙沉淀法转染293T细胞,并提供高效,从而提供一个可靠的和慢病毒载体生产成本的有效途径。

在这个协议中,我们生产的由磷酸钙沉淀的原则,其次是超速20%的蔗糖垫与纯化,并通过浓度,根据质粒转染293T细胞的慢病毒载体。载体滴度测定荧光激活细胞分选(FACS)肛门ysis或通过实时定量PCR。在这个协议的慢病毒载体的生产和滴定法9天就可以完成。我们提供的这些载体转导到含有神经元和神经胶质细胞的小鼠皮层文化的例子。我们表明,慢病毒载体转导和细胞类型特定的中枢神经系统的原代培养细胞中的基因表达支持高效率。

Protocol

1。慢病毒载体的包装。

慢病毒载体慢病毒转移载体和磷酸钙转染法将293T细胞包装所需的其他质粒共转染的产生。我们使用此协议的10 100毫米组织培养皿。它可以放大或缩小的申请而定。在293T细胞线被维持在Dulbecco的改良老鹰培养基(DMEM培养基),高血糖(4500毫克/大号),辅以10%胎牛血清(FBS),100个单位/ ml青霉素,100微克/毫升在37℃链霉素与5% 二氧化碳培养箱。

  1. 种子293T细胞10 100毫米组织培养皿中的培养基(3×10 6细胞/皿)在30-40%汇合。返回的细胞培养箱。
  2. 20-24 h培养后,细胞密度检查。细胞在转染时约80%汇合。
  3. 准备一个50毫升管。添加4.4毫升TE79/10(TrisHCl 1毫米,0.1毫米EDTA,pH值7.9)减去以下的质粒DNA的总量。添加100微克慢病毒转移质粒( 图1),58微克pMDLg / pRRE,PCMV-G的31微克,25微克PRSV-REV,600μL2M 氯化钙 。轻轻混匀。
  4. 准备另一50毫升管。加入5毫升2个哈佛商学院(0.05 M羟乙基,0.28 M氯化钠,1.5毫米的Na 2 HPO 4,pH值7.12)。
  5. 以10毫升吸管的DNA- 氯化钙混合物,含有2个哈佛商学院,而涡旋管滴加管。
  6. 保持30分钟,在室温(RT)的沉淀反应。
  7. 从孵化器中删除的培养皿。由涡旋混合沉淀反应。悬浮液加入1毫升每100毫米的菜含有细胞。必须暂停增加缓慢,滴加,同时轻轻摇动菜中等。这些菜的孵化器和5小时离开。
  8. 从文化的媒介。加入6毫升的新鲜培养基中含有6毫米钠BUtyrate到每一道菜。返回文化的孵化器。过夜培养后,如果有记者在该构造的荧光,荧光显微镜下检查报告基因的表达。通常情况下,超过80%的细胞表达报告基因,如果它是由一个无处不在的启动子(如CMV启动子)驱动。
  9. 转染后两天(40-44小时),收集上清到2 50毫升管(每管约30毫升)从10道菜。冻结在-80°C冰箱上清液,或进入下一步骤。

2。浓缩和提纯的载体

  1. 离心收集新鲜或解冻900克(约2000转)上清为10 min,以除去上清液中的任何细胞碎片。
  2. 将60毫升的注射器SFCA注射器到0.2微米的过滤器。 50毫升管中的上清液转移到注射器。成polyallomer离心管过滤上清液。
  3. 以5毫升20%的蔗糖(在PBS配制),在5毫升吸管。插入吸管底部的离心管含有上清。载体上清下慢慢加入蔗糖溶液。从另一个管重复这些步骤上清。
  4. 11000 rpm和4°C的4小时贝克曼SW28摆动转子离心上清。
  5. 去除上清。每个离心管中加入150微升4%的乳糖(在PBS配制)。悬浮颗粒。
  6. 所有离心管1.5 ml管转移集中的载体。离开冰管15分钟。
  7. 吹打混合载体悬浮。在全速(约16000克),1分钟旋转离心。
  8. 将上清转移到一个新的1.5 ml管。最终样本分为20μL等份,并储存在-80°C冰箱。

3。滴定法向量

  1. 种子5×10 4/1毫升含10%胎牛血清的DMEM培养液培养基中12井板在HT1080细胞。
  2. 后overnigHT文化,指望从一个井细胞和取得的细胞数量。
  3. 请5倍系列稀释(1:5,1:25;和1:625; 1:125)与培养基集中的载体。加入我微升每个稀释载体单独井。可以复制的样本,以提高准确性。
  4. 在每口井含有载体,没有载体以及添加1μL4毫克/毫升凝聚胺(Hexadimethrine溴化物)。混合轻轻晃动板。返回孵化器为48小时。
  5. 从细胞培养井介质。洗PBS每口井。加入250μL1X细胞胰蛋白酶-EDTA溶液。当细胞被分离(3-5分钟),加入1毫升的培养基。吹打重悬细胞。将细胞悬液1.5毫升离心管。
  6. 在900Ğ离心6分钟。为荧光报告基因的载体(如GFP)的,则转到步骤3.7流式细胞仪分析。对于没有记者的载体,加强实时定量PCR 3.8。
  7. 对于1荧光载体rescent记者基因,去除上清和300微升3.7%,甲醛的PBS重悬沉淀。流式细胞仪分析,确定记者阳性细胞百分比。将代表滴度为每毫升浓缩载体转导单位(TU /毫升)。

式(1)

例如,如果1×10 5细胞与1/25μL(微升0.04)向量和30%的细胞转导记者阳性,滴度会是:

公式(2)

只能用稀释的阳性细胞百分比和载体的添加量计算滴度之间的线性关系下降。最终滴度应该是一个至少2不同数额的载体转导获得的平均滴度。

  1. 对于没有向量荧光报告基因,基因组DNA提取HT1080细胞采用QIAamp DNA Mini试剂盒(QIAGEN)根据制造商的协议。放大载体在基因组DNA序列,用引物(HIV-1 PBS / PSI地区17)5'-CCGTTGTCAGGCAACGTG-3'和5'-AGCTGACAGGTGGTGGCAAT 3 ABI PRISM 7000序列检测系统(Applied Biosystems公司),TaqMan探针5 '-FAM-AGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGC:TAMRA-3'。白蛋白基因,是基因组中单拷贝基因(2拷贝/细胞)也扩增引物5'-TGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTT-3'5'-CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT的3',探针5'-FAM-TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA:TAMRA-3 “作为内部控制。确定在96孔板载体的副本数和白蛋白的PCR按以下程序的制造的指令:50℃2分钟,95°Ç10分钟,和35 95周期°Ç15秒和60°C为2分钟。十倍连续稀释已知浓度的质粒(副本代表数),其中包含的模板序列,也应放大到创建一个未知样品的定量标准曲线。将滴度为每毫升浓缩载体(国际单位/毫升)的集成单位代表。

公式(3)

4。转导的皮层文化

鼠标使用一个两步电镀过程,如先前所述18皮质含有皮层神经元和神经胶质细胞的培养准备。在妊娠14-16天从小鼠胚胎中获得的neocortices到先前建立的胶质细胞在MEM 10%胎牛血清,20毫米的葡萄糖和24孔培养板2mM谷氨酰胺的补充单层镀。

  1. 在体外经过5天,添加10μM的,胞嘧啶neoc阿糖胞苷(阿糖胞苷)ortical文化,以抑制非神经细胞的分裂。继续培养2天的细胞。
  2. 温暖的培养基在37℃的水浴5-10分钟。更换阿糖胞苷含新鲜培养液(500μL/孔)介质。
  3. 添加所需的教学语言(多重感染的靶细胞的数量比矢量粒子的数目)的文化载体。继续培养24 h。我们使用1-10 MOI(通常为5)在初级皮层文化。
  4. 更换新鲜培养基培养基。继续培养。如果有记者在矢量结构基因,检查细胞,荧光显微镜后第2天转下。报告基因的表达将是可见的神经元2-7转后,取决于载体的设计和使用剂量。

5。代表结果

与本协议范围内产生的慢病毒载体的滴度10 8 -10 10国际单位/毫升,which是适合的多种类型的细胞在体外体内的中枢神经系统传导。 表1图2展示了具有代表性的结果,使用该协议所产生的载体。我们转 小鼠皮层文化表达慢病毒载体的绿色荧光蛋白(GFP)由突触素(SYN)的发起人或胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子控制。七天后转,我们进行标签神经元和神经胶质细胞免疫与抗NeuN染色和抗GFAP抗体,分别。 表1所示。 2A后,转导与账面突触启动,超过90%的神经元(NeuN染色+细胞)的向量表达GFP并没有星形胶质细胞GFAP(+细胞)记者基因表达。当GFAP启动子用于向量构造( 图2B),约80%的星形胶质细胞GFAP(+细胞)表达小号绿色荧光蛋白;所有GFP +细胞是共存与GFAP和GFP表达NeuN染色标记的细胞在没有证实的星形胶质细胞。这些结果表明,慢病毒载体是非常有效的提供从中枢神经系统的细胞和细胞特异性基因表达的转基因时,使用适当的发起人是可以实现的。

图1
图1。艾滋病毒的慢病毒载体和包装质粒示意图表示。HIV-1病毒DNA显示在顶部。分为四个不同的质粒为载体生产的元素。慢病毒转移质粒包含混合5'LTR的U3区的巨细胞病毒(CMV)启动子,包装信号(ψ),RRE的序列,中央polypurine的道(cPPT)的,感兴趣的基因(如更换荧光记者)随着选择的发起人,和3'的LTR在其中的顺式调控序列是完全删除从U3的地区。 pMDLg,/ pRRE包含HIV-1的GAG和POL基因和CMV启动子控制下的RRE的序列。 PRSV-REV包含编码序列,由RSV启动子驱动的牧师。 PCMV-G包含CMV启动子的控制下,VSV-G蛋白基因。 PA表示,从人β-珠蛋白基因的加尾信号。

图2
图2。记者在小鼠皮层混合培养基因表达的转携带的细胞类型特异性启动子的慢病毒载体的文化与LV - SYN-GFP(一)或(b)在5 MOI的LV-GFAP的GFP载体转。七天后转导,细胞免疫组化染色与抗NeuN染色或抗GFAP抗体。上游面板显示GFP荧光,中间面板显示免疫组化和较低的面板合并图像(GFP:绿色; NeuN染色或GFAP:红色)。 向量 绿色荧光蛋白+细胞在神经元 在星形胶质细胞的GFP + LV - SYN-GFP 92.2±7.3 0 LV-GFAP的,GFP 0 78.3±11.5

表1比较在小鼠皮层文化的表达GFP的转用慢病毒载体携带不同的促销员。
小鼠皮层文化(5×10 5/24孔板)与LV - SYN-GFP或LV-GFAP的绿色荧光蛋白转导MOI 5。七天后转固定,文化和NeuN染色或GFAP免疫组化染色。 GFP和NeuN染色/ GFAP表达细胞的数量被计算在实验条件下10个领域的图像。值代表神经元的比例(NeuN染色+细胞)星形胶质细胞GFAP(+细胞),也表达了GFP报告基因。显示的值是平均值±SD由三个独立的实验。

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Discussion

在这个协议中,我们已经证明,生产慢病毒载体和应用皮层文化载体。我们证明了这些方法所产生的向量与效率和细胞类型特异性的转导。当突触启动,GFP的表达是严格神经元特异性。当使用GFAP启动子,GFP的表达完全是在星形胶质细胞。如果没有细胞类型特异性表达是必需的,一个无处不在的启动也可使用。我们发现两个ubiqutin和磷酸激酶(PGK)发起人可以驱动6皮层文化高水平的基因表达。可定制驱动慢病毒载体的基因表达表达或细胞类型的具体水平由发起人的选择(例如,无处不在的或特定类型的细胞)或通过使用不同的包膜蛋白或载体伪类型,针对特定的组织或应用。例如,狂犬病G蛋白或VSV-G的融合与pseudotypingð狂犬病蛋白支持逆行轴突运输19,20。瞬时转染协议允许不同的包膜蛋白载体的包装。

慢病毒载体通常集中由超速未经纯化步骤。这些不纯的载体是适用于多种细胞类型。然而,主要的神经细胞是敏感生产的细胞中的污染物,造成一批批的细胞毒作用的变化。 20%的蔗糖垫净化步骤使得向量始终在初级神经元无毒。我们建议使用纯化的载体主要神经传导和注射到动物。如果规模较大或载体制剂的纯度较高的要求,其他的净化技术,如亲和层析和阴离子交换膜色谱22,也可使用。由于长期的传导一般需要在初级神经细胞特别小心,应采取在编制载体,以尽量减少污染。通过0.2微米的过滤器载体上清和高压灭菌polyallomer离心管过程中使用的载体浓度会达到这个目的。瓶顶过滤器可以使用,如果需要过滤大量的上清。丁酸钠已报告的刺激活动的发起人23。生产者细胞转染后培养基中添加丁酸钠可以提高载体滴度10倍以上24。凝聚胺(hexadimethrine溴)已被广泛用于基因转移协议,以中和负电荷增加逆转录病毒基因转移的效率,从而促进载体细胞相互作用25。在我们的手中,凝聚胺是有毒的神经元在大脑皮层的文化。因此,聚凝胺,应避免在转导的主要神经细胞。如果有在载体的荧光记者,这是方便FACS分析来确定载体滴度。如果没有记者或组织特异性启动子,定量PCR检测靶细胞的载体整合推动了记者的基因应该是一个更好的选择,转基因表达载体的整合是独立。流式细胞仪分析确定的具体载体滴度将低于qPCR的,不是所有集成的载体的副本的功能。载体滴度也可以决定通过测量ELESA或载体的基因组RNA定量RT-PCR的艾滋病毒P24蛋白载体制剂。然而,这些方法是不准确由于相当数量难免在包装过程和功能的颗粒,没有成功转导靶细胞26产生缺陷病毒颗粒。本协议所作出的载体已成功地在体外体内,在RO凹痕大脑27。调查人员应单独测试他们的系统,作为载体介导的基因表达不一定是在细胞培养和体内系统,即使在相同的细胞类型6,28相同。慢病毒载体已被广泛用于过度或击倒在中枢神经系统中的各种细胞类型的基因利益。我们的协议应有助于为神经科学的研究者在他们的研究应用发展慢病毒载体。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

这项工作是由国家卫生研究院神经科学蓝图的核心赠款(P29 NS057105,BJS)的计划项目资助NS032636(BJS)的华盛顿大学和神经系统疾病的希望中心的​​支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Sigma-Aldrich D5796
MEM Invitrogen 11090-081
Fetal bovine serum Hyclone SV3001403
PBS Mediatech, Inc. 21-040-CM
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T3924
Sodium butyrate Sigma-Aldrich B5887
Hexadimethrine bromide (Polybrene) Sigma-Aldrich H9268
293T cells ATCC CRL-11268
HT1080 cells ATCC CCL-121
Falcon 100 x 20 mm tissue culture dish BD Biosciences 353003
1 x 3 ½ in polyallom–r centrifuge tube Beckman Coulter Inc. 326823
0.2-micron syringe filter Corning 431219
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen 51304

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References

  1. Naldini, L. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
  2. Zufferey, R. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J. Virol. 72, 9873-9880 (1998).
  3. Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 4, 353-364 (2003).
  4. Gascon, S., Paez-Gomez, J. A., Diaz-Guerra, M., Scheiffele, P., Scholl, F. G. Dual-promoter lentiviral vectors for constitutive and regulated gene expression in neurons. J. Neurosci. Methods. 168, 104-1012 (2008).
  5. Hioki, H. Efficient gene transduction of neurons by lentivirus with enhanced neuron-specific promoters. Gene Ther. 14, 872-882 (2007).
  6. Li, M. Optimal promoter usage for lentiviral vector-mediated transduction of cultured central nervous system cells. J. Neurosci. Methods. 189, 56-64 (2010).
  7. Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D., Verma, I. M. Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11382-11388 (1996).
  8. Blomer, U. Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector. J. Virol. 71, 6641-6649 (1997).
  9. Consiglio, A. Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14835-14840 (2004).
  10. Jakobsson, J., Ericson, C., Jansson, M., Bjork, E., Lundberg, C. Targeted transgene expression in rat brain using lentiviral vectors. J. Neurosci. Res. 73, 876-885 (2003).
  11. Arya, S. K., Guo, C., Josephs, S. F., Wong-Staal, F. Trans-activator gene of human T-lymphotropic virus type III (HTLV-III). Science. 229, 69-73 (1985).
  12. Sirven, A. The human immunodeficiency virus type-1 central DNA flap is a crucial determinant for lentiviral vector nuclear import and gene transduction of human hematopoietic stem cells. Blood. 96, 4103-4110 (2000).
  13. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8033-8037 (1993).
  14. Farson, D. A new-generation stable inducible packaging cell line for lentiviral vectors. Hum. Gene Ther. 12, 981-997 (2001).
  15. Broussau, S. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Mol. Ther. 16, 500-507 (2008).
  16. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J. Vis. Exp. (32), e1499 (2009).
  17. Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods. Gene Ther. 9, 1155-1162 (2002).
  18. Snider, B. J., Lobner, D., Yamada, K. A., Choi, D. W. Conditioning heat stress reduces excitotoxic and apoptotic components of oxygen-glucose deprivation-induced neuronal death in vitro. J. Neurochem. 70, 120-129 (1998).
  19. Mazarakis, N. D. Rabies virus glycoprotein pseudotyping of lentiviral vectors enables retrograde axonal transport and access to the nervous system after peripheral delivery. Hum. Mol. Genet. 10, 2109-2121 (2001).
  20. Kato, S. Neuron-specific gene transfer through retrograde transport of lentiviral vector pseudotyped with a novel type of fusion envelope glycoprotein. Hum. Gene Ther. 22, 1511-1523 (2011).
  21. Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. New protocol for lentiviral vector mass production. Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).
  22. Kutner, R. H., Puthli, S., Marino, M. P., Reiser, J. Simplified production and concentration of HIV-1-based lentiviral vectors using HYPERFlask vessels and anion exchange membrane chromatography. BMC Biotechnol. 9, 10 (2009).
  23. Laughlin, M. A., Chang, G. Y., Oakes, J. W., Gonzalez-Scarano, F., Pomerantz, R. J. Sodium butyrate stimulation of HIV-1 gene expression: a novel mechanism of induction independent of NF-kappa B. J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol. 9, 332-339 (1995).
  24. Gasmi, M. Requirements for efficient production and transduction of human immunodeficiency virus type 1-based vectors. J. Virol. 73, 1828-1834 (1999).
  25. Palsson, B., Andreadis, S. The physico-chemical factors that govern retrovirus-mediated gene transfer. Exp. Hematol. 25, 94-102 (1997).
  26. Lizee, G. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression. Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).
  27. Lee, J. K., Chung, J., McAlpine, F. E., Tansey, M. G. Regulator of G-Protein Signaling-10 Negatively Regulates NF-{kappa}B in Microglia and Neuroprotects Dopaminergic Neurons in Hemiparkinsonian Rats. J. Neurosci. 31, 11879-11888 (2011).
  28. Shevtsova, Z., Malik, J. M., Michel, U., Bahr, M., Kugler, S. Promoters and serotypes: targeting of adeno-associated virus vectors for gene transfer in the rat central nervous system in vitro and in vivo. Exp. Physiol. 90, 53-59 (2005).

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