Трансплантация панкреатических островков в почку капсулой мышей с диабетом

Published 10/31/2007
12 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Наш протокол был разработан для чисто и легко доставить островков или клеток под капсулу почки мышей. Клетки сосредоточены в гранулы в финале трубы используются для пересадки клеток под почечную капсулу. Простота этой техники уменьшает стресс на клетки и мыши.

Cite this Article

Copy Citation

Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (9), e404, doi:10.3791/404 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Наш протокол был разработан для чисто и легко доставить островков или клеток под почечную капсулу с диабетом или нормальных мышей. Мы обнаружили, что легче было сосредоточиться островков или клеток в гранулы в финале трубы доставки (PE50), используемых для трансплантации клеток под почечную капсулу. Эта технология обеспечивает скорость и легкость при одновременном снижении каких-либо необоснованных стресса клеток или мыши.

Загрузка: Установившаяся, собирается вручную, островков или гранулированные клетки тщательно атмосферный со дна 1,5 мл микроцентрифужных трубки использованием P200 pipetteman и прямо, тонкостенных пипетки. Длина трубы PE50 прилагается к пипетки с помощью небольшого адаптера трубки силикона. Клетки разрешено поселиться в наконечнике, а затем передаются на PE50 трубки медленным набора pipetteman. Как только клетки ближе к концу PE50 труб, излом сделано и силиконовые трубки адаптера находится над изломом. PE50 трубка передается 15 мл коническую содержащие сократить 5 мл пипетки и PE50 трубы выявляется через борт 5 мл пипетки для предотвращения скручивания во время центрифугирования. Клетки позволило достичь 1000 оборотов в минуту и ​​остановился.

Пересадка: Получатель мышей под наркозом, побрился, и чистить. Небольшой надрез на левом фланге мыши и почки подвергаются. Почек, жир и ткани влажной с физиологическим раствором тампоном. Дистального конца PE50 прилагается на диске шприц винтом Гамильтон, содержащие кончика пипетки, с помощью трубки силиконовые адаптера. Небольшой ник делается на правую сторону фланга почек, не слишком большим, ни слишком глубоко. Скошенный конец PE50 труб, ближайшей клетки, осторожно помещают под капсулой, труба двигался осторожно, чтобы освободить место в то время как моечные физиологического раствора, сухих капсула может порваться легко. Небольшой пузырек воздуха поставляется под капсулу медленно набора дисков шприц винт. Островки затем медленно доставляются за воздушный пузырь. Как только островки были доставлены почек гомеостаз поддерживается и безделушки является обезболивающий укол с малым тепловыделением. Почка помещается обратно в полости и брюшину и кожа зашивается и сшиваются. Мыши сразу получавших Flunixin и бупренорфин кв и помещен в клетку на грелку.

Protocol

Подготовка островков для трансплантации (Tx)

  1. Под инвертированного микроскопа, самостоятельно выбрать островков использованием P200 pipetman и прямой наконечник пипетки из культурных островков в 100 мм пластины.
  2. Граф островков 100 по времени и передаче в каждую микроцентрифужных трубки (~ 500 островков / трубку / мышь).
  3. Разрешить островков осели на дно микроцентрифужных труб.
  4. Нарисуйте один островок гранул в P200 pipetman (устанавливается на 130ul) с использованием прямой тонкостенной пипетки чаевые.
  5. Место адаптер силиконовые трубки на шприц наконечник. Вставьте длина PE50 трубку в силиконовых адаптеров.
  6. Повесьте pipetman в сторону капота и ленты PE50 трубки к капоту стену выше, чем островки в наконечник. Это позволит островков урегулировать только на кончике пипетки.
  7. Передача островков в PE50 трубки медленным набора pipetman и движущихся островков в PE50 трубку, стараясь не высылать островки с конца.
  8. Сделать излом скошенными конце PE50 труб. Сохраняя излом, отсоединить трубки силиконовые адаптер от pipetman и безопасной излом с силиконовой адаптера.
  9. Место островков, в PE50 труб, изломами силиконовых адаптеров трубы вниз, в 15 мл коническую с разрезом 5 мл пипетки и ленты PE50 трубку за борт 5 мл пипетки для предотвращения свертывания PE50 трубы в то время как центрифугирования.
  10. Центрифуга PE50/15mL conicals до 1000 оборотов в минуту и ​​выключить центрифуги. (Никогда не готовиться более 10 препаратов островок в одно время).
  11. Место трубки на льду.

Подготовка мыши для трансплантации

  1. Обезболить мышей с isofluorane или кетамин / Xylexene (см. подготовке протокола).
  2. После анестезии принял аффекта, бриться левый фланг мыши.
  3. Тампон кожи мыши, центр-выход, с повидон йод тампоном, а затем протрите тампоном этанола.
  4. Найдите левой почки (так же, право селезенки). Сделайте небольшой надрез в коже, выставляя брюшины.
  5. Сделайте небольшой надрез в брюшной полости подвергая почки. Хранение небольшого разреза поможет в сохранении почек поднял и экспозиции.
  6. Применить небольшое давление на обе стороны разреза, поднять или поп почек из мыши.
  7. Держите почек влажной путем применения физиологического раствора ватным тампоном наконечником.
  8. Использование шприц 23 или 25 иглу, сделайте небольшую царапину на правом фланге почки, создавая ник в почечную капсулу, не слишком глубоко или слишком большим.

Трансплантация островков

Примечание: Во время мыши готовится к Tx, второй человек должен подготовить Гамильтон винтовой привод островок трансплантации шприц.

  1. Медленно снимите трубку силиконовые адаптер от PE50 трубки, сохраняя при этом излом труб.
  2. Место противоположном конце PE50 трубку в трубку силиконовых адаптеров и положите трубку силиконовых адаптеров на кончике пипетки при "винт-диск" стеклянный шприц Гамильтон. Медленно отпустите излом PE50 труб, убедившись, что острова не просочиться.
  3. Advance островков медленно, чтобы кончик трубки PE50 использовании "винт" механизм, но имейте небольшой пузырек воздуха в передней части островков в PE50 труб.
  4. Into ник, сделанные в почках, аккуратно вставьте PE50 трубы под капсулой, сделав небольшой карман. Будьте очень осторожны, чтобы не обманывать почек или прокалывание через капсулу.
  5. Это помогает держать области и капсулу влажный с физиологическим раствором, гентамицин пропитанной хлопка наконечником тампоном; сухие капсулы порвется легко.
  6. Аккуратно переместите трубы во всех направлениях, создавая "карман" для пересаженных островков для отдыха. Не забудьте повторно дополнительные физиологического раствора, чтобы сохранить область влажной.
  7. Под руководством человека, который открыл мыши и кто разместил PE50 трубы под почечную капсулу, второй человек, который подготовил мыши и Гамильтон пересадки шприц, будет медленно продвигаться островков под капсулу, внутри «карман», за небольшой пузырек воздуха выступил PE50 трубы, пока все островки пересаживают.
  8. Медленно снимите трубку PE50, сухой области с сухим тампоном и тщательно прижигать ника с малым тепловыделением.
  9. Использование сухих хлопка наконечником тампон, убедитесь, что все остановки кровотечения. Как только кровотечение остановилось, снова смочите почек стерильным физиологическим раствором и аккуратно заменить почки в брюшной полости до закрытия мышь с швом и кожи скоб.

Закрытие / Возрождение мышь

  1. Закрыть брюшины с использованием работы стежка 5-0 швов шелка W / C-6 19-мм иглой.
  2. Использование щипцов привлечь обе стороны от разреза кожи вместе.
  3. Сшивания кожи вместе с 2 или 3 скобы.
  4. Очистите кожу мыши любой крови, с помощью ватного тампона и наконечником Салинe.
  5. Сразу же лечить мышь с подкожного введения Flunixin и бупренорфин.
  6. Место мыши в клетке, который помещен на грелку или ниже нагрева лампы, пока мышь полностью активны.
  7. Снимите кожу скобы через 2 недели.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол обеспечивает практичный и эффективный вариант для чисто и легко доставки островков или клеток под почечную капсулу с диабетом или нормальных мышей. Техника концентрации и гранулирования островков или клеток в окончательном трубы доставки (PE50), используемых для трансплантации клеток под почечную капсулу предлагает простой и эффективный метод пересадки клеток при уменьшении любого излишнего напряжения на клетки или мыши.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

UCSF Центра Диабета. NIH UCSF DERC Островок Core. JDRF. LifeScan ООО Джонсон & Джонсон компании.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical gloves Fisher Scientific 11-394-95(sz)
Surgical scrub sponges Moore Medical 42940AK
Forceps Miltex Inc. 6-114 and 6-26 2 with teeth, 2 straight
Dissecting scissors n=2 Miltex Inc. 5-290
Oster razor (sz. 40 blade) Fisher Scientific 01-305-10B
4x4 Sterile gauze pads Moore Medical 08252AK
Povidone Iodine pads Moore Medical 08486AK
Alcohol pads Fisher Scientific 14-819-2
Heating pad Moore Medical 42508AK
23G or 25G needles 1" long
Cidex solution Moore Medical 07535AK for cleaning/santizing instruments
PE50 polyethylene tubing BD Biosciences 427411 PE50, 0.965mm O.D. x 0.58mm I.D.
Cidex + 28 day soln Moore Medical 35625AK
Silicone tubing Spectrum Chromat. 123732 5/32”OD x 1/32” ID
Instrument sterilizing container Moore Medical 39074AK
Straight Pipet Tips USA Scientific, Inc. 1111-0810 sterile
Glass syringe w/screw-drive Hamilton Co 1001
Cauterizing tool Roboz Surgical Instruments Co. RS230
Needle Holder Moore Medical 41-067
5-0 silk LOOK Surgical 754B for suture (6-C)
Cotton tipped swab Moore Medical
9mm autoclip stapler BD Biosciences 7630
9mm staples BD Biosciences 7631
9mm staple remover BD Biosciences 7637

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
  2. Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A. Inability to induce tolerance through direct antigen presentation. Am J Transplant. 2, 510-519 (2002).
  3. Lenschow, D. J., Zeng, Y., Hathcock, K. S., Zuckerman, L. A., Freeman, G., Thistlethwaite, J. R., Gray, G. S., Hodes, R. J., Bluestone, J. A. Inhibition of transplant rejection following treatment with anti-B7-2 and anti-B7-1 antibodies. Transplantation. Transplantation. 60, 1171-1178 (1995).
  4. Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G., Linsley, P. S., Bluestone, J. A. Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4lg. Science. 257, 789-792 (1992).

Comments

12 Comments

  1. Could you tell me which  type of Hamilton screw drive syringe be used?  Hamilton  Precision Syringe Pump PSD-² or PSD-3 or somethingelse?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 25, 2008 - 5:21 AM
  2. We use the Hamilton #1001 syringe catalog# 81341.  Its a threaded plunger syringe that includes a screw drive plunger; $²59. Website: http://www.hamiltoncompany.com/syringes/syringesLS-Threaded.asp We then cut the back-end of a pipet tip to fit on the leur tip of the syringe.  This allows for the attachment of the silicone adaptor tubing to attach to the syringe and move your pellet of cells through the PE50 polyethylene tubing from Becton Dickenson #4²741.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 25, 2008 - 12:18 PM
  3. Hi Dear, the kidney is located retroperitoneally, that means if you have chosen approach from backside, there is not any peritoneum to be cut and sutured.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 20, 2008 - 3:46 AM
  4. I see smart people

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 20, 2008 - 1:13 PM
  5. Could you tell me what type of silicone adaptor tubing is used when it is attached to pipet tip? Is it commercially available?  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 27, 2008 - 2:45 AM
  6. Hello, I can't seem to find the Syringe with the screw-drive on the Hamilton website, dŒs anybody have anymore information on this item? Thank you so much!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 9, 2009 - 9:12 PM
  7. Hello! Thank you for this wonderfull and very instructive video! I was wondering if it is possible to save the video on a harddrive! If yes could you tell me how to do it Thank you a lot in advance   Evrim Jaccard PhD student  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 26, 2009 - 12:42 PM
  8. Hello Evrim, Why don't you shoot me an email at nikitab@jove.com and we'll see what we can do. Cheers, Nikita

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 2:19 AM
  9. Hi Dr. Szot, Thank you for posting a very helpful video demonstrating islet transplant.  What do you think of isolating islet cells and culturing them overnight before transplantation the next day?  If you think this possible, do you recommend any particular culturing conditions (medium, temp, etc)? Thank you in advance, Omar

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 13, 2009 - 6:43 PM
  10. Thanks for sharing the impressive video.
    Would you like to tell me, in your experience, how long did the mice maintain their euglycemia status after receiving transplantation?

    Reply
    Posted by: Ruei-Ren W.
    July 16, 2009 - 4:52 AM
  11. Excellent work to teach the people how to do the surgery

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 5, 2009 - 1:23 PM
  12. Dear Librarian,
    I would like to request access to JoVE because I am a young scientist and study the problem of diabetes. Your help will be invaluable to me.
    Alibek Mereke
    Department of surgery, Kazakh National Medical university, Almaty

    Reply
    Posted by: Alibek M.
    January 9, 2012 - 9:50 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats