Transplantation av pankreasöarna in i njuren Capsule av diabetiska möss

Published 10/31/2007
12 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Vår protokoll har utvecklats för att rent och enkelt leverera holmar eller celler i njuren kapsel möss. Celler är koncentrerade till pellets i den slutliga slangar som används för omplantering cellerna i njuren kapsel. Enkelheten i denna teknik minskar stressen till cellerna och musen.

Cite this Article

Copy Citation

Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (9), e404, doi:10.3791/404 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Vår protokoll har utvecklats för att rent och enkelt leverera holmar eller celler i njuren kapsel diabetiker eller normala möss. Vi fann att det var lättare att koncentrera insulinproducerande celler eller till pellets i den slutliga leveransen slangen (PE50) används för att transplantera celler i njuren kapsel. Denna teknik ger både snabbt och enkelt samtidigt som all onödig stress på cellerna eller till musen.

Laddar: Fast, plockade handen, holmar eller pelleterat celler noggrant aspirerade från botten av en 1,5 ml mikrocentrifugrör med en P200 pipetteman och en rak, tunnväggigt pipettspetsen. En längd på PE50 slangen är fäst vid pipettspetsen med en liten slang silikon adapter. Celler har rätt att bosätta sig i spetsen, och sedan överförs till PE50 slangen genom att långsamt slå pipetteman. När cellerna är nära slutet av PE50 rör, är en knut göras och silikon adaptern slangen placeras över knut. Den PE50 slangen förs över till en 15 ml E innehåller ett snitt 5 ml pipett och PE50 slangen är tejpade över den sida av 5 ml pipett för att förhindra curling under centrifugering. Celler är tillåtna för att nå 1000 rpm och stannade.

Transplantation: Mottagarens möss är sövda, rakade, och rengöras. Ett litet snitt görs på den vänstra flanken av musen och njurarna är utsatt. Njuren, fett och vävnad hålls fuktig med fysiologisk koksaltlösning provstickan. Den distala änden av PE50 är ansluten till en Hamilton skruv köra sprutan, som innehåller en pipettspets, med hjälp av slangen silikon adaptern. En liten nick görs på den högra flanken sida av njuren, inte för stora eller för djupt. Den avfasade änden av PE50 rör, närmast celler, noggrant placeras under kapseln är slangen flyttas runt försiktigt för att ge plats medan badda koksaltlösning, en torr kapsel kan riva lätt. En liten luftbubbla levereras under kapseln genom att långsamt slå kör sprutan skruven. Holmar är sedan långsamt levereras bakom luftbubbla. När holmar har levererats njure homeostas upprätthålls och Knick är flamberats med låg temperatur. Njuren placeras tillbaka in i hålrummet och bukhinna och hud är sys och häftas. Möss är omedelbart behandlas med Flunixin och Buprenorfin kvm och placeras i en bur på en värmedyna.

Protocol

Beredning av Islets för transplantation (Tx)

  1. Enligt ett inverterat mikroskop, handplocka holmar med en P200 pipetman och rak pipettspetsen från odlade holmar i en 100 mm platta.
  2. Räkna holmar 100 åt gången och överföring till varje mikrocentrifugrör (~ 500 holmar / rör / mus).
  3. Låt holmar att bosätta sig på botten av mikrocentrifugrör.
  4. Rita en holme pelleten i ett P200 pipetman (inställd på 130ul) med en rak tunnväggigt pipettspetsen.
  5. Placera en adapter silikonslang över sprutspetsen. Sätt en längd av PE50 slang i silikon adaptern.
  6. Häng pipetman vid sidan av huven och tejpa PE50 slangen till huven väggen högre än holmar i spetsen. Detta gör det möjligt holmar att bosätta sig bara i toppen av pipetten.
  7. Överför holmar i PE50 slangen genom att långsamt slå pipetman och flytta holmar i PE50 rör, försiktigt så att inte utvisa holmarna från slutet.
  8. Gör en knut i den avfasade änden av PE50 rör. Samtidigt som den knut, koppla slangen silikon adaptern från pipetman och säkra knut med silikon adaptern.
  9. Placera holmar i PE50 rör, snodd silikon adapter slang nedåt i en 15 ml konisk med ett snitt 5 ml pipett och tejpa PE50 slangen över den sida av 5 ml pipett för att förhindra curling av PE50 slangen medan centrifugering.
  10. Centrifugera PE50/15mL conicals till 1000 rpm och stänga av centrifugen. (Aldrig förbereda mer än 10 holme förberedelser på en gång).
  11. Placera röret på is.

Beredning av musen för transplantation

  1. Bedöva möss med isofluorane eller med ketamin / Xylexene (se förberedelse protokoll).
  2. Efter narkos har tagit påverka raka vänstra flanken av musen.
  3. Provtagningspinnen hud mus, center-out, med povidonjodid kompress och sedan torka av med en EtOH tops.
  4. Lokalisera den vänstra njuren (precis rätt mjälte). Gör ett litet snitt i huden, utsätta bukhinnan.
  5. Gör ett litet snitt i bukhinnan utsätta njurarna. Att hålla snittet små kommer att hjälpa till att hålla njurarna upp och utsatt.
  6. Applicera ett lätt tryck på båda sidor av snittet, höja eller pop njuren ur musen.
  7. Håll njure fuktiga genom att tillämpa normal saltlösning med bomull tippas tops.
  8. Med hjälp av en spruta 23 eller 25 gauge kanyl, göra en liten skrapa på den högra flanken av njuren, vilket skapar en nick i njurarna kapseln, inte för djupt eller för stort.

Transplantation av Islets

OBS: Även musen håller på att utarbetas för TX, bör den andra personen förbereda Hamilton skruv-drive spruta holme transplantation.

  1. Sakta ut slangen silikon adaptern från PE50 slangen samtidigt som knut på slangen.
  2. Placera den andra änden av PE50 rör i silikon adaptern slangen och placera silikon adaptern slangen på pipettspetsen bifogas "skruv-drive" glas Hamilton spruta. Sakta släppa knut i PE50 slangen, och se till att öarna inte läcka ut.
  3. Advance holmarna långsamt till toppen av PE50 rör med "skruv" mekanismen, men behålla en liten luftbubbla i framsidan av holmar i PE50 slangen.
  4. Into the nick gjorde i njuren, skjut försiktigt PE50 slangen i kapseln, vilket gör en liten ficka. Var mycket noga med att inte trycka ut njurarna eller punktera genom kapseln.
  5. Det hjälper till att hålla området och kapsel fuktigt med vanlig koksaltlösning-Gentamycin indränkt bomull tippas tops, en torr kapsel kommer att riva lätt.
  6. Rör försiktigt slangen i alla riktningar, vilket skapar en "ficka" för transplantation av insulinproducerande att vila. Kom ihåg att ansöka på nytt ytterligare fysiologisk koksaltlösning för att hålla området fuktigt.
  7. Under ledning av den person som har öppnat musen och vem som har placerat PE50 slangen under njure kapseln, den andra personen, som utarbetat musen och Hamilton transplantation spruta, kommer långsamt förväg skär i kapseln, inne i "fickan", bakom en liten luftbubbla som levererats av PE50 slang, är tills alla holmar transplanterade.
  8. Sakta ut PE50 rör, torka området med en torr tops och försiktigt bränna bort de nick med låg temperatur.
  9. Använd en torr bomull tippas tops, se till att alla har slutat blöda. När blödningen har slutat, åter fukta njurarna med steril koksaltlösning, och försiktigt byta ut njuren i bukhinnan före stängning musen med suturen och häftklammer hud.

Stängning / Revival av Mouse

  1. Stäng bukhinnan med en rakstygn med 5-0 siden suturer W / A C-6 19mm nål.
  2. Använd pincett dra båda sidor av huden snittet tillsammans.
  3. Häfta ihop huden med 2 eller 3 häftklamrar.
  4. Rengör huden på möss av något blod, med hjälp av ett bomull tippas tops och Saline.
  5. Omedelbart behandla musen med en subkutan injektion av Flunixin och buprenorfin.
  6. Placera musen i en bur, som är placerad på en värmedyna eller under en värme lampa, tills musen är fullt aktiv.
  7. Ta bort skinnet häftklammer i 2 veckor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll ger ett praktiskt och effektivt alternativ för snyggt och enkelt leverera holmar eller celler i njuren kapsel diabetiker eller normala möss. Tekniken att koncentrera och pelletering av insulinproducerande celler eller i den slutliga leveransen slangen (PE50) används för att transplantera celler i njurarna kapsel erbjuder en enkel och effektiv metod att transplantera celler samtidigt som all onödig stress på cellerna eller till musen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

UCSF Diabetes Center. NIH UCSF DERC Islet Core. JDRF. LifeScan Inc. Johnson & Johnson-företag.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical gloves Fisher Scientific 11-394-95(sz)
Surgical scrub sponges Moore Medical 42940AK
Forceps Miltex Inc. 6-114 and 6-26 2 with teeth, 2 straight
Dissecting scissors n=2 Miltex Inc. 5-290
Oster razor (sz. 40 blade) Fisher Scientific 01-305-10B
4x4 Sterile gauze pads Moore Medical 08252AK
Povidone Iodine pads Moore Medical 08486AK
Alcohol pads Fisher Scientific 14-819-2
Heating pad Moore Medical 42508AK
23G or 25G needles 1" long
Cidex solution Moore Medical 07535AK for cleaning/santizing instruments
PE50 polyethylene tubing BD Biosciences 427411 PE50, 0.965mm O.D. x 0.58mm I.D.
Cidex + 28 day soln Moore Medical 35625AK
Silicone tubing Spectrum Chromat. 123732 5/32”OD x 1/32” ID
Instrument sterilizing container Moore Medical 39074AK
Straight Pipet Tips USA Scientific, Inc. 1111-0810 sterile
Glass syringe w/screw-drive Hamilton Co 1001
Cauterizing tool Roboz Surgical Instruments Co. RS230
Needle Holder Moore Medical 41-067
5-0 silk LOOK Surgical 754B for suture (6-C)
Cotton tipped swab Moore Medical
9mm autoclip stapler BD Biosciences 7630
9mm staples BD Biosciences 7631
9mm staple remover BD Biosciences 7637

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
  2. Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A. Inability to induce tolerance through direct antigen presentation. Am J Transplant. 2, 510-519 (2002).
  3. Lenschow, D. J., Zeng, Y., Hathcock, K. S., Zuckerman, L. A., Freeman, G., Thistlethwaite, J. R., Gray, G. S., Hodes, R. J., Bluestone, J. A. Inhibition of transplant rejection following treatment with anti-B7-2 and anti-B7-1 antibodies. Transplantation. Transplantation. 60, 1171-1178 (1995).
  4. Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G., Linsley, P. S., Bluestone, J. A. Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4lg. Science. 257, 789-792 (1992).

Comments

12 Comments

  1. Could you tell me which  type of Hamilton screw drive syringe be used?  Hamilton  Precision Syringe Pump PSD-² or PSD-3 or somethingelse?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 25, 2008 - 5:21 AM
  2. We use the Hamilton #1001 syringe catalog# 81341.  Its a threaded plunger syringe that includes a screw drive plunger; $²59. Website: http://www.hamiltoncompany.com/syringes/syringesLS-Threaded.asp We then cut the back-end of a pipet tip to fit on the leur tip of the syringe.  This allows for the attachment of the silicone adaptor tubing to attach to the syringe and move your pellet of cells through the PE50 polyethylene tubing from Becton Dickenson #4²741.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 25, 2008 - 12:18 PM
  3. Hi Dear, the kidney is located retroperitoneally, that means if you have chosen approach from backside, there is not any peritoneum to be cut and sutured.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 20, 2008 - 3:46 AM
  4. I see smart people

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 20, 2008 - 1:13 PM
  5. Could you tell me what type of silicone adaptor tubing is used when it is attached to pipet tip? Is it commercially available?  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 27, 2008 - 2:45 AM
  6. Hello, I can't seem to find the Syringe with the screw-drive on the Hamilton website, dŒs anybody have anymore information on this item? Thank you so much!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 9, 2009 - 9:12 PM
  7. Hello! Thank you for this wonderfull and very instructive video! I was wondering if it is possible to save the video on a harddrive! If yes could you tell me how to do it Thank you a lot in advance   Evrim Jaccard PhD student  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 26, 2009 - 12:42 PM
  8. Hello Evrim, Why don't you shoot me an email at nikitab@jove.com and we'll see what we can do. Cheers, Nikita

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 2:19 AM
  9. Hi Dr. Szot, Thank you for posting a very helpful video demonstrating islet transplant.  What do you think of isolating islet cells and culturing them overnight before transplantation the next day?  If you think this possible, do you recommend any particular culturing conditions (medium, temp, etc)? Thank you in advance, Omar

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 13, 2009 - 6:43 PM
  10. Thanks for sharing the impressive video.
    Would you like to tell me, in your experience, how long did the mice maintain their euglycemia status after receiving transplantation?

    Reply
    Posted by: Ruei-Ren W.
    July 16, 2009 - 4:52 AM
  11. Excellent work to teach the people how to do the surgery

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 5, 2009 - 1:23 PM
  12. Dear Librarian,
    I would like to request access to JoVE because I am a young scientist and study the problem of diabetes. Your help will be invaluable to me.
    Alibek Mereke
    Department of surgery, Kazakh National Medical university, Almaty

    Reply
    Posted by: Alibek M.
    January 9, 2012 - 9:50 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats