Выделение и характеристика дендритных клеток и макрофагов из кишечника мыши

Published 5/21/2012
5 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Здесь мы подробно методику для быстрого выделения мышью кишечного дендритные клетки (ДК) и макрофаги. Фенотипические характеристики кишечной домена и макрофагов осуществляется с помощью многоцветной проточной цитометрии в то время как магнитный шарик обогащения следует сортировки клеток используют для получения особо чистых популяций для функциональных исследований.

Cite this Article

Copy Citation

Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J. Vis. Exp. (63), e4040, doi:10.3791/4040 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

В кишечнике находятся уникальные популяции врожденных и адаптивных иммунных клеток, которые участвуют в деле поощрения терпимости по отношению к комменсальных флоры и пищевых антигенов в то время как остальные готовы одновременно подключить к воспалительной реакции инвазивных 1,2 патогенов. Антиген представляющих клеток, в частности, домена и макрофагами, играют важную роль в поддержании кишечного иммунного гомеостаза через их способность чувствовать и адекватно реагировать на микробиоты 3-14. Эффективная изоляция кишечного домена и макрофагов является важным шагом в характеризующие фенотип и функцию этих клеток. Хотя многие эффективные методы выделения кишечной клетки иммунной системы, включая контроллеры домена и макрофагов, были описаны 6,10,15-24, многие полагаются на длительное время пищеварения, которые могут отрицательно влиять на клеточной поверхности антиген выражения, жизнеспособность клеток и / или выход ячейки. Здесь мы подробно методику для быстрого выделения больших количеств viablе, кишечные ДК и макрофагов. Фенотипические характеристики кишечной ДК и макрофаги осуществляют непосредственно окрашивание изолированных клеток кишечника с конкретными флуоресценции-меченных моноклональных антител для многоцветной проточной цитометрии. Кроме того, очень чистый DC и макрофагов населения изолированных функциональных исследований с использованием CD11c и CD11b магнитных активированной сортировки клеток бисером следует сортировки клеток.

Protocol

1. Вскрытие и диссоциации эпителиальных клетках кишечника

Подготовка реагентов и оборудования:

  • Теплый Ca 2 + / Mg 2 + без PBS (CMF PBS) до комнатной температуры.
  • Теплый Ca 2 + / Mg 2 + без HBSS с 5% FBS (CMF HBSS / FBS) и на 2 мм ЭДТА до комнатной температуры.
  • Теплый Орбитальный шейкер до 37 ° C.

Примечание: Шаги 1.1 до 1.7 должны быть выполнены как можно быстрее, чтобы свести к минимуму степень клеточной смерти и для достижения максимальной доходности клетки.

  1. Усыпить мышей в CO 2 камеры и спрей 70% этанола на брюшной полости и грудной клетки.
  2. Сделайте небольшой горизонтальный разрез в середине живота с ножницами и отогните кожи подвергать брюшины.
  3. Приступить к отделить живот от верхней части тонкой кишки за счет сокращения на пилорический сфинктер. Дразните от брыжейки с пинцетом и сократить раз вподвздошно-слепой кишки клапана, чтобы освободить весь тонкий кишечник из толстой кишки. Сделайте надрез на ануса и снова дразнят друг от друга до брыжейки толстой кишки является бесплатным.
  4. Разрежьте продольно толстой кишки с помощью ножниц и смыть фекального содержимого и слизи из просвета кишечника в CMF PBS при комнатной температуре.
  5. Используйте ножницы и щипцы для макроскопически рассекать из патчей Пейера по борьбе с брыжеечной поверхности тонкой кишки и разрезать тонкой кишке продольно.
  6. Вымойте небольшой просвет кишечника фекальные содержание и слизи в CMF PBS при комнатной температуре.
  7. Отдельно вырезать небольшие / толстой кишки на 1,5 см кусочки и поместите в отдельную 50 мл конические пробирки, содержащие 30 мл подогретого CMF HBSS / FBS и 2 мМ ЭДТА. Не добавляйте более 1 кишечника на 50 мл коническую трубку.
  8. Горизонтально разместить по 50 мл коническую трубку в орбитальный шейкер и потрясите для 250 оборотов в минуту в течение 20 мин при 37 ° C. </ LI>
  9. Поместите один фильтр сетки над отходами ведро и залейте содержимое по 50 мл коническую трубку, через восстановление части 1,5 см кишечника и поместить их в отдельный 50 мл конические пробирки, содержащие 30 мл подогретого CHBSS / FBS 2 мМ ЭДТА.
  10. Повторите 1.8.

2. Пищеварение тканей и выделение клеток кишечника

Подготовка реагентов и оборудования:

  • Коллагеназы решение: 1,5 мг / мл Тип VIII коллагеназы растворяется в предварительно нагретой CMF HBSS / FBS с 40 мкг / мл ДНКазы I.
  • Предварительно нагретый CMF HBSS / FBS и 2 мМ ЭДТА.
  • Предварительно нагретый орбитальном шейкере при температуре 37 ° C.
  • Ледяной CMF HBSS / FBS.
  1. После второго тура дрожь, вылейте содержимое по 50 мл коническую трубку через сито и передачи части 1,5 см кишечника в небольших пластиковых вес лодки после вытирать излишки носителя с помощью бумажного полотенца.
  2. Быстро фарш 10,5 см части кишечника с помощью ножниц прямо на вес лодки и добавить рубленые кишечнике до 20 мл коллагеназы решение. Горизонтально разместить по 50 мл коническую трубку в орбитальном шейкере и дайджест на 200 оборотов в минуту в течение 10-20 минут при температуре 37 ° C. Пожалуйста, см. ниже по оптимизации.
  3. Кратко вихрь для обеспечения тщательного диссоциации оставшиеся ткани кишечника и процеживают через 100 мкм ячейка фильтр непосредственно в 50 мл коническую трубку.
  4. Топ с каждым 50 мл коническую трубку с CMF HBSS / FBS и центрифуги в 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин при 4 ° C. Если твердый осадок не наблюдается толстой кишки после центрифугирования образца, пробы должны быть снова центрифугировали в течение 3,5 мин. Повторите этот шаг мыть еще раз.
  5. Слейте надосадочную и ресуспендируют осадок клеток в ледяной CMF HBSS / FBS и место образцы на льду.
  6. Перейдите к разделу 3 для FACS приобретение / или анализа в разделе 4 магнитных шарика обогащения для высокоскоростного клетки сортировонг.

3. Антитела Окрашивание для многоцветной проточной цитометрии ДК и макрофаги

Подготовка реагентов и оборудования:

  • Ледяной PBS CMF.
  • Ледяной окрашивания буфера (PBS CMF + 5% FBS).
  • Подготовить мертвые клетки пятно в ледяной CMF PBS в разведении 1:1000 использованием LIVE / DEAD Исправимые Аква Dead Cell пятен Kit.
  • Подготовка коктейль антител окрашивание, добавив следующие флуоресценции-меченных моноклональных антител (МАТ) к ледяного буфера окрашивание: CD45-PerCP, CD103-PE, CD11c АПК, MHC-II (ИА б) Alexa Fluor +700, CD11b eFluor-450, F4/80-PE-Cy7.
  1. Передача клеток в 5 мл полистирола с круглым дном (FACS) трубы.
  2. Промойте клетки дважды в ледяной CMF PBS.
  3. Инкубируйте образцы мертвых клеток пятно в течение 15 минут на льду в темноте.
  4. Промойте клетки дважды в ледяной CMF PBS.
  5. Блок ячеек с 2.4G2 anti-FcγRIII/II в ледяной окрашиваниембуфера в течение 10 минут на льду.
  6. Вымойте клеток в ледяной окрашиванием буфера.
  7. Инкубируйте образцы с антителами окрашивания коктейль в течение 20 минут на льду в темноте.
  8. Промойте клетки с ледяного буфера окрашивания в два раза и образцы ресуспендируют в 400 мкл ледяного буфера окрашивания и проходит через 40 мкм фильтр крышки на трубах FACS.
  9. Получить образцы на LSR II цитометр (BD), как определено стробирования стратегии в разделе 5 и на рисунке 1.

4. Обогащение ДК и макрофаги из кишечника

Подготовка реагентов и оборудования:

  • Ледяной окрашивания буфера (PBS CMF + 5% FBS).
  1. Инкубируйте суспензии отдельных клеток, полученных из шага 2.5 с CD11b и CD11c MACS бусины в соответствии с инструкциями производителя.
  2. Промойте клетки с ледяной окрашиванием буфера с последующим центрифугированием.
  3. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 1 мл ледяной окрашиванием буфери проходить через ячейки 100 мкм сито следуют ячейки 40 мкм фильтр.
  4. Расширьте возможности для магнитных шарика подключенных клеток положительной селекции с использованием MACS LS магнитные колонки.
  5. Повторите шаг 4.2 и отказаться от супернатант.
  6. Инкубируйте клетки с поверхности маркер МКА, как описано в пункте 3.7.
  7. Вымойте магнитных шарика обогащенного клетки дважды ледяной окрашиванием буфера. Ресуспендируйте клетки гранулы в 500 мкл ледяной окрашиванием буфера без азид натрия, и пройти через сито 40 мкм клетки в трубку FACS.
  8. Приступить к FACS-сортировки на BD ARIA II Сотовые Сортировщик для сортировки кишечного постоянного тока и / или макрофагов множества интересов.

5. Память стратегии LP БТР

Примечание: Обратите внимание, что неокрашенные клетки кишечника могут быть использованы в качестве отрицательного контроля для оказания помощи в надлежащий вид ворот к разделению положительных и отрицательных населения.

  1. Как показано на рисунке1, создайте точку сюжета и исключить клетки, которые являются положительными для мертвых клеток пятна (рис. 1) с последующим исключением дублет событий (рис. 1B и C). Затем ворота на клетки интерес по передней и боковой разброс убедившись, исключить мусор (рис. 1D).
  2. Создайте еще ​​одну точку сюжета и дальше ворот на CD45 + и И.А. б + клеток, которые фенотипически характеризует БТР (рис. 1д).
  3. На отдельном участке точка, анализировать для CD11b и CD11c выражение выделить конкретный округ Колумбия, и макрофагов подмножеств (R1, R2 и R3,. Рис 1F). Клетки R1 являются CD11c + CD11b тупой / - клеток. Региона, R2, очерчена так, что эти клетки имеют одинаковый уровень поверхности выражение для CD11c как в клетках R1, но клетки R2 также экспресс CD11b. После этого региона R3 предназначена для клеток, которые CD11b + и CD11c тупой / -.
  4. alyze регионах R1, R2, R3 и в дальнейшем для F4/80 и CD103 выражение дифференцировать макрофагов и постоянного населения, соответственно. CD11c + CD11b тупой / - клетки R1 экспресс высокого уровня аЕ интегрина, CD103, а также низкий уровень F4/80 (рис. 1Г). CD11b + + CD11c клетки R2 состоит из обоих контроллеров домена и макрофагов на основе их дихотомического выражение CD103 и F4/80 (рис. 1 полугодие). Наконец, CD11b + CD11c тупой / - клетки макрофаги R3 составляют на основе фенотипических профиля F4/80 + и CD103 - (рис. 1I) 16.

6. Представитель Результаты

Рисунок 1
Рисунок 1. Память стратегии кишечного ДК и макрофагов. Мертвые клетки (А) и дублеты (B и C) впервые были исключены из анализа, а затем небольшой intestiNAL клетки закрытого соответственно вперед и стороной рассеяния (D), и БТР были определены как CD45 + B + IA (E). Макрофагов и ДК были определены по выражению CD11b и CD11c (F). CD103 и F4/80 выражение для клетки предварительно закрытый на R1 (G), R2 (H) и R3 (I) населения была проанализирована.

Рисунок 2
Рисунок 2. Выход клеток и антител, качество окрашивания зависит от пищеварения времени. CD11b и CD11c окрашиванием и общий выход ячейки под-(A, D), оптимально (B, E) или по-перевариваются (C, F) ткани кишечника.

Кишечные клетки были выделены из C57BL / 6 мышей тонкой кишки и ДК и макрофаги были проанализированы FACS на BD LSR II. Напряжения и компенсации были установлены с помощью безупречной и один флуорохромом окрашенных спленоцитов. Мертвые клетки (рис. 1А) и дублеты (рис. 1B и C) впервые были исключены изанализа. Клетки интерес затем анализируются в соответствии с передней и боковой рассеяния (рис. 1D), а затем стробирования на CD45 + и И.А. б + клеток (рис. 1д). После этого CD11b и CD11c выражение оценивается среди CD45 + И.А. б + клеток очертить трех регионах (R1, R2 и R3,. Рис 1F). CD103 и F4/80 выражение в трех регионах была оценена провести различие между ДК и макрофагов, соответственно. CD11c + CD11b тупой / - клетки R1 выразили высокий уровень аЕ интегрина, CD103, а также низкий уровень F4/80 (рис. 1Г). CD11b + + CD11c клетки R2 были составлены как контроллеры домена и макрофагов на основе их дихотомического выражение CD103 и F4/80 (рис. 1 полугодие), а CD11b + CD11c тупой / - клетки макрофаги R3 представляет собой основанный на фенотипические профиля F4 / 80 + и CD103 - ( 16. Макрофаги в ворота R2 и макрофагов в ворота R3 имеют аналогичные свойства вперед и стороной разброс и различаются по CD11c выражения. Функциональные дихотомии этих подмножеств остается полностью поняты.

Отношения между продолжительностью ткани пищеварения на общий выход ячейки и выражение CD11b и CD11c показано на рисунке 2. Кишечные ткань, которая переваривается в течение 3 минут (под-пищеварение) дает низкий общего числа клеток (рис. 2) и, следовательно, несколько контроллеров домена и макрофагов для характеристики (рис. 2). Ткань для пищеварения 11 мин производится надежный выход из живых клеток (рис. 2Е) с населением домена и макрофагов, что выражается высоким уровнем CD11b и CD11c и фенотипически различны (рис. 2). В отличие от пищеварения в течение 50 минут (по-пищеварение) в результате аналогичного выход ячейки при сотрудничествеmpared оптимизированной пищеварения (рис. 2Е и F), однако, разграничение различных клеточных популяций использованием CD11b и CD11c стал более темным, как выражение CD11c уменьшение (рис. 2) и число погибших клеток увеличивалось (данные не представлены).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Рисунок 3
Рисунок 3. Факторы, важные для оптимизации выхода клеток и экспрессия поверхностных антигенов. Выход клеток и экспрессия поверхностных антигенов напрямую зависят от продолжительности ткани пищеварения, специфику коллагеназы, степень измельчения ткани, а также наличие или отсутствие воспаления, которые могут повлиять на целостность тканей и клеточного. Длительное пищеварения ткани может привести к снижению жизнеспособности клеток и экспрессии поверхностного антигена в то время как недостаточное переваривание тканей может привести к недостаточности клеток для анализа.

Здесь мы подробно методику для быстрого выделения мышью кишечного домена и макрофагов на фенотипические характеристики использованием многоцветной проточной цитометрии и обогащения с использованием MACS бисером и сортировки клеток для проведения функциональных исследований на очищенную клеток. Оптимизация концентрации коллагеназыи продолжительность ткани пищеварения необходимо производить надежные выход клетки без ущерба для жизнеспособности и выражение поверхностного антигена. Заместитель пищеварения приводит к низкой общего числа клеток и нехватка домена и макрофагов для характеристики (рис. 2 и D). С другой стороны, чрезмерная пищеварения дает общего числа клеток похож на оптимальных условиях (рис. 2F), но число погибших клеток значительно увеличился (данные не представлены) и качество окраски находится под угрозой. Подобный под-пищеварение, по-переваривание тканей усложнит фенотипические характеристики и очистки.

Несколько дополнительных параметров для рассмотрения с помощью этого протокола являются производитель, тип и конкретной партии коллагеназы, целостность и клеточности кишечника, а степень измельчения ткани. Как различия в активности коллагеназы могут существовать между различными производителями, типа коллагеназы, а вот производствотс, потенции пищеварения могут значительно варьироваться, и требует оптимизации. Таким образом, выбор наиболее подходящего типа коллагеназы имеет решающее значение при разработке эксперимента, как качество и воспроизводимость данных могут быть затронуты. По нашему опыту, коллагеназы тип VIII получил от Sigma-Aldrich предоставила наилучшие результаты, однако, мы также имели успех, используя коллагеназы тип IV от Sigma-Aldrich.

Хотя приведенные выше подробный протокол был оптимизирован для использования на здоровую тонкого и толстого кишечника, она может быть успешно использован для изоляции домена и макрофаги из воспаленных тканей выставке повышения клеточного и архитектурных искажений, связанных с воспалением. Наличие воспаления кишечника может значительно влиять на скорость пищеварения, часто повышая чувствительность кишечных тканей к действию протеолитических ферментов, основанный на нашем опыте. Таким образом, продолжительность пищеварения или concentratioп коллагеназы должны быть адаптированы в соответствии с изменениями в целостности тканей, связанных с воспалением.

Кроме того, степень измельчения ткани влияет на продолжительность ткани пищеварения. Измельчение ткани на более мелкие куски увеличивает площадь поверхности для пищеварения и дает больше клеток, но меры предосторожности должны быть приняты, так как ткани могут быть более восприимчивы к чрезмерной пищеварения. Следовательно, продолжительность пищеварения, возможно, придется быть уменьшена. В отличие от бедных мясорубки приведет больших кусков ткани, которые будут плохо переваривается в результате низкой совокупной доходности клетки. Увеличение длительности пищеварения могут компенсировать плохие мясорубки до некоторой степени.

После оптимизации параметров для кишечного пищеварения ткани коллагеназы, надежный выход ячейки может быть быстро достигнуто. В результате, кишечная DC и макрофагов населения может быть более точно охарактеризовать и очищается для функциональных исследований для оценки цитокиновпроизводство, презентации антигена, а также регулирование иммунных клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

Мы благодарим Аарон Рей (Университет Эмори кафедры педиатрии и здравоохранения Детский основной поток Атланта) для сортировки клеток. Эта работа была поддержана грантом AA01787001 NIH, премии по развитию карьеры от Крона и колит фонда Америки, и Эмори-Egleston детского исследовательского центра семян грант TLD

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X PBS, Ca2+- and Mg2+-free
Hank's balanced salt solution (HBSS) with phenol red Fisher Scientific SH3001603
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6014
1M HEPES in 0.85% NaCl Lonza Inc. 17-737E
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150H Heat-inactivated
0.5M EDTA (pH 8.0) Cellgro 46-034-CI
Collagenase type VIII Sigma-Aldrich C2139
DNase I Roche Group 14785000 Stock solution: 100mg/ml
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit for 405 nm excitation Invitrogen L34957 Use at 1:1000
CD45-PerCP mAb (30F11) BD Biosciences 557235 Use at 1:100
CD103-PE mAb (M290) BD Biosciences 557495 Use at 1:100
FcγRIII/II mAb (2.4G2) BD Biosciences 553141 Use at 1:200
CD11c-APC mAb (N418) eBioscience 17-0114-82 Use at 1:100
MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 mAb eBioscience 56-5321-82 Use at 1:100
CD11b-eFluor 450 mAb (M1/70) eBioscience 48-0112-82 Use at 1:200
F4/80-PE-Cy7 mAb (BM8) eBioscience 25-4801-82
CD11b microbeads Miltenyi Biotec 130-049-601
CD11c microbeads Miltenyi Biotec 130-052-001
50 mL conical tubes BD Biosciences 352098
Single mesh wire strainer Chefmate
Small weigh boat Fisher Scientific 08-732-116
100 μm cell strainer BD Biosciences 352360
40 μm cell strainer BD Biosciences 352340
5 mL polystyrene round-bottom tubes BD Biosciences 352235 Use at 1:100
MaxQ 4450 benchtop orbital shaker Thermo Fisher Scientific, Inc.
LS MACS column Miltenyi Biotec 130-042-401
LSR II BD Biosciences
FACSAria II BD Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
  2. Nagler-Anderson, C., Terhoust, C., Bhan, A. K., Podolsky, D. K. Mucosal antigen presentation and the control of tolerance and immunity. Trends Immunol. 22, 120-122 (2001).
  3. Abraham, C., Medzhitov, R. Interactions between the host innate immune system and microbes in inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 140, 1729-1737 (2011).
  4. Macdonald, T. T., Monteleone, I., Fantini, M. C., Monteleone, G. Regula tine. Gastroenterology. 140, 1768-1775 (2011).
  5. Rescigno, M. Intestinal dendritic cells. Adv. Immunol. 107, 109-138 (2010).
  6. Platt, A. M., Bain, C. C., Bordon, Y., Sester, D. P., Mowat, A. M. An independent subset of TLR expressing CCR2-dependent macrophages promotes colonic inflammation. J. Immunol. 184, 6843-6854 (2010).
  7. Coombes, J. L., Powrie, F. Dendritic cells in intestinal immune regulation. Nat. Rev. Immunol. 8, 435-446 (2008).
  8. Kelsall, B. Recent progress in understanding the phenotype and function of intestinal dendritic cells and macrophages. Mucosal Immunol. 1, 460-469 (2008).
  9. Pulendran, B., Tang, H., Denning, T. L. Division of labor, plasticity, and crosstalk between dendritic cell subsets. Curr. Opin. Immunol. 20, 61-67 (2008).
  10. Denning, T. L., Wang, Y. C., Patel, S. R., Williams, I. R., Pulendran, B. Lamina propria macrophages and dendritic cells differentially induce regulatory and interleukin 17-producing T cell responses. Nat. Immunol. 8, 1086-1094 (2007).
  11. Niess, J. H. CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance. Science. 307, 254-258 (2005).
  12. Milling, S. W., Cousins, L., MacPherson, G. G. How do DCs interact with intestinal antigens. Trends Immunol. 26, 349-352 (2005).
  13. Bilsborough, J., Viney, J. L. Gastrointestinal dendritic cells play a role in immunity, tolerance, and disease. Gastroenterology. 127, 300-309 (2004).
  14. Stagg, A. J., Hart, A. L., Knight, S. C., Kamm, M. A. The dendritic cell: its role in intestinal inflammation and relationship with gut bacteria. Gut. 52, 1522-1529 (2003).
  15. Medina-Contreras, O. CX3CR1 regulates intestinal macrophage homeostasis, bacterial translocation, and colitogenic Th17 responses in mice. J. Clin. Invest. 121, 4787-4795 (2011).
  16. Denning, T. L. Functional Specializations of Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets That Control Th17 and Regulatory T Cell Responses Are Dependent on the T Cell/APC Ratio, Source of Mouse Strain, and Regional Localization. J. Immunol. 187-733 (2011).
  17. Kim, Y. G. The Nod2 sensor promotes intestinal pathogen eradication via the chemokine CCL2-dependent recruitment of inflammatory monocytes. Immunity. 34, 769-780 (2011).
  18. Schulz, O. Intestinal CD103+, but not CX3CR1+, antigen sampling cells migrate in lymph and serve classical dendritic cell functions. J. Exp. Med. 206, 3101-3114 (2009).
  19. Jaensson, E. Small intestinal CD103+ dendritic cells display unique functional properties that are conserved between mice and humans. J. Exp. Med. 205, 2139-2149 (2008).
  20. Uematsu, S. Regulation of humoral and cellular gut immunity by lamina propria dendritic cells expressing Toll-like receptor 5. Nat. Immunol. 9, 769-776 (2008).
  21. Schenk, M., Bouchon, A., Seibold, F., Mueller, C. TREM-1--expressing intestinal macrophages crucially amplify chronic inflammation in experimental colitis and inflammatory bowel diseases. J. Clin. Invest. 117, 3097-3106 (2007).
  22. Sun, C. M. Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid. J. Exp. Med. 204, 1775-1785 (2007).
  23. Kamada, N. Abnormally differentiated subsets of intestinal macrophage play a key role in Th1-dominant chronic colitis through excess production of IL-12 and IL-23 in response to bacteria. J. Immunol. 175, 6900-6908 (2005).
  24. Denning, T. L. CD4+ Th cells resembling regulatory T cells that inhibit chronic colitis differentiate in the absence of interactions between CD4 and class II MHC. J. Immunol. 171, 2279-2286 (2003).

Comments

5 Comments

  1. Hi,

    This is probably your most frequently asked questions. I have the correct Collagenase and I add 30 mg to the ²0 mL prewarmed HBSS with ² mM EDTA. Despite 1 hour at 37 at ²00 the intestine is very stubborn and refuses to digest. I mince it just as described. Any thoughts?? Should I work on increasing the collagenase concentration?

    Many thanks

    Reply
    Posted by: Shehzad S.
    June 13, 2012 - 8:53 AM
  2. Hello there,

    Thank you for your interest in the protocol. Your question seems very perplexing as we have never experienced difficulties with tissue digestion durations greater than 15 minutes, and you seem to be having difficulties after 1 hour. We do not use the ² mM EDTA during tissue digestion and the recommendations I can make are: do not digest the tissue for 1 hour, ensure that you are using an orbital shaker with the 50 ml conical tubes lying horizontally, mince the tissue more finely, and vortex for 50 ml conical tubes after digestion for about 15 to ²0 seconds so that any remaining intestinal tissue is dissociated and digested (you may get some strands of stromal tissue remaining at the end, which is normal). Hope this helps! Please cite our work if you utilize our protocol! Thank you.

    Reply
    Posted by: Duke G.
    June 22, 2012 - 11:16 AM
  3. who can i have a showed vidio play. i want to waching move

    Reply
    Posted by: lee j.
    October 18, 2012 - 9:17 AM
  4. Hi,

    I am using type IV collagenase. I am wondering what U/mg you are using the the type VIII collagenase at?

    Cheers!

    Reply
    Posted by: Mark D.
    November 20, 2012 - 3:17 PM
  5. also,

    I was wondering what is the total cell count you get from 1 small intestine and what cell count you get of cd11c cells per intestine.

    Thanks

    Reply
    Posted by: Mark D.
    November 21, 2012 - 1:27 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats