Icke-invasiv avbildning av disseminerad candidiasis i zebrafisk Larver

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Den snabba utvecklingen, liten storlek och öppenhet zebrafisk är enorma fördelar för studier av medfödda immunförsvaret kontroll av infektion

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Brothers, K. M., Wheeler, R. T. Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (65), e4051, doi:10.3791/4051 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Disseminerad candidiasis som orsakas av patogen Candida albicans är en kliniskt viktigt problem i sjukhus individer och är associerad med en 30 till 40% kan hänföras mortalitet 6. Systemisk candidiasis normalt styrs av medfödda immunitet, och individer med genetiska defekter i medfödda immunförsvaret cell komponenter såsom fagocytsystemet NADPH oxidas är mer mottagliga för candidemia 7-9. Mycket lite är känt om dynamiken av C. albicans interaktion med medfödda immunceller in vivo. Omfattande studier in vitro har visat att utanför den mottagande C. albicans gror inuti makrofager och snabbt förstörs av neutrofiler 10-14. In vitro-studier, men nyttig, inte kan rekapitulera den komplexa in vivo miljö, vilket inkluderar tidsberoende dynamiken i cytokinnivåer, extracellulära bilagor matris, och intercellulära kontakter 10, 15-18

Zebrafisk larven erbjuder en unik och mångsidig vertebratvärden för studiet av infektionen. Under de första 30 dagarna av utvecklingen zebrafisk larver har bara medfödda immunförsvar 2, 19-21, vilket förenklar studier av sjukdomar som sprids candidiasis som är starkt beroende av medfödd immunitet. Den lilla storleken och insyn i zebrafisk larver möjliggör avbildning av infektion dynamik på cellulär nivå för både värd och patogen. Transgen larver med fluorescerande medfödda immunförsvaret celler kan användas för att identifiera specifika celltyper inblandade i infektioner 22-24. Modifierade anti-sense-oligonukleotider (Morpholinos) kan användas för att slå ner olika immun komponenter såsom fagocytsystemet NADPH oxidas och studera de förändringar som svar på fungal infektion 5. Förutom de etiska och praktiska fördelarna med att använda en liten mindre ryggradsdjur, erbjuder zebrafisk larverna den unika möjligheten att avbilda fältslag mellan patogen och värd både intravitally och i färg.

Zebrafisk har använts för att modellera infektion för ett antal humanpatogena bakterier, och har varit avgörande i de stora framsteg i vår förståelse av mykobakterieinfektion 3, 25. Men först nyligen har mycket större patogener såsom svampar använts för att infektera larven 5, 23, 26, och hittills har det inte funnits en detaljerad visuell beskrivning av infektionen metoden. Här presenterar vi våra tekniker för bakhjäman kammare mikroinjektion av prim 25 zebrafisk, inklusive våra ändringar tidigare protokoll. Våra fynd med hjälp av larver zebrafisk modellen för svampinfektion avviker från in vitro-studier och stärka behovet av att undersöka värd-patogen InteraInsatser som den komplexa miljö hos värden snarare än den förenklade systemet av petriskålen 5.

Protocol

Alla zebrafisk vårdrutiner och experiment genomfördes under Institutional Animal Care and Use Committee (lACUC) Protokoll A2009-11-01.

1. Morfolino och larver rätter Injection

Experimentell Längd: * (10-15 minuter)

Svårighetsgrad: *

  1. För ägg injektioner, förbereda en 2% agaros lösning i sterilt vatten och mikrovågsugn. När lösningen har svalnat häller en del av det till en extra djup petriskål (Fisher Scientific) tills det är halvfullt. Cool på is och se till att plattan är nivån.
  2. När skålen har svalnat, häll en 15 ml toppskikt av 2% agaros. Spraya ett ägg injektion räfflad plast mögel (Adaptive Science Tools) med sterilt vatten från en sprayflaska. Placera försiktigt formen spåret ner i den varma agarosen. När agarosen har svalnat, använda en metall platt spatel (VWR Scientific) att skilja formen från agaökade. Sakta ut nät från agarosen. Wrap embryo injektion rätter i Parafilm (VWR Scientific) och lagra inverterad vid 4 ° C.
  3. För injektioner fisk larver, förbereda en 2% agaroslösning som beskrivits. Häll ut lösningen på en standardstorlek petriskål (VWR Scientific) och sattes åt sidan till dess att den stelnar. Wrap larver injektion rätter i Parafilm och förvara inverteras vid 4 ° C.

2. Svampkultur Preparation

Experimentell Varaktighet: ** (30 minuter)

Svårighetsgrad: **

  1. Framställ jästextrakt-pepton-dextros (YPD) agarplattor: 10 g / liter jästextrakt, 20 g / liter pepton, 20 g / liter glukos och 20 g / liter agar till och autoklaven. För flytande YPD framställa 10 g / liter jästextrakt, 20 g / liter pepton, 20 g / liter glukos och autoklavera 20-30 minuter vid 121 ° C.
  2. Två dagar före fisk infektioner förbereda en strimma platta från frystalager av Candida albicans kulturer på YPD-agar för att få enstaka kolonier.
  3. Inkubera vid 37 ° C över natten.
  4. Sätt 5 ml YPD buljong i 16 x 150 rör mm kultur (VWR Scientific).
  5. Dagen innan fisken infektionerna välj 1 liten koloni på YPD agar med en träpinne (VWR Scientific). Sätt stick i kulturen röret och snurra runt för att återsuspendera koloni i YPD vätskan.
  6. Växa över natten vid 37 ° C på en TC-7 Tissue Culture valstrumma utrustad med en 14-tums provrör hjulet (New Brunswick Scientific).
  7. Nästa dag, centrifugera ner 1 ml av kulturen vid 14000x g under 1 minut i en 1,7 ml rör (Axygen). Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i kvarvarande vätskan genom vortexning (VWR Scientific).
  8. Tillsätt 1 ml 1 x fosfatbuffrad saltlösning (VWR Scientific) och centrifugera såsom tidigare beskrivits.
  9. Upprepa PBS-tvätt 3 gånger.
  10. Späd 1:100 utspädning i 1 x PBS (10 pl tvättat C. albicans i 990 pl 1x PBS).
  11. Räkna med en hemocytometer (VWR Scientific).
  12. Späd till 10 7-celler per ml.

3. Zebrafisk Infektioner

Experimentell Längd: **** (1-3 timmar)

Svårighetsgrad: ****

  1. Samla embryon enligt avsnitt 5 och förvara i ägg-vatten, 60 mg / L Instant Ocean salter (Fisher Scientific) i sterilt avjoniserat vatten.
  2. Användning av ett dissekerande mikroskop, såsom Olympus SZ61 (Olympus), dechorionate embryon på infektion dag. Använd Dumont Dumoxel pincett (VWR Scientific) att dra chorion 27 isär som att öppna en påse chips, eller försiktigt peta pincetten i stängt läge i chorion och sedan långsamt öppna dem. Fisken ska dyka direkt från chorion.
  3. Snurra den extra djupa petriskålen med locket på för att flytta fisken i mitten av skålen. Överföra fisk till locket på skålen. Ta bort ägg-vatten-ochersätta med nya media. Lägg fisken till media.
  4. Varma larver injektion rätter i en inkubator vid 28 ° C. Framställ trikain metansulfonat (Western Chemical Inc.) utspädning vid 200 | ig / ml för anestetisering fisk.
  5. Räkna ut önskat antal larver för infektion (20-50 fisk). Sätt fisken i trikain metansulfonat lösningen och vänta 1-2 minuter tills de slutar röra sig.
  6. Slå på MPPI-3 injektion enhet (Applied Scientific Instruments). Se till att trycket är påslagen "puls" och "pulslängd" är satt till 9 med 3 PSI för mottrycket enheten. Öppna ventilen till kvävet tanken tills trycket på insprutningsenheten läser 30 PSI.
  7. Ladda en drog mikropipett 28 med 5 | il av vortexades Candida albicans vid en koncentration av 1x10 7 celler / ml. Placera mikropipett i mikropipett hållaren (Applied Scientific Instruments). Fyll en tom extra djup petriskål med vatten. Flytta mikropipett tills tips jagar inom synhåll röra bara på ytan av vatten via dissektionsmikroskop och användning Dumont Dumoxel pincett (VWR Scientific) för att klippa av nålen ca 3 mm från spetsen av den dras pipetten.
  8. Tryck på fotpedalen (Applied Scientific Instruments) för att verifiera nålen har klippts. Du bör se den flytande sprida om du var framgångsrik. Diametern på vätskan bolus bör inte vara större än diametern av pupillen av prim 25 zebrafisk larv (0,21 mm, vilket ger en sfär av 4,9 nl i volym). Justera trycket om detta, om vätskan bolus är för stor eller för liten.
  9. Bedöva fisken i trikain metansulfonat (200 pg / ml). När fisken har slutat röra sig, snurra skålen med locket på tills fisken är i centrum. Samla 50 fiskar med en överföringspipett (Fisher Scientific). Peka på sidan av pipetten för att reglera fisken mot spetsen. Försiktigt pipettera fisk på larver agaros skålen med så lite vätska som möjligt.
  10. Line fisken med en jämn glasstav (var noga med att inte krossa dem!). Aspirera så mycket vätska som möjligt bort från skålen. Använd en Kimwipe för att transportera bort fukt.
  11. Placera larver agarosen skålen med fisk under mikroskop tills du får en bra bild av fisken och nålen på samma gång. Flytta glasnål mot fisken. Zooma in på både fisk och nålen när du placerar nålen mot fisken. Försiktigt flytta glaset nålen i örat vesikeln 27, 29 (örat) i den första fisken. Du vet när du har flyttat in nålen i fisken för när du trycker på fotpedalen (Applied Scientific Instruments), kommer bakhjäman kammaren lyfta upp något.
  12. Tryck på fotpedalen (Applied Scientific Instruments) och titta på vätskan sprider inuti fiskens bakhjäman kammare 27. Dra tillbaka nålen från fisken och gå vidare till nästa fisk. Upprepa proceduren tills du har injicerat all fisk på plattan. Ta bort alla dEAD fisk och injicera ersättare att hålla antalet korrekta (50 fiskar). För varje grupp om 50 fiskar injicerat en ny mikroinjektion nål måste vara beredda, eller C. albicans lägger sig i botten av nålen och täpper den, eller kastar bort koncentrationen injiceras.
  13. Tvätta fisken bort från skålen genom att vinkla skålen och sprutning ägg-vatten på fisken i en ren extra djup petriskål innehållande 60 ml ägg vatten. Det är viktigt att inte lämna fisken på agaros längre än 15-20 minuter eller kommer de att torka ut och dö.
  14. Upprepa hela injektionen tills klar. Glöm inte PBS och icke-patogena injicerade kontroller.
  15. När du är klar, håll fisken vid 28 ° C.
  16. Stäng ventilen kvävet tanken. Föra omkopplaren insprutningsenheten från "puls" till "kontinuerlig" att lätta på trycket i tanken linje bör trycket sjunka till noll vid denna punkt. Växla inspmtningsenheten tillbaka till "pulsen". Stäng av injektionen enheten och rensa upp arbetsområdet.
  17. 4. Förbereda Fiska Imaging

    Experimentell Varaktighet: ** (30 minuter)

    Svårighetsgrad: **

    1. Framställ trikain lösning metansulfonat som tidigare (200 pg / ml). Få ut smittad fisk, och överföra dem till trikain.
    2. Förbered 47,9 ml 0,4% låg smälta agaros (VWR vetenskapliga) i ägg-vatten. Värm lösningen genom mikrovågsuppvärmning. Kyl till 37 ° C och tillsätt trikain metansulfonat (200 pg / ml) till blandningen
    3. När fisk immobiliseras i trikain metansulfonat, pipett fiskar i en petriskål (VWR vetenskapliga) som innehåller 0,4% låg smältpunkt agaros (VWR Scientific).
    4. Därefter flytta fisk från låg smältpunkt agaros i enskilda brunnar i en glasbotten skål (MatTek Corporation) för avbildning. Använda så lite låg smält agaros som möjligt så att fisk ligger platt på botten av skålen. Använd endast tillräckligt av trikain-agaros att fylla iPartnerinstituten kretsar glaset nedre skålen.

    5. Ändringar besläktade med Jove protokoll

    Mikropipetter för mikroinjektion

    Experimentell Längd: * (10-15 minuter)

    Svårighetsgrad: *

    1. Dra ihåliga glasstavar BF120-69-10 (Sutter Instruments) med användning av en flamma Brown Mikropipett Avdragaren Model P-97 (Sutter Instruments) enligt Yuan et al. 30. Välj program # 7 med följande villkor Heat = 470, hastighet = 120, Tid = 200. Den resulterande Nålen är 8 mm från avfasningen till spets, och när klipps vid 3 mm ovanför spetsens den har en diameter av ca 10 pm.
    2. Ladda en glasmikropipett i fästena. Välj "Dra". Uppvärmningen tråden kommer att värma nålen enligt programmet parametrar och glasstaven kommer att separera i två dras mikropipetter. Förvara mikropipetter i en pipett förvaringsbox (SuttEr instrument).

    Embryosamlingen, morfolino Injection och underhåll

    Experimentell Längd: *** (1-2 h)

    Svårighetsgrad: ***

    1. Samla embryon i enlighet med metoderna av Rosen et al. 31. Använd en plast sikt (Wares för Knutsford) för att samla in ägg från leken tanken (akvatiska livsmiljöer). Håll sikten upp och ned över en extra djup petriskål och skölj med tanken vatten för att samla ägg.
    2. För morfolino beredning, tillsätt 300 | il sterilt vatten till 300 nanomol morfolino (GeneTools, LLC). Detta ger en arbetsstamlösning av 1,0 mM.
    3. Kontrollera koncentrationen av den morfolino genom användning av en NanoDrop (Thermo Scientific). Välj "nukleinsyra och ändra provet typ" andra "och våglängd till 265. Skriv in konstant genom att multiplicera molekylvikt morfolino med 1000 dividerat med absorptivity koefficient som anges i morfolino oligo egenskapsrutan.
    4. Blank den NanoDrop med 2 | il 0,1 N HCl. Späd 5 | il av den morfolino-lösning i 95 | il av 0,1 N HCl (20x spädning). Placera 2 pl av utspädningen på NanoDrop piedestalen och klicka åtgärd. Multiplicera den koncentration med spädningsfaktorn (20). Detta ger en arbetskoncentration av morfolino. Att beräkna millimolar koncentration dividera koncentrationen erhållas genom att molekylvikten för morfolino.
    5. Framställa en arbetsstamlösning av morfolino i Danieau buffert (58 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,4 mM MgSO 4, 0,6 mM Ca (NO3) 2, 5,0 mM HEPES, pH 7,6) och 0,01% fenolrött (VWR Scientific).
    6. För morfolino injektion arbete följa protokollet enligt Rosen et al. 31 och Yuan et al. 30. Skölj morfolino injektion rätter med ägg-vatten och varmt vid 28 ° C i 15 minuter. Ta bort vatten från injektion rätter och line-up en-CEll steg embryon i spåren av injektionen skålen (framställd från avsnitt 1) ​​med en överföringspipett. Varje platta kommer att hålla ungefär 250 ägg. Injicera 1-2 embryon cell scen med morfolino. Ägg kommer att förbli i en-cellstadiet under 15 minuter 27.
    7. Skölj injicerade ägg med ägg-vatten när du är klar (sterilt avjoniserat vatten med 60 mg / L Instant Ocean salter) och placera i 60 ml ägg-vatten i extra djupa petriskålar. Morfolino injektion rätter kan återanvändas. Skölj med ägg-vatten när du är klar och lagra inverteras vid 4 ° C.
    8. För förvaring av embryon Tillsätt 60 ml ägg vatten skålen. Räkna ut 110 embryon med en överföringspipett i separata extra djupa petriskålar med 60 ml ägg vatten. Tillsätt 0,00003% metylenblått för att förhindra mikrobiell tillväxt och embryon inkubera vid 28 ° C.
    9. För att påskynda utvecklingen av embryon håller embryo rätter vid 33 ° C i 24 timmar och steg i enlighet med Kimmel et al. 27, vilket embryon som utvecklas till sin spetsstam vinkel av 75 ° (Prim 25 steg 27).
    10. För larver infektion arbete hålla embryon vid 28 ° C efter injicering med C. albicans.
    11. Varje dag ersätter embryo rätter med 60 ml färskt ägg-vatten.

    Imaging

    Experimentell Längd: ***** (1-5 timmar)

    Svårighetsgrad: ***

    1. Förbered fisk i låg smältpunkt agaros (enligt avsnitt 4,2) med trikain i glasskålar botten Imaging (MatTek Corporation) som beskrivits tidigare. Placera skålen över en Olympus IX-81 (Olympus) inverterat mikroskop skede. Ta fisken i fokus i 4x förstoring under differential interferens kontrast (DIC) ljus. Bilder kan tas med 4x, 20x och 40x förstoring i DIC, TRITC (tetrametylrodamin isotiocyanat) och FITC (fluoresceinisotiocyanat) filterinställningar.
    2. Använda ett Olympus IX-81 omvänt mikroskop med en FV-1000 laserskanning konfokala system enligt Ariga et al. 32. Genomföra tiden kurser på 40x förstoring genom att Z-stackar med 1-1,5 pm skivor per timme för infektion.
    3. Under lång tid under avbildning av 2 timmar eller mer, placera ett lager med låg smält agaros ovanpå fisken i bildbehandling skålen var 2-3 timmar. Detta förhindrar agaros från att torka ut och krossning fisken medan den som avbildas. För långa tid kurser med ett litet antal fiskar, använder en uppvärmd stadium (Bioptechs Inc.) för att hålla 28 ° C under infektioner.

    6. Representativa resultat

    Ett exempel på en framgångsrik bakhjäman ventrikeln C. albicans-infektion hos en zebrafisk larv i 5 timmar efter infektion (HPI) och 24 HPI visas i (figur 1). Makrofagliknande celler med uppslukas C. albicans ses i bakhjäman ventrikeln vid 5 HPI. Genom 24 HPI, C. albicans är inuti makrofag-liknande cellerS i dorsala svansen vävnaden tecken på disseminerad candidiasis. Denna infektion resultat är i hög grad beroende av en noggrann injektion av 10-15 jäst-formen C. albicans in i bakhjäman ventrikeln. Screening av smittad fisk direkt efter injektionen kan säkerställa detta.

    Figur 1
    Figur 1 Transgen fli1. EGFP 22, 33 larv infekterade med CaF2-yCherry Candida albicans och avbildas intravitally genom konfokal mikroskopi. (AC) 5 timmar efter infektion (A) Infected larven med EGFP-uttryckande makrofag-liknande celler vid platsen för infektionen (bakhjäman kammare) Skala bar = 100 m. (B och C) Högre förstoring bilder av samma fisk som visar C. albicans i fagocyter. Skalstreck = 100 | im för B och 10 pm för C. (DF) 24 timmar efter infektion (D) Infekterade larv med disseminerad candidiasis med CaF2-yCherry C. albicans inuti EGFP macrophage-liknande celler i den dorsala svans vävnaden. Skalstreck = 100 ^ m. (E och F) Högre förstoring bilder av samma fisk som visar C. albicans i svansen vävnad. Skalstreck = 100 ^ m.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Zebrafisk mikroinjektion metod som presenteras här skiljer sig från Gutzman et al. 34 i att vi här visar injektion genom örat vesikeln i bakhjäman ventrikeln av 36 till 48 HPF larver. Metoden beskriver vi gör för konsekvent injektion av 10-15 jäst i bakhjäman kammaren med minskad vävnadsskada. Detta protokoll ger en initialt lokal infektion som sprider sig i hela kroppen med 24 HPI (figur 1) och resulterar i betydande dödlighet / sjuklighet 5. Den bakhjäman kammaren är inte helt förseglad av förrän 48 HPF 27, 29. Under detta tidiga skede av utveckling makrofager och neutrofiler migrera till platsen för infektion, fagocyterar C. albicans, och kan röra sig till andra delar av kroppen 5.

Den verkliga kraften i detta system kommer från förmågan att kombinera zebrafisk transgena med fluorescerande protein-uttrycker mikrober. Vi har engineered vildtyp och mutanta stammar av C. albicans för att grundläggande uttrycka mCherry, dTomato och eqFP650. Kombinera dessa uttryck konstruktioner med oxidativ stress-känsliga initiativtagare tillåter kvotmetriska kvantifiering av oxidativ stress i levande zebrafisk larver 5. Dual in vivo avbildning av fluorescerande svampar och fluorescerande medfödda immunceller i samband med en mutant svamp eller fisk morphant kan också användas för att kraftigt kvantifiera ändrade immunsvar som migration till platsen för infektion, fagocytos av patogenen, förebyggande av svamp groning , och döda 5.

Det finns flera tekniken frågor som kan vara problematiskt att en nybörjare av detta protokoll. För det första är det viktigt att nålen är fastklämd på lämpligt sätt och insprutningstrycket är korrekt inställd, så att 5 nL av C. albicans suspension mikroinjiceras. För att säkerställa detta kan man kontrollera att bolusen som kommer ut urnål är storleken på elev en prim 25 zebrafisk larv, som beskrivs i avsnitt 3,8. Det är viktigt att zebrafisk larverna får samma mängd injiceringsmedlet, vilket kan bekräftas genom screening direkt efter infektion genom epifluorescens att kontrollera att det finns 10-15 jäst förekommer i bakhjäman kammaren. Injicerade fisk kan också homogeniseras och klädd för verifiering av initial kolonibildande enheter 5. För det andra är det viktigt att undvika punktering av blodkärl i bakhjäman ventrikeln, eftersom detta orsakar för tidig död hos larven. Det är viktigt att injicera i örat vesikeln med en ungefärlig 45-graders vinkel, säkerställer ett direkt mikroinjektion i bakhjäman ventrikeln. Tredje, ta extra noga med att inte riva eller skada örat vesikeln vävnaden, vilket kan leda till ökad inflammation infektionen plats som är oberoende av patogen infektion. Fjärde måste injektioner utföras snabbt när larver är placerade på agaros injectiom skålen. Larver kvar för länge på skålen kommer att torka ut, och om detta sker kommer det att finnas dödligheten i PBS-injicerade fisk. Slutföra de infektioner inom 15 minuter och lämnar en återstående mängd vatten på fatet, medan infekterar fisk kan både hjälpa till att lindra detta problem. Kan dock lämnar alltför mycket vatten på fatet gör injektioner svårare med drifting larver. En alternativ metod för injektion som beskrivits för äldre (4 DPF) fisk som är mer komplex men undviker att utsätta larver för luft tillhandahålls av Cosentino och kollegor 28.

Zebrafisk larv har hittills använts för att modellera medfödda immunsvar mot bakteriella, svamp-och virala patogener 5, 26, 35-46. Dessa banbrytande studier har visat nyttan av denna modell för att upptäcka nya cellulära och molekylära mekanismer i både värd och patogen. Tagna tillsammans med den beskrivna protokoll, dessa andra publicerade arbeten tillhandahåller en grund för andra laboratorierrier för att undersöka värd-svamp interaktion i samband med en intakt värd.

Även användbart i dessa experiment, fli1: EGFP transgen linje som beskrivs här har sina begränsningar. Den fli1 genen uttrycks i endotelceller vaskulaturen i tillägg till makrofagliknande celler 22. Ofta EGFP fluorescens kärlsystemet kan göra det svårt att upptäcka C. albicans i makrofagliknande celler. Dessutom blir EGFP-expression i makrofagliknande celler minskas kring 18-24 timmar efter infektion vilket gör det svårt att detektera. En nyligen publicerad makrofag-specifik transgen zebrafisk linje har många fördelar som en modell för makrofag studier 23.

Den beskrivna infektion teknik tillhandahåller en entrée till ett antal kraftfulla genetiska och fluorescensmikroskopi verktyg tillgängliga i zebrafisk. Den kan kombineras med lämplig transgen fisk och konstruerade C. albicans C. albicans, frekvensen av C. albicans matsmältningen, och fördelningen av C. albicans inom medfödda immunceller 5. Man kan också kombinera detta protokoll med hjälp av morfolino antisensoligonukleotider att testa rollen av enskilda medfödda immunförsvaret gener i infektionen 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgements

Författarna vill tacka laboratoriet av Dr Carol Kim för mikroinjektion utbildning, Clarissa Henry för att få råd om påskyndande embryo utveckling och användning av utrustning, och Nathan Lawson för att bidra fli1: EGFP fisk. Vi tackar medlemmar i Wheeler labbet och Shawn väggar för kritisk läsning av manuskriptet. Vi vill också tacka Mark Nilan för fisk vård och rådgivning, och Ryan Phennicie och Kristin Gabor för teknisk rådgivning om detta projekt. Detta arbete har finansierats av ett MAFES forskning assistent till K. Brothers, en MAFES Hatch bidrag E08913-08, och en NIH NCRR utmärkelse P20RR016463 till R. Wheeler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spawning tanks Aquatic habitats 2L
1.7 mL tubes Axygen MCT-175-C
Instant Ocean Fisher Scientific S17957C
Extra deep Petri dishes Fisher Scientific 08-757-11Z
Standard Petri dishes VWR Scientific 25384-302
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
Yeast Extract VWR Scientific 90000-726
Peptone VWR Scientific 90000-264
Dextrose Fisher Scientific D16-1
Agar VWR Scientific 90000-760
Disposable Hemocytometer VWR Scientific 82030-468
Phosphate Buffered Saline VWR Scientific 12001-986
Dumont Dumoxel Tweezers VWR Scientific 100501-806
Wooden Dowels VWR Scientific 10805-018
KimWipes VWR Scientific 300053-964
Low Melt Agarose VWR Scientific 12001-722
Agarose for injection dishes VWR Scientific 12002-102
Flaming Brown Micropipette Puller Sutter Instruments P-97
Hollow glass rods Sutter Instruments BF120-69-10 For glass rods smooth glass by heating over bunsen burner
Pipette Storage Box Sutter Instruments BX10
MPPI-3 Injection system Applied Scientific Instrumentation MPPI-3
Back Pressure Unit Applied Scientific Instrumentation BPU
Micropipette Holder kit Applied Scientific Instrumentation MPIP
Foot Switch Applied Scientific Instrumentation FSW
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33
Magnetic Base Applied Scientific Instrumentation Magnetic Base
Tricaine methane sulfonate Western Chemical Inc. MS-222
Dissecting Scope Olympus SZ61 top SZX-ILLB2-100 base
Confocal Microscope Olympus IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system
TC-7 Tissue Culture Roller drum with 14 inch test tube wheel New Brunswick Scientific TC-7
Imaging Dishes MatTek Corporation P24G-1.0-10-F
Pipette tips for loading needles Eppendorf 930001007
Plate pouring grids Adaptive Science Tools TU-1
Heated Stage Bioptechs Inc. Delta T-5
Flat Spatula VWR Scientific 82027-486
Plastic Sieves Wares of Knutsford Online 12 cm
Parafilm VWR Scientific 52858-000
Vortex Genie VWR Scientific 14216-184
16 x 150 mm Culture tubes VWR Scientific 60825-435
Nanodrop Thermo Scientific ND 2000
Phenol Red VWR Scientific 97062-478
HCl VWR Scientific 87003-216
NaCl VWR Scientific BDH4534-500GP
KCl VWR Scientific BDH4532-500GP
MgSO4 VWR Scientific BDH0246-500GP
Ca(NO3)2 VWR Scientific BDH0226-500GP
HEPES VWR Scientific BDH4520-500GP
Morpholinos GeneTools, LLC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20, 367-379 (2004).
  2. Kanther, M., Rawls, J. F. Host-microbe interactions in the developing zebrafish. Curr. Opin. Immunol. 22, 10-19 (2010).
  3. Meeker, N. D., Trede, N. S. Immunology and zebrafish: spawning new models of human disease. Dev Comp Immunol. 32, 745-757 (2008).
  4. Tobin, D., May, R. C., Wheeler, R. T. Zebrafish: a see-through host and fluorescent toolbox to probe host-pathogen interaction. PLoS Pathog. (2011).
  5. Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot. Cell. 10, 932-944 (2011).
  6. Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clin. Microbiol. Rev. 20, 133-163 (2007).
  7. Ashman, R. B. Innate versus adaptive immunity in Candida albicans infection. Immunol. Cell Biol. 82, 196-204 (2004).
  8. de Repentigny, L. Animal models in the analysis of Candida host-pathogen interactions. Curr. Opin. Microbiol. 7, 324-329 (2004).
  9. Rogers, T. J., Balish, E. Immunity to Candida albicans. Microbiol. Rev. 44, 660-682 (1980).
  10. Calderone, R., Sturtevant, J. Macrophage interactions with Candida. Immunol. Ser. 60, 505-515 (1994).
  11. Frohner, I. E., Bourgeois, C., Yatsyk, K., Majer, O., Kuchler, K. Candida albicans cell surface superoxide dismutases degrade host-derived reactive oxygen species to escape innate immune surveillance. Mol. Microbiol. 71, 240-252 (2009).
  12. Kumamoto, C. A., Vinces, M. D. Contributions of hyphae and hypha-co-regulated genes to Candida albicans virulence. Cell Microbiol. 7, 1546-1554 (2005).
  13. Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryot. Cell. 3, 1076-1087 (2004).
  14. Rubin-Bejerano, I., Fraser, I., Grisafi, P., Fink, G. R. Phagocytosis by neutrophils induces an amino acid deprivation response in Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 11007-11012 (2003).
  15. Behnsen, J. Environmental dimensionality controls the interaction of phagocytes with the pathogenic fungi Aspergillus fumigatus and Candida albicans. PLoS Pathog. 3, e13 (2007).
  16. Lavigne, L. M. Integrin engagement mediates the human polymorphonuclear leukocyte response to a fungal pathogen-associated molecular pattern. J. Immunol. 178, 7276-7282 (2007).
  17. Newman, S. L., Bhugra, B., Holly, A., Morris, R. E. Enhanced killing of Candida albicans by human macrophages adherent to type 1 collagen matrices via induction of phagolysosomal fusion. Infect. Immun. 73, 770-777 (2005).
  18. Netea, M. G., Brown, G. D., Kullberg, B. J., Gow, N. A. An integrated model of the recognition of Candida albicans by the innate immune system. Nat. Rev. Microbiol. 6, 67-78 (2008).
  19. Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev. Comp. Immunol. 28, 9-28 (2004).
  20. Magnadottir, B. Innate immunity of fish (overview). Fish Shellfish Immunol. 20, 137-151 (2006).
  21. Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish Shellfish Immunol. 25, 341-350 (2008).
  22. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, 307-318 (2002).
  23. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, e49-e56 (2011).
  24. Renshaw, S. A. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
  25. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Curr Opin. Microbiol. 11, 277-283 (2008).
  26. Chao, C. C. Zebrafish as a model host for Candida albicans infection. Infect. Immun. 78, 2512-2521 (2010).
  27. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203-253 (1995).
  28. Cianciolo Cosentino, C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp. (42), e2079 (2010).
  29. Haddon, C., Lewis, J. Early ear development in the embryo of the zebrafish, Danio rerio. J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).
  30. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  31. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  32. Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation. J. Vis. Exp. (43), e2093 (2010).
  33. Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation. Cell Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).
  34. Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218 (2009).
  35. Davis, J. M. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17, 693-702 (2002).
  36. Meijer, A. H. Identification and real-time imaging of a myc-expressing neutrophil population involved in inflammation and mycobacterial granuloma formation in zebrafish. Dev. Comp. Immunol. 32, 36-49 (2008).
  37. Mathias, J. R. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J. Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).
  38. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev. Biol. 7, 42 (2007).
  39. Vergunst, A. C., Meijer, A. H., Renshaw, S. A., O'Callaghan, D. Burkholderia cenocepacia creates an intramacrophage replication niche in zebrafish embryos, followed by bacterial dissemination and establishment of systemic infection. Infect Immun. 78, 1495-1508 (2010).
  40. Le Guyader, D. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
  41. Clatworthy, A. E. Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants. Infect. Immun. 77, 1293-1303 (2009).
  42. Brannon, M. K. Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system interacts with phagocytes to modulate systemic infection of zebrafish embryos. Cell Microbiol. 11, 755-768 (2009).
  43. Levraud, J. P. Real-time observation of listeria monocytogenes-phagocyte interactions in living zebrafish larvae. Infect. Immun. 77, 3651-3660 (2009).
  44. van der Sar, A. M. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell Microbiol. 5, 601-611 (2003).
  45. Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Infect Immun. 78, 4542-4550 (2010).
  46. Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cell Microbiol. 10, 2312-2325 (2008).

Comments

1 Comment

  1. That's really useful.

    Reply
    Posted by: Kane R.
    December 18, 2013 - 2:01 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics