Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Neuroscience

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Summary

Uma técnica é descrita para amplamente abertura da barreira sangue-cérebro no ratinho usando microbolhas e ultra-som. Usando esta técnica, o manganês pode ser administrada para o cérebro do rato. Porque o manganês é um agente de contraste para IRM que se acumula nos neurónios despolarizadas, esta abordagem permite imagiologia de actividade neuronal.

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Howles, G. P., Qi, Y., Rosenzweig, S. J., Nightingale, K. R., Johnson, G. A. Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI. J. Vis. Exp. (65), e4055, doi:10.3791/4055 (2012).

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Abstract

Apesar de os ratos são o sistema modelo dominante para estudar as bases genéticas e moleculares da neurociência, neuroimagem funcional em ratos permanece tecnicamente desafiador. Uma abordagem, induzida por activação de manganês-RM (AIM MRI), tem sido utilizado com sucesso para mapear a actividade neuronal em roedores 1-5. Em AIM RM, Mn 2 + actua um análogo de cálcio e se acumula nos neurónios despolarizadas 6,7. Porque Mn 2 + reduz a propriedade tecido T 1, as regiões de atividade neuronal elevada irá aumentar em ressonância magnética. Além disso, Mn 2 + limpa lentamente a partir das regiões activados e, portanto, a estimulação pode ser realizada fora do magneto antes da imagem, permitindo uma maior flexibilidade experimental. No entanto, porque Mn 2 + não atravessam facilmente a barreira sangue-cérebro (BBB), a necessidade de abrir o BBB tem limitado o uso de AIM RM, especialmente em ratinhos.

Uma ferramenta para a abertura do BBB é ultrasound. Embora potencialmente prejudiciais, se ultra-som é administrado em combinação com microbolhas cheias de gás (ie, os agentes de contraste de ultra-som), a pressão acústica necessária para a abertura BBB é consideravelmente menor. Esta combinação de ultra-som e microbolhas pode ser usado para fiavelmente abrir o BBB sem causar danos aos tecidos 8-11.

Aqui, um método é apresentado para a realização de AIM MRI usando microbolhas e ultra-som para abrir o BBB. Depois de uma injecção intravenosa de microbolhas perflutreno, um feixe de ultra-som desfocado pulsado é aplicada à cabeça de rato raspada durante 3 minutos. Por simplicidade, nos referimos a esta técnica de Abertura BBB com Microbolhas e ultra-som como BOMUS 12. Usando BOMUS para abrir o BBB longo de ambos os hemisférios cerebrais, manganês é administrado ao cérebro de rato inteiro. Após a estimulação experimental dos ratos levemente sedados, AIM MRI é usado para mapear a resposta neuronal.

Parademonstrar essa abordagem, aqui BOMUS e AIM ressonância magnética são utilizados para mapear a estimulação mecânica unilateral das vibrissas em camundongos levemente sedados 13. Devido BOMUS pode abrir o BBB longo de ambos os hemisférios, o lado não estimulado do cérebro é usado para controlar para a estimulação de fundo não específico. O mapa de ativação resultante 3D concorda bem com representações publicados das regiões vibrissas do campo barril córtex 14. A abertura ultra-sônica do BBB é rápido, não invasivo e reversível; e, portanto, esta abordagem é adequada para estudos de alto rendimento e / ou longitudinal em ratos acordados.

Protocol

1. Montar e calibrar sistema de ultra-

  1. O sistema de ultra-som começa com um transdutor de ultra-som de um único elemento com um diâmetro de largura suficiente para cobrir o cérebro do rato e uma frequência central na gama de 2 MHz. O transdutor é accionado por um amplificador de potência 50-dB, que está ligado a um gerador de sinal que produz a sequência de impulsos de ultra-som.
  2. Para calibrar a pressão acústica do sistema de ultra-som, usar um hidrofone para relacionar a tensão aplicada à pressão acústica resultante. Coloque o transdutor num tanque de água sobre o hidrofone. Aplicar um pulso simples (por exemplo, uma sinusóide 10-ciclo à frequência do transdutor com o pulso de frequência de repetição de 10 Hz), para o transdutor. Usar uma etapa de tradução 3-eixo para encontrar o pico de resposta, que deve ser colocado no centro do feixe de ultra-som no foco natural do transdutor (aproximadamente 60 mm para o nosso milímetros de diâmetro do transdutor 13 MHz 2,15).
  3. Faça várias medições ao longo de um tocoue de tensões de entrada (por exemplo, 50-400 mV pp) para verificar a linearidade do sistema. Usar uma regressão linear simples para estimar a relação entre a tensão de entrada e de pressão acústica. No nosso sistema, tensões de entrada de 258 e 167 mV pp correspondeu a-pico negativas pressões acústicas de 0,52 e 0,36 MPa.
  4. Programar o gerador de sinais para produzir uma sequência de impulsos de ultra-som que consiste em rajadas de pulsos sinusoidais na frequência transdutor com 50000 ciclos por rebentamento e um período de explosão de 64 ms. Com base nas medições de calibração, definir a amplitude de impulsos para gerar pressões de pico-negativas acústicas de 0,36 MPa no centro do foco natural do transdutor.

2. Preparar os Reagentes

  1. Dissolve-se cloreto de manganês tetra-hidratado (MnCl 2 · 4H 2 O) em água estéril a uma concentração de 100 mM (300 mOsm) e filtro esterilizar.
  2. Produzir a lipídico perflutreno microesferas por "activating «o frasco na agitador fornecido pelo fabricante durante 45 s. Para um dia de experiências, um único frasco pode ser activada uma vez no início do dia e utilizado sem reactivação para o resto do dia.
  3. Imediatamente antes da administração de microesferas, agitar o frasco com a mão durante 1 min para ressuspender as microsferas. Ao retirar as microbolhas do frasco, não injectar ar ambiente para dentro do frasco, como este degrada as microbolhas restantes. Deixe o frasco até que o último uso do dia, e depois armazená-lo em uma geladeira. Mantido dessa forma, um único frasco pode durar vários dias. Re-activar o frasco armazenado no agitador, antes da primeira utilização em dias subsequentes.

3. Preparação dos animais

  1. Anestesiar os animais com isoflurano, entregue pelo cone do nariz. O aparelho de cone de nariz devem ser concebidos para fixar a cabeça do animal com precisão e fiabilidade na mesma posição de cada vez. Nosso dispositivo 15 mantém a cabeça em diae "crânio-plana" posição (isto é, a superfície do crânio dorsal é horizontal) utilizado no cérebro Paxinos atlas 16. Titular o anestésico para manter uma freqüência respiratória entre 85 e 125 respirações por minuto. Manter a temperatura do corpo utilizando uma lâmpada de aquecimento ou ar soprado. Proteger os olhos com lubrificante.
  2. Remova o cabelo do couro cabeludo do mouse usando um aparador elétrico.
  3. Coloque um catéter na veia da cauda e um cateter intraperitoneal (IP). Para estudos de sobrevida, não se esqueça de usar a técnica estéril apropriado; cateter IP demonstrado no vídeo para este artigo é apropriado apenas para não-sobrevivência experimentos.
  4. Faça as preparações adicionais necessários para o experimento de estimulação neuronal. Para o mapeamento de estimulação vibrissas do córtex campo barril, usar um microscópio de dissecação e tesoura microcirúrgicos para cortar o vibrissas tão perto quanto possível da superfície da pele sem folículo do irritante ou pele circundante.
  5. Coloque o gel de ultra-som nacouro cabeludo e, em seguida inferior da coluna de água contida por uma folha de plástico fino (por exemplo, um 7,6 uM forro lixeira) para a cabeça. Alcançar através de coluna de água com um cotonete de ponta para empurrar as bolhas de ar que ficam presas no gel de ultra-som. Posicione o transdutor de ultra-som na sua distância focal natural (58 mm) diretamente sobre o cérebro do rato na coluna de água, e limpe o transdutor com uma ponta do dedo para eliminar as bolhas de ar retidas.

4. Hematoencefálica Barreira Abertura com Microbolhas e ultra-som (BOMUS)

  1. Dar uma injecção intraperitoneal da solução de manganês a uma dose de 0,5 IP mmol / kg. Tapar o cateter intraperitoneal de modo que o manganês não flui para fora, e esperar 10 minutos para permitir que a distribuir (Figura 1).
  2. Para abrir o BBB, administrar 30 uL de lípido perflutreno microesferas (DEFINITY activado) através do cateter da veia da cauda, ​​e simultaneamente, inicia a sequência de impulsos de ultra-som. Continuar insonification durante 3 minutos.

5. Estimulação Neuronal

  1. Permitir que cerca de 40 minutos para os níveis cerebrais de Mn 2 + para estabilizar antes de iniciar a estimulação neuronal. Desta forma, o acessório de linha de base dramática devido à Mn 2 + difusão através da BHE pode ser distinguido do reforço diferencial subtil devido à estimulação. Em seguida, começam a estimulação com o seu paradigma de escolha (Figura 1).
  2. Para a estimulação das vibrissas, desligue o isoflurano e remover o cone do nariz. Mover pincel um artista mole manualmente com um movimento circular (1-5 Hz) através da matriz vibrissas a uma distância de aproximadamente 2-5 mm a partir da pele. Continuar a estimulação durante 90 min. O manganês tem um efeito sedativo que permite a estimulação descontrolada do animal. Se o animal torna-se agitado, administrar 5% de isoflurano através cone de nariz durante aproximadamente 15 segundos.

6. Magnetic Ressonância

  1. Após a estimulação, retomar a anestesia através de cone do nariz. Continuar a manutenção da temperatura do corpo e titulando o nível isoflurano a uma taxa respiratória de 85-125 respirações por minuto.
  2. Posicione o mouse em uma bobina de ressonância magnética e transferir para o aparelho de ressonância. Adquira 3D de alta resolução T 1 ponderados imagens de RM. Por exemplo, usar um gradiente 3D estragado recordar eco sequência (SPGR) com os seguintes parâmetros: tempo de repetição de 25 ms; tempo de eco de 2 ms; flip ângulo de 30 graus; largura de banda de 15,63 kHz; campo de visão de 20 × 20 × 12 mm; matriz de 128 × 128 × 60.

7. Análise de Imagem

  1. A análise de imagem é específico para o paradigma de estimulação utilizada. Para a experiência de estimulação vibrissas (Figura 2), importar as imagens a partir de vários animais em um ambiente de análise apropriado. Se alguns animais foram estimuladas, à direita, enquanto os outros foram estimulados no lado esquerdo, flip algum modo que todas as imagens são efetivamente "deixou-estimulado." Em seguida, para comparar o lado estimulado de cada cérebro para o seu lado contralateral não estimulada, criar um duplicado e espelhado deixou-não estimulada conjunto de imagem é criada. Registre todas as imagens para um espaço comum e, em seguida, alisá-los com um × 3 × 3 3 pixels kernel Gaussiano.
  2. Exportar os dados para um ambiente de análise matemática, tais como MATLAB. Opcionalmente, mascarar anatomia irrelevante para os conjuntos de dados. Intensidade de normalizar as imagens pelo método iterativo de Venot et al. 17,18.
  3. Usar uma emparelhadas, teste t de cauda única para comparar cada voxel dos lados estimulados de cada cérebro para o voxel correspondente contralateral nos lados não estimuladas de cada cérebro.
  4. Exibir o mapa valor de p resultante para identificar regiões de actividade diferencial (Figura 3).

8. Os resultados representativos

O método aqui apresentado tem dois fundos amental etapas: (1) Abertura BBB com Microbolhas e ultra-som (BOMUS) e (2) induzida por ativação Manganês-RM (AIM MRI). Porque o último passo depende do anterior, é importante verificar BOMUS implementação bem sucedida.

Perturbações da barreira sangue-cérebro após a administração de um T 1-encurtamento agente de contraste (tais como manganês ou um agente de gadolínio-based) resulta num aumento do sinal no parênquima cerebral em T 1-ponderada de imagem quando em comparação com cérebros em que BOMUS não foi executada (Figura 4). A distribuição de este acessório de manganês não é completamente uniforme, embora seja razoavelmente consistente entre animais. A distribuição não reflecte inomogeneidade apenas na abertura BBB, mas também é a distribuição não-uniforme intrínseca de Mn no interior do cérebro 19. A dinâmica espacial e temporal da abertura BBB ter sido ainda descrito anteriormente 12.

ent "> Uma vez BOMUS foi implementado com sucesso, o próximo passo é a realização de ressonância magnética AIM Muitos paradigmas experimentais é possível,.. no entanto, porque há muitos potenciais confunde, os controles e análises devem ser cuidadosamente concebidos efeitos de confusão incluem abertura BBB heterogênea, acumulação não homogénea de Mn no cérebro, dinâmica temporal de difusão Mn, e actividade neuronal inespecífica. Nesta demonstração, a resposta à estimulação neuronal unilateral do vibrissas foi mapeado. Para compensar as não homogeneidades e fluxo de Mn, o lado não estimulado de cada cérebro foi utilizado como um controlo interno. Para ter em conta para a actividade neuronal inespecífica que pode variar entre os animais, a análise estatística de teste utilizado para identificar regiões que foram consistentemente diferente entre os animais (Figura 2). Os resultados foram um mapa diferença tridimensional e um tridimensional valor de p-mapa (Figura 3), do lado direito do que indicou regiõesde maior sinal contralateral à vibrissas estimulada. O lado esquerdo do mapa indicam quais as regiões tinha sinal significativamente mais elevado ipsilateral à vibrissas estimulada. O mapa de valor de p identificou uma região larga de sinal elevada contralateral à vibrissas estimulado que correspondia ao campo barril do córtex sensorial primário, cuja resposta a estimulação vibrissas tem sido extensivamente documentado por electrofisiologia 20,21 e 2-desoxiglucose estudos. Uma discussão mais completa destes resultados foi publicada previamente 13.

A Figura 1
Figura 1. Protocolo cronograma de neuroimagem funcional com BOMUS e RM AIM (Adaptado de Howles et al. 13).

A Figura 2
Figura esquema da Análise 2. Para a identificação de regiões of intensidade diferente entre os lados estimuladas e não estimuladas de cada cérebro. Para comparar o lado estimulado de cada cérebro para o seu lado contralateral não estimulada, um duplicado e espelhado deixou-não estimulada conjunto de imagem é criada. Estas imagens são registadas, filtrada, e normalizada. Finalmente, no teste compara as imagens esquerda e deixou-estimuladas-não estimulada. O teste t é "emparelhado" de modo que o lado estimulado de cada cérebro é apenas comparado com o lado não estimulado do mesmo cérebro. O teste t é "de cauda única" de modo que um lado do mapa valor de p indica que o sinal significativamente mais elevado do lado estimulado do cérebro, enquanto o outro lado do mapa valor de p indica que o sinal significativamente mais elevado do lado não estimulado do cérebro (Adaptado de Howles et al. 13).

A Figura 3
Figura 3. Os resultados da análise combinada de 7 animais menos dois diferentes posições axiais. T ele primeira coluna mostra a média de todas as imagens registradas alinhados, de modo que efetivamente todos os ratos tiveram sua vibrissas esquerdo estimulado. Estas imagens são sobrepostas com um mapa de cor, indicando o aumento percentual média na sinal em cada voxel relativa ao hemisfério contralateral, como indicado pela barra de cores. Regiões coloridas sobre o lado direito da imagem mostram onde o hemisfério contralateral à estimulação tiveram maior do sinal. Regiões colorido no lado esquerdo da imagem mostram onde o hemisfério ipsilateral à estimulação tiveram maior do sinal. A segunda coluna mostra as mesmas imagens sobrepostas com o mapa de valor de p indicando a significância estatística do aumento do sinal. A terceira coluna apresenta o mapa valor de p mesmo sobreposto sobre as figuras correspondentes a partir da estereotáxico Paxinos atlas 16 com os campos de barril do córtex sensorial sombreada (adaptado de Howles et al. 13).

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Figura 4. Distribuição espacial de Mn 2 + no cérebro. As imagens foram adquiridas 170 min após a 0,5 mmol / kg IP de MnCl2 a partir de BOMUS-tratados (n = 5) e de controlo (n = 4) ratinhos. Após a normalização, média e mapas de desvio-padrão foram calculados (painel à esquerda). Enhancement foi maior nos ratos tratados com BOMUS. Embora este acessório não era uniforme em toda a cérebro, era razoavelmente consistente, excepto perto das bordas do cérebro e os ventrículos. Usando regiões de interesse (ROIs) desenhadas em torno de várias estruturas, o SNR média (+ 1 DP) foi calculado em cada grupo (painel direito). BOMUS animais tratados apresentaram maior SNR, mas também uma maior variância entre as estruturas e entre animais (Adaptado de Howles et al. 13).

A Figura 5
Figura 5. Para examinar os efeitos de tecido de BOMUS, os cérebros de ratinhos tratados com BOMUS foram fixadas, SEctioned a 500 - intervalos mM, e corados com hematoxilina e eosina. O número médio de extravasamento de glóbulos vermelhos vistas em cada secção do cérebro é mostrado para pressões acústicas de 0,36 MPa (n = 3), 0,52 MPa (n = 4), e 5,0 MPa (n = 1). As barras de erro mostram o erro padrão. O segundo painel mostra um exemplo de extravasamento de células vermelhas do sangue grave a partir do cérebro exposto a 5,0 MPa (adaptado de Howles et al. 12).

A Figura 6
Figura 6. Teste comportamental quantitativa foi utilizado para avaliar a actividade, excitação, e capacidade de resposta antes da anestesia, e 3 e 24 horas após a recuperação da anestesia. O sistema de pontuação, descrito anteriormente 12, foi baseada na bem estabelecida avaliação quantitativa do mouse comportamental desenvolvered por Irwin em 1968 22. O comportamento da média (± SEM) pontuação para o controlo (n = 3) e BOMUS (0,36 MPa) tratados (n = 8) Os animais é mostrado. Relativa à linha de base pré-anestesia, todos os animais mostram uma diminuição na pontuação comportamento de 3 horas após a anestesia, mas eles largamente recuperar até ao dia seguinte. Em cada ponto do tempo, não foi observada diferença entre os dois grupos, indicando que BOMUS não mensurável afetam o comportamento animal (Adaptado de Howles et al. 12).

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Discussion

Aqui, um método foi apresentado de forma não invasiva para a abertura do BBB por todo o cérebro de camundongo inteiro com ultra-som e microbolhas (BOMUS). Com a abertura BBB, Mn 2 + foi administrada e induzida por activação de manganês-RM (AIM MRI) foi usado para resposta de imagem neuronal a curta duração estimulação em ratinhos sedados.

Abertura BBB adequada foi obtida com uma pressão de pico negativo acústico de 0,36 MPa. Observação, esta é a pressão na superfície do couro cabeludo no centro do feixe de ultra-som. As medições do perfil do transdutor de elemento único de feixe indicam que a pressão acústica na borda do feixe é apenas cerca de 0,12 MPa. Subsequentemente, a atenuação através do crânio reduz a pressão atingir o cérebro por cerca de 25% (com base na redução de potência Choi et ai. 23 e ajustada para a frequência). Isto indica que a ruptura ocorreu no pico BBB-negativas pressões acústicas de 0,09 MPa (no centro do nosso feixe) A 0,03 MPa (no limite). Estas pressões são menores que os níveis (tipicamente 0,4-0,5 MPa) relatados em outros lugares 24. Este limiar de pressão reduzida pode ser devido à dose mais elevada de microbolhas lipídicos utilizados neste trabalho (aproximadamente 1,2 ml / kg) em comparação com os outros. Embora a dose de microbolhas usados ​​foi maior do que a dose recomendada de diagnóstico humano (10 uL / ​​kg), os efeitos negativos não foram observadas.

Conforme especificado aqui, a técnica não-invasiva e BOMUS é reversível, porém, ele tem o potencial para causar danos. Em trabalhos anteriores 12, os ratinhos tratados com BOMUS foram avaliados por danos histológico (Figura 5) e alterações comportamentais (Figura 6). Pico-negativas pressões acústicas de 0,36 MPa foram associados com observados efeitos negativos (Figura 6). No entanto, 0,52 MPa-BOMUS foram associados com um pequeno número de intracerebrais extravasamentos de glóbulos vermelhos em um subconjunto dos animais (

Assim como a técnica BOMUS é potencialmente prejudiciais, o manganês também tem bem conhecida toxicidade 25. Mn 2 + é conhecido por ter efeitos tóxicos sobre a junção neuromuscular 26 e do sistema nervoso 27. Esta toxicidade é provavelmente responsável para a sonolência dos ratinhos após a administração, embora o mecanismo para este efeito é desconhecido. Durante aproximadamente os primeiros 60 minutos de estimulação, o rato permanece um pouco sonolento, mas ainda responsivo a estímulos dolorosos, tais como uma pitada dedo do pé. Isto permite que o rato para tolerar a estimulação sem a necessidade de restrição física. Na nossa experiência, este sonolência é adequado para cerca de 60 minutos após o que o animal pode tornar-se agitado. Contenção química adicional pode ser umchieved conforme necessário com cerca de 15 segundos de 5% de isoflurano através nosecone. Nesta demonstração, a sonolência facilitou a estimulação do vibrissas, no entanto, pode também ter reduzido a resposta neuronal no córtex barril.

Além de simplesmente administrando Mn 2 +, a técnica BOMUS pode ser usado para administrar globalmente outros agentes de diagnóstico ou terapêuticos. Em trabalhos anteriores, BOMUS tem sido utilizado para administrar Gd-DTPA, um agente de contraste para IRM, para o cérebro. 12 Não obstante, há muitas questões sobre a natureza do permeabilidade da BHE conseguido com BOMUS. Em primeiro lugar, não é claro o que os agentes de tamanho são capazes de atravessar a BBB após BOMUS. Ambos Mn 2 + e Gd-DTPA (500 Da) são moléculas relativamente pequenas. Em segundo lugar, não é claro o quanto a permeabilidade da BHE varia ao longo do cérebro. Em terceiro lugar, não é claro se a abertura BBB é um efeito relativamente binário, ou se os parâmetros de abertura certos pode afectar o tamanho ou a taxa de materialpermeação. Apesar de Gd-DTPA distribuídos de forma bastante equilibrada através do cérebro no estudo acima, pode ter sido muito pequena e muito difusível para revelar as diferenças de permeabilidade.

Apesar destas incertezas em relação à BOMUS, o método é eficaz para administrar rapidamente Mn 2 + com a finalidade de AIM-MRI. AIM-RM tem sido utilizado em ratinhos para mapear resposta neuronal a longo prazo de estimulação (1-2 dias) em ratinhos 28-30, mas com esta nova abordagem, as experiências de curto prazo de estimulação são agora possíveis. Anteriormente, a administração rápida de Mn 2 + só era possível com perturbações BBB osmótica usando uma infusão intracarotídeo de manitol hipertónica. Esta abordagem foi apenas prático em ratos e animais de grande porte, mas mesmo em ratos, esses estudos foram limitados pela capacidade de invasão e unilateralidade da técnica. Porque BOMUS pode ser realizada de forma não invasiva, a estimulação acordado e estudos longitudinais devem agora ser possível. Além disso, becausar Mn 2 + pode ser administrado a ambos os hemisférios cerebrais, uma gama mais ampla de paradigmas de estimulação são possíveis. Na demonstração acima, a administração bilateral Mn 2 + permitiu o hemisfério não estimulada para actuar como um controlo interno, de modo que a resposta neuronal a estimulação não específica de fundo podia ser separada a partir da resposta à estimulação vibrissas unilateral.

Além de controlar para estimulação não específica de fundo, o hemisfério não estimulada também foi utilizada para controlar a homogeneidade e consistência da administração de manganês. Como visto em outros manganês melhorada, experiências de ressonância magnética 19, os dados de distribuição (Figura 4) indicam que a técnica BOMUS não fornece uma melhoria homogénea do cérebro. Assim, sem controles adequados (os animais de controle ou de um hemisfério não estimulada), as regiões com maior aumento de linha de base são difíceis de distinguir de regiões cujos elementosvada sinal é devido à atividade neuronal.

Embora a linha de base Mn 2 + valorização não é homogênea, o padrão é bastante consistente entre os indivíduos. No entanto, pequenas variações na linha de base este acessório pode obscurecer o sinal AIM-RM. Nesta demonstração, abordamos este problema potencial pela média do sinal AIM-RM sobre vários animais. Alternativamente, as diferenças na valorização inicial poderia ser explicada pela aquisição de pré-estimulação imagens.

O método aqui apresentado requer análise de imagem substancial estatística, que por sua vez, requer de alta-fidelidade de registo de imagem. Claro, esse registo só é significativa se a fonte de dados é adquirido com uma resolução (em todas as três dimensões) que seja suficientemente mais finas do que as estruturas de interesse. Nesta demonstração, imagens em 3D foram adquiridos com voxels isotrópicos quase cerca de 160 mícrons em cada dimensão, o que permitiu uma excelenteregistro anatômico. No entanto, registro de imagens pode limitar a resolução espacial deste método, um registro incorreto ligeira Could média-out regiões muito pequenas de acessório. As lâmpadas cerebelo e olfativo pode ser particularmente difícil de se registrar, porque eles têm um acessório finamente em camadas e são muitas vezes fora de alinhamento com o cérebro.

Aqui, apresentamos um método para o mapeamento de resposta neuronal a estímulos de curta duração em camundongos acordados. Embora não seja simples, o método é relativamente prático e acessível. Esta discussão detalhada sobre as limitações e as sutilezas deve esperamos que o leitor possa aplicar a técnica a suas próprias questões experimentais.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Todo o trabalho foi realizado no Centro de Duque de Microscopia Na Vivo, uma NIH / NIBIB nacional Biomédica Technology Resource Center (P41 EB015897) e NCI Pequenos Animais do Programa de Recursos Imaging (U24 CA092656). Apoio adicional foi fornecido a partir de NSF Graduate Research Fellowship (2003014921).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hydrophone Sonora Medical Systems, Longmont, CA SN S4-251
Translation stage Newport Corporation, Irvine, CA
Ultrasound transducer Olympus NDT, Inc., Waltham MA A306S-SU Review the manufacturer's test sheet that accompanies the transducer to find the exact center frequency of that particular transducer, which may differ from the nominal frequency listed in the catalog. (e.g., the nominal frequency of our transducer was 2.25 MHz, but the actual center frequency was 2.15 MHz.)
Vevo Imaging Station VisualSonics, Inc. Toronto, Canada
50 dB power amplifier E&I, Rochester, NY model 240L
Signal generator Agilent Technologies, Santa Clara, CA model 33220A
MnCl2-(H2O)4 Sigma Molecular weight varies by batch, call manufacturer for exact measurement
Perflutren lipid microspheres Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA DEFINITY
Microsphere agitator Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA VIALMIX
MR imaging coil m2m Imaging Corp., Hillcrest, OH 35 mm diameter quadrature transmit/receive volume coil
MRI system GE Healthcare, Milwaukee, WI GE EXCITE console operating a 7-T horizontal bore magnet
Image analysis environment Visage Imaging, San Diego, CA, MathWorks, Natick MA Amira MATLAB

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