Las formulaciones para la liofilización de las bacterias y su influencia en la supervivencia celular

Biology

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Summary

La liofilización es a menudo una manera fácil y conveniente de obtener productos secos de células bacterianas viables. Un problema del proceso es la supervivencia celular. Nos detalle aquí un procedimiento para investigar cómo la supervivencia celular durante la liofilización está influenciada por las propiedades de la formulación utilizada.

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Wessman, P., Håkansson, S., Leifer, K., Rubino, S. Formulations for Freeze-drying of Bacteria and Their Influence on Cell Survival. J. Vis. Exp. (78), e4058, doi:10.3791/4058 (2013).

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Abstract

Agua celular se puede quitar para inactivar microorganismos reversible para facilitar el almacenamiento. Uno de tales métodos de eliminación es la liofilización, que se considera un método de deshidratación suave. Para facilitar la supervivencia celular durante el secado, las células se formulan a menudo de antemano. La formulación forma una matriz que incorpora las células y los protege de diversas tensiones perjudiciales impuestas a las células durante la congelación y el secado. Se presenta aquí un método general para evaluar la tasa de supervivencia de las células después de la liofilización y que se ilustra mediante la comparación de los resultados obtenidos con cuatro formulaciones diferentes: la sacarosa, el disacárido sacarosa polímero derivado de Ficoll PM400, y los respectivos polisacáridos hidroxietil celulosa (HEC ) e hidroxipropil metil celulosa (HPMC), en dos cepas de bacterias, P. putida KT2440 y A. A6 chlorophenolicus. En este trabajo se ilustra cómo preparar formulaciones para la liofilización y cómo investigar la mecánicaismos de la supervivencia celular después de la rehidratación mediante la caracterización de la formulación utilizando de calorimetría diferencial de barrido (DSC), mediciones de tensión superficial, análisis de rayos X, y la microscopía electrónica y en relación a los datos de las tasas de supervivencia. Los polímeros se eligen para obtener una estructura monomérica del respectivo polisacárido sacarosa se asemeja a un mayor o menor grado. El uso de este método de instalación que mostramos que los polímeros pueden apoyar la supervivencia de las células tan eficazmente como disacáridos si ciertas propiedades físicas de la formulación son controlados 1.

Protocol

1. El cultivo y la cosecha de P. putida

  1. Preparar un cultivo iniciador de Pseudomonas putida mediante la inoculación de 100 ml de caldo de soja tríptico (TSB) con una colonia de P. células putida cultivadas en agar suplementado con caldo de soja tríptico (TSA). Mantener el cultivo a 30 ° C en un tablero de agitación fijado en 130 rpm.
  2. Después de 7 h transferir una alícuota del cultivo iniciador equivalente a 1/10 del volumen final del cultivo principal a la TSB-medio fresco. Mantener las células a 30 ° C en un tablero de agitación a 130 rpm durante 16 horas.
  3. Después de 16 h de crecimiento de las células se recogen por centrifugación del cultivo celular a 1500 xg durante 20 min a TA. Decantar el sobrenadante y lavar las células mediante re-suspensión del sedimento celular se encuentra en una solución de NaCl que es isotónica con el medio de crecimiento. En este caso se utilizó una solución de NaCl 150 mM. Las células se centrifugan una vez más y se decanta el sobrenadante antes de resuspender las células en el medio de formulación,véase el paso 3.2.

2. El cultivo de otras especies

  1. Para adaptar el protocolo a otras especies bacterianas los procedimientos de cultivo y la cosecha deben ser cambiados de acuerdo a los requerimientos de esa especie. Para evitar el choque osmótico al manipular las células durante la cosecha y la etapa de lavado (s), la osmolalidad de las soluciones debe coincidir con la del medio de crecimiento en la cosecha.

3. Formulación de las células

  1. Preparar las soluciones de formulación pesando los componentes de la matriz respectivas y disolverlos en agua. Para lograr condiciones isotónicas, o bien ajustar la cantidad de excipiente o añadir NaCl o algún otro soluto compatible celular para llegar a la osmolalidad deseada. Para las sustancias de bajo peso molecular, tales como disacáridos las cantidades se pueden ajustar fácilmente para llegar a condiciones isotónicas. En sustancias como polímeros que son de alto peso molecular, la tonicidad tiene que ser ajustado con células compatibles por lolaúdes, por ejemplo, NaCl o disacáridos. Tenga en cuenta que cualquier adición de una sustancia influirá en las propiedades físicas de la formulación, que a su vez puede influir en el comportamiento de la liofilización y la supervivencia celular.
  2. Decantar la solución de lavado (en este caso NaCl) y volver a suspender las células en los respectivos medios de formulación.
  3. Asegúrese de que las células se dispersan homogéneamente. Las formulaciones de baja viscosidad se agitaron mientras que las formulaciones de viscosidad más altos se mezclan usando añadiendo, por ejemplo., Una barra de agitación y agitar el recipiente hasta que se logra una mezcla homogénea.
  4. Divida las formulaciones en viales de congelación de pelo. Los viales se deben pesar vacío, con la muestra antes y después de secado por congelación para calcular la cantidad de agua eliminada durante la liofilización.
  5. Añadir tapones de goma de los viales si los viales deben ser sellados en el interior del liofilizador, consulte el paso 4.3.
  6. Enumerar las células en cada formulación antes de la liofilización, consulte el paso 6.
  7. </ Ol>

    4. La liofilización

    1. Las condiciones de secado por congelación se tienen que ajustar a las propiedades físicas de la formulación. El parámetro más importante es en este caso la temperatura de transición vítrea, Tg, de la formulación, denota Tg 'para la muestra de congelación y concentrada para indicar que el agua está todavía presente. La Tg 'de la formulación de congelación-concentrada se mide fácilmente utilizando calorimetría de barrido diferencial (DSC), véase el paso 7.
    2. Ajustar los parámetros del proceso de liofilización de manera que la temperatura de la muestra es siempre por debajo de la Tg de la muestra y que la presión de la cámara permite una rápida sublimación del hielo, es decir, el secado primario, y el agua residual en la formulación, es decir, secundaria secado. Si la temperatura de la muestra está por encima de Tg 'durante el proceso de secado hay un gran riesgo de colapso estructural de la muestra lo que puede disminuir significativamente la supervivencia celular.
    3. Para proteger los productos secos después de freeze-secado de la atmósfera de la muestra tiene que ser controlado. Si es posible, sellar las muestras en el secador por congelación antes de que el vacío se libera al final del ciclo de secado por congelación. Alternativamente, los frascos se pueden llenar con una atmósfera preferida. Es importante evitar la exposición de las muestras a las condiciones ambientales como la humedad o el oxígeno presente en la atmósfera de almacenamiento se influye en la supervivencia de las células.
    4. Pesar los viales.

    5. Rehidratación

    1. Rehidratar las muestras con agua desionizada y estéril. La cantidad de agua que debe añadirse debe ser la misma que la cantidad eliminado durante la liofilización y se calcula a partir del peso del vial vacío, el mismo vial con la muestra antes y después de la liofilización. Vortex las muestras una y otra vez hasta que las soluciones a continuación, aparece homogénea.

    6. Enumeración

    1. Dibuje 100 l de cada muestra y hacer diluciones en serie de 10 veces. A partir de las diluciones de integración100 l resto se siembra en placas de TSA. Las placas se incubaron a la temperatura y el tiempo requerido.

    7. Caracterización de la formulación de comportamiento de la congelación

    1. Tomar una pequeña cantidad, 5 a 10 mg, de la muestra y encerrarlo en una sartén DSC-aluminio con tapa. Prepare un recipiente vacío como referencia.
    2. Establecer el programa de análisis de temperatura DSC. El programa de enfriamiento está configurado para imitar la etapa de congelación en el programa de secado por congelación. Esto se hace como la cinética de enfriamiento pueden influir en la Tg 'de las formulaciones hidratadas. Antes de la exploración de calefacción comienza a reducir la temperatura por debajo de la Tg esperado "de las formulaciones investigadas, normalmente -100 ° C.
    3. Elija un tipo adecuado de calentamiento, normalmente una velocidad de calentamiento de 5 - 40 º C / min se utiliza. La señal de flujo de calor registrada se expresa en vatios y se verá influido por la velocidad de calentamiento. A mayor velocidad de calentamiento dará una señal más grande de Tg.
    4. Ajuste el rango de temperatura de manera que it cubre tanto Tg 'y el derretimiento de la formulación.

    8. Las mediciones de tensión superficial de las formulaciones hidratadas

    1. El montaje experimental usado en este experimento es de acuerdo con el método du Noüy para medir la superficie.
    2. Limpie el anillo de platino y el recipiente de medición con cuidado. El recipiente se enjuagó con acetona, se secó con un paño libre de pelusa, y luego quemada en el interior con una llama incolora. El anillo se ilumina en rojo en una llama incolora.
    3. Llene el recipiente con la solución y deje que la superficie resolver antes de medir. Para las soluciones que se alcanza el estado de equilibrio sólo después de un largo tiempo, por ejemplo, polímeros, la sencilla configuración utilizada aquí proporcionarán datos cualitativos.
    4. Para las formulaciones con altas viscosidades, por ejemplo soluciones de 2% (w / w) de HEC o de HPMC, la tensión superficial tiene que ser medido en soluciones de concentraciones más bajas y luego extrapolada. Esto se puede hacer tomando ventaja del hecho de quela caída en los niveles de tensión superficial frente a concentraciones por debajo de 0,5% (w / w).

    9. Análisis de rayos X de las formulaciones secas

    1. Tomar una pequeña cantidad de matriz / bacterias y cargarlo en un soporte de muestras.
    2. Monte el soporte de la muestra en el X-ray-difractómetro.
    3. Para analizar cualquier fase cristalina presente en la muestra el paquete de programas de Bruker EVA se puede utilizar.

    10. Microscopía Electrónica

    1. Tomar una pequeña cantidad de matriz / bacterias de los viales y fijarlo en un talón SEM.
    2. Cargar el titular de SEM en el dispositivo de recubrimiento por pulverización catódica (Thermo Polaron VGScientific SC7640 utilizado en el presente trabajo) y la capa de la muestra con unos pocos nm de Au / Pd o Pt. En estos experimentos, los parámetros de pulverización fueron: 1900 V, 20 mA y 20 segundos, para un ~ 5-10 nm recubrimiento Au / Pd. El recubrimiento reduce la carga eléctrica durante la adquisición de imagen. Se recomienda comenzar con una capa fina y, si persiste la carga y hace que la imagenartefactos, la muestra deben estar recubiertos de nuevo.
    3. Cargar el titular de SEM en la cámara de SEM. Seleccione los parámetros de imagen correspondientes. Para el instrumento utilizado en la Figura 2 (FEI Strata DB235), se utilizó 5 kV de voltaje de aceleración, tamaño de spot 3, una distancia de trabajo de 5 mm y el detector de electrones secundarios.
    4. Opcionalmente, es posible utilizar el haz de iones enfocado para cortar secciones transversales de las bacterias incrustadas en el polímero para revelar más detalles.

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Representative Results

La Tabla 1 muestra los datos sobre la composición de la formulación, eventos térmicos registrados por DSC durante el calentamiento de las formulaciones congeladas, la estructura de las muestras secas y la tensión superficial de las soluciones de formulación. La Tg 'de sacarosa se ​​ha determinado a -40 ° C 2, 3 y puede ser difícil de detectar para concentraciones de sacarosa inferior al 20% w / w. El evento térmico a -35 ° C está probablemente relacionado con la aparición de la disolución de hielo 2. La estructura cristalina detectado por rayos X en la muestras de HPMC y HEC y también se observa en SEM (véase la Figura 2b y 2c) se superponen con la forma cristalina normal de NaCl.

Figura 1A muestra los datos de supervivencia para el P. Gram-negativas putida y la A. Gram-positivas chlorophenolicus formulados en las diferentes formulaciones a base de sacáridos. Tenga en cuenta que la tendencia en lo bien que las formulaciones apoyar la supervivencia celular es el mismo para both especies de bacterias. La trama se muestra en la Figura 1B ilustra la correlación entre la supervivencia de la liofilización y las tensiones superficiales de las formulaciones.

La Figura 2 muestra imágenes SEM-de las formulaciones secas. Para los cuatro polímeros que se muestran aquí, la matriz formada tiene la apariencia de "papel quebradizo": sábanas suaves interconectados en el que las bacterias incrustadas y aparecen como ondulaciones. Para Ficoll y sacarosa, las hojas son de aproximadamente 1 m de espesor y de 10 - 20 micras de ancho, con Ficoll que tiene una superficie más lisa. HPMC y HEC forman láminas mucho más finas, posiblemente debido al hecho de que la cantidad de polímero es menor en estas formulaciones a base de celulosa que en los otros (Tabla 1). Por otra parte, se observaron cristales de sal para HEC y HPMC, con este último muestra una mayor cantidad de precipitados en la superficie de las láminas de polímero. Las bacterias se ven más fácilmente en las formulaciones a base de celulosa debido a que las hojas son thinterior. En sacarosa y Ficoll, que son en su mayoría observaron como ondulación de las superficies lisas de otro modo.

Composición de la formulación Eventos térmicos detectados en las formulaciones congeladas Estructura de la formulación seca La tensión superficial de las formulaciones sin secar (mN m -1)
10% de sacarosa inicio de la disolución de hielo, -35 ° C sacarosa amorfa 72 ± 0,1
10% de Ficoll, 150 mM de NaCl T g ', -22 ° C Ficoll amorfa 68 ± 0,3
2% de HEC, 150 mM de NaCl eutéctico de fusión de hielo y NaCl, -28 ° C amorfa HEC, NaCl cristalino 64 ± 0,6
2% de HPMC, 150 mM de NaCl eutéctico de fusión del hielo y NaCl, -27 ° C 52 ± 0,8

Tabla 1. La composición de las diferentes formulaciones y propiedades de las formulaciones acuosas o en seco. Las concentraciones de polímero de HEC y la HPMC fueron máxima para conseguir una cubierta de matriz lo suficientemente gruesa como de las bacterias, pero todavía tienen una solución viable en lo que respecta a la viscosidad.

Figura 1
Figura 1. A) Las tasas de supervivencia de liofilizado P. putida (blanco) y A. chlorophenolicus (gris) cuando se formulan en soluciones basado en el disacárido sacarosa o los polímeros de Ficoll, HEC y HPMC, B) Correlación entre la supervivencia celular después de la liofilización y la tensión superficial de las formulaciones sin secas.

La figura 2
Figura 2. Imágenes de SEM de P. putida en cuatro formulaciones diferentes: a) sacarosa, b) Ficoll, c) de HEC, d) HPMC. Las bacterias son difíciles de ver en a) y b) porque la lámina de polímero son muy gruesas y puede envolver a la bacteria por completo, y en c) yd), las bacterias se presentan de manera más prominente en la superficie. En d), que se pueden distinguir de la gran cantidad de sal precipitados debido a su forma y el contraste, tal y como aparecen como oblongos, corpúsculos oscuros.

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Discussion

El motivo de este estudio fue investigar algunas propiedades de formulación que puedan ser de importancia para la supervivencia celular durante la liofilización. Aunque la tolerancia intrínseca secado varía entre las diferentes especies, como se ilustra en la Figura 1A, la tendencia de qué tan bien la diferente supervivencia de las células de soporte formulaciones es similar. Es informativo para comenzar con una comparación de la sacarosa y Ficoll. Se cree que un factor clave para una formulación para apoyar la supervivencia celular es la capacidad de la formulación de ingrediente (s) para reemplazar el agua durante la deshidratación, manteniendo así la estructura de las proteínas y las membranas de la célula también en el estado seco. Disacáridos tales como sacarosa, pero también trehalosa mostrar este inmueble, mientras que los polímeros como el almidón de polisacárido no 5,11. Los polímeros se consideran demasiado grandes para interactuar con los lípidos de la membrana en la misma manera que los disacáridos. Otra propiedad importante para el éxito de secado por congelaciónción de microorganismos es la capacidad de la matriz de soporte para vitrificar (es decir, se convierten en sólidos amorfos.) durante la liofilización. La estructura amorfa es beneficioso para el blindaje y mantener las células separadas. Curiosamente, ambos disacáridos y polímeros vitrificar fácilmente si el secado por congelación se lleva a cabo correctamente. Nuestros resultados muestran que tanto la sacarosa y formulaciones a base de Ficoll se convierten amorfo después de la liofilización, véase la Tabla 1, y la supervivencia celular apoyo igualmente bien. Sin embargo, hay diferencias significativas entre los dos sacáridos. En contraste a la sacarosa, la molécula de Ficoll es, con un peso molecular de 400 kDa, demasiado grande para reemplazar el agua en las interacciones con las membranas lipídicas durante el secado por congelación 4, 5. Además, como las moléculas de Ficoll se prohibió desde el espacio periplásmico de las bacterias Gram negativas, de nuevo debido a su tamaño 6, la captación celular de Ficoll es poco probable. En base a esto, se sugiere que el efecto protector disposicionesded por la formulación de sacarosa no se debe principalmente a la captación celular del disacárido, importante para la capacidad de sustitución de agua de las estructuras intracelulares 7, 8. Más bien, la capacidad de Ficoll para apoyar la supervivencia de las células tiene que ver con propiedades comunes tanto a la formulación de Ficoll y sacarosa, por ejemplo, la estructura amorfa.

Centrándose en los polímeros, es evidente a partir de la Figura 1A que la capacidad de las formulaciones de polímeros para apoyar la supervivencia de las células varía. El análisis de rayos X mostró que el NaCl cristalizado durante la liofilización y coexistía con la estructura amorfa de otro modo de las formulaciones de HEC y HPMC. No se detectó material cristalino en la formulación basada en Ficoll. NaCl puede formar complejos con los restos hidroxilo en hidratos de carbono 9, 10. En las formulaciones de Ficoll y HEC-basado del NaCl al hidroxilo relación molar fracción fue 1:11 y 1:01, respectivamente, lo que explica por qué no se detectó la cristalizaciónen la formulación de Ficoll-basado. También se observó la separación de fases entre NaCl y los polímeros de celulosa en la DSC-investigaciones. Un eutéctico de fusión se registró durante el calentamiento de la HEC congelado y HPMC-formulaciones que indica que la separación de fases se lleva a cabo en el estado congelado. La morfología y microestructura de la formulación se revela por imágenes SEM (Figura 2) y corrobora el DSC y datos de rayos-X. Las células bacterianas se ven sobresaliendo de las hojas con depositan cristales de NaCl claramente visibles en la superficie de las hojas de HEC-. En base a la similitud entre las tasas de supervivencia para las bacterias formuladas en las soluciones de HEC-solución de Ficoll y en comparación con HPMC llegamos a la conclusión de que el estado de la sal, si dispersa en forma de cristales o disuelto en el polímero, no se correlaciona con la supervivencia celular. En lugar de la supervivencia celular muestra una relación con la tensión superficial de las formulaciones, véase la Figura 1B. Para más bajas tensiones superficiales, llas tasas de supervivencia ower se registran para las bacterias. Tenga en cuenta sin embargo, que la tensión superficial medida muestra la interacción entre los solutos, es decir, sacarosa y los polímeros, y la molécula de disolvente. Aún así, permite una especulación indirecta de que la actividad superficial de los polímeros puede estar relacionado con su tendencia a interactuar también con las superficies de las células de una manera desestabilizadora. A medida que la concentración de los solutos aumenta durante la congelación, los efectos negativos pueden ser potenciados explicar por qué no se observa el efecto negativo de los polímeros de superficie activa sólo cuando el almacenamiento de las bacterias en las formulaciones hidratantes completamente.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

El trabajo fue apoyado por la Fundación Sueca para la Investigación Estratégica Ambiental (MISTRA) a través del programa de DOM y Grant 211684 (BACSIN) del Programa Marco de la Unión Europea Comunidad 7PM. Damos las gracias a J. Engstrand de asistencia en la filmación del análisis de rayos X y L. Tang por su ayuda en la narrativa conceptual.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ficoll PM 400 GE-healthcare 17-0300-10
HEC (Natrosol-M Pharm Grade) Ashland Gift from Ashland
HPMC (Methocel F4M) Dow Gift from the Department of Pharmacy, Uppsala University
Sucrose Sigma-Aldrich S2395
NaCl Sigma-Aldrich 71376
Tryptic Soy broth Merck 105459
Tryptic Soy Agar Merck 105458
Lyostar II FTS Kinetics N.A.
Pyris Diamond DSC Perkin-Elmer N.A.
Bruker AXS SMART CCD 1k Diffractometer Bruker N.A
Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM FEI N.A
Krüss Educational Tensiometer Krüss N.A.

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References

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