Funktionelle Bildgebung Brown Fat in Mäusen mit FDG micro-PET/CT

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Summary

Verfahren zur funktionellen Bildgebung von Maus braunen Fettgewebe (BAT) beschrieben, bei dem kalte-stimulierte Aufnahme von 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT nichtinvasiv beurteilt mit einer standardisierten micro-PET/CT Protokoll ist. Diese Methode ist robust und sensibel auf Unterschiede in der BAT-Aktivitäten in Maus-Modellen erkennen.

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Wang, X., Minze, L. J., Shi, Z. Z. Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT. J. Vis. Exp. (69), e4060, doi:10.3791/4060 (2012).

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Abstract

Braunem Fettgewebe (BAT) von weißem Fettgewebe (WAT) durch seinen diskreten Ort und einem braun-rote Farbe aufgrund reiche Vaskularisierung und hohe Dichte von Mitochondrien. BAT spielt eine wichtige Rolle im Energie-Ausgaben und nicht zitternd Thermogenese bei neugeborenen Säugetieren sowie den Erwachsenen ein. BAT-vermittelten Thermogenese ist stark von der sympathischen Nervensystems reguliert, überwiegend über β-adrenergen Rezeptor 2, 3. Jüngste Studien haben gezeigt, dass BAT Aktivitäten im menschlichen Erwachsenen negativ mit einem Body Mass Index (BMI) und anderen diabetischen Parametern 4-6 korreliert. BAT hat damit als potenzielles Ziel für anti-obesity/anti-diabetes Therapie, die auf Modulation der Energiebilanz 6-8 vorgeschlagen worden. Während mehrere kalte Herausforderung basierenden Positronenemissionstomographie (PET) Verfahren zum Nachweis von menschlichen BAT 9-13 eingerichtet sind, es im Wesentlichen kein standardisiertes Protokoll für die Bildgebung und quantifendungsbe der BAT in kleinen Tiermodelle wie Mäuse. Hier beschreiben wir eine robuste PET / CT-Bildgebung Methode zur funktionellen Beurteilung der BVT in Mäusen. Kurz gesagt, waren erwachsene C57BL/6J-Mäuse kalt unter nüchternen Bedingungen für eine Dauer von 4 Stunden behandelt, bevor sie eine Dosis von 18 F-Fluorodeoxyglucose (FDG) erhalten. Die Mäuse wurden in der Kälte für eine zusätzliche Stunde post-FDG Injektion blieb, und dann gescannt mit einem kleinen Tier-dedizierten micro-PET/CT System. Die erworbenen PET-Bilder wurden mit der CT-Bilder für anatomische Referenzen Kooperationen registriert und analysiert FDG im interskapularen BAT Bereich BAT Aktivität präsentieren. Diese standardisierte kalt-Behandlung und bildgebende Protokoll wurde durch Testen BAT Aktivitäten wurden in pharmakologischen Interventionen validiert beispielsweise die unterdrückte BAT Aktivierung durch Behandlung der β-Adrenozeptor-Antagonist Propranolol 14, 15 oder der erweiterten BAT Aktivierung durch β3-Agonist BRL37344 16. Das Verfahren described hier zum Auffinden von Wirkstoffen / Verbindungen, die BAT-Aktivität modulieren, oder Gene / Wege, die in BAT Entwicklung und Regulation in verschiedenen präklinischen und grundlegende Studien beteiligt zu identifizieren angewendet werden.

Protocol

Ein. Tierische Vorbereitung und Kältebehandlung

  1. Suchen und untersuchen Sie ein 4 ° C kalten Raum, der für die Aufnahme von Labormäusen genehmigt wurde.
  2. Pre-chill Tierkäfige Nacht im Kühlraum. Die Käfige werden ohne Futter und Einstreu, aber mit einer Flasche Wasser montiert.
  3. Am Morgen des experimentellen Tag, Ort Mäuse einzeln in jedem der vorgekühlte Käfigen bei 30 min Intervallen. Jeder einzeln eingesperrt Maus sollte in der kalten Raum für fast 4 Stunden bleiben, bevor es um die Imaging-Labor transportiert wird. Sicherstellen, dass die Mäuse, aber mit Zugang zu Wasser Fasten.
  4. Bei 4 Stunden nach der Kältebehandlung Transport eines Tieres in einer Zeit alle 30 min zur Bildgebung Lab. Dies kann durch Füllen eines Behälters mit Styropor Eis und Platzieren einer vorgekühlten Gehäusekäfigs auf der Oberseite der Eis im Inneren der Schachtel erreicht werden kann. Locker den Deckel auf dem Styropor-Box.

2. Setup Micro-PET/CT Imaging-Workflow

  1. CT Acquisition: Bei einer Ganzkörper-CT-Scan, stellen Strom bei 500 uA, Spannung am 80kV, Belichtungszeit bei 200 ms und 240 Schritte für 240 °-Drehung. Für X-ray-Detektor, wählen Auflösung bei "low-System Vergrößerung" mit 78 mm axial Bildfeld und Einzelbett Modus. Wählen Sie "real time Wiederaufbau" mit dem "Common Cone-Beam Reconstruction"-Methode, so dass die Host-PC Gespräche mitein dediziertes Echtzeit Wiederaufbau Computer (Cobra), um die Aufgabe zu initiieren.
  2. PET Emission Acquisition: Set 600 Sek. (10 min) für "fixed Scan-Zeit" in der "Erwerb durch die Zeit"-Option. Wählen Sie F-18 als "Studie Isotop" und verwenden 350-650 keV als "Energie".
  3. PET Emission Histogramm: Set "dynamische frame" als "schwarz" Daten zu verarbeiten als ein Rahmen für die gesamte Dauer zu statischen Scan zu erreichen. Wählen Sie "3D", wie das Histogramm Art und wählen Sie "keine Streukorrektur".
  4. PET Reconstruction: Verwenden Sie 2D-geordnete Teilmenge Erwartungsmaximierung (OSEM2D) als Rekonstruktionsalgorithmus.

3. Die Injektion von FDG

  1. Bestellen Sie eine klinische Paket von 18 F-FDG (10 mCi) von einem regionalen Anbieter für seine Ankunft in der Imaging Lab ~ 30 min vor dem geplanten ersten Injektion. Folgen des Instituts Sicherheitsverfahren zu empfangen und zu überblicken das Paket mit radioaktiven Materials (RAM).
  2. Mit dem Schutz von einem L-Block Tischplatte Schild, Aliquot der FDG und machen Verdünnungen mit sterilem Kochsalzlösung zur Verfügung gestellt. Die verdünnte Aktivitätskonzentration von FDG sollte bei 200-300 μCi/100 ul für jede Injektion verfügbar. Zeichnen Sie die FDG-Lösung in eine 1 ml Spritze mit 26G 1/2 inch Nadel, und messen die Radioaktivität des gesamten Spritze mit einer Dosiskalibrator.
  3. Spritzen Sie das Tier, das gerade aus dem kalten Raum (siehe Schritt 1,4) mit 100 ul FDG-Lösung über die intraperitoneale (ip) Weg transportiert wird. Notieren Sie sich die Einspritzzeit. Messen Sie den Rückstand Radioaktivität der Spritze wieder mit dem Dosiskalibrator.
  4. Legen Sie das Tier zurück in den kalten Käfig in einem Styropor-Kühler mit Eis gehalten. Inkubieren das Tier in kaltem (~ 4 ° C) für 1 Stunde für FDG.
  5. Berechnen des injizierten FDG Aktivität für jede Maus durch die folgende Formel:
    Injizierten Aktivität (Ci) = Aktivität in der Spritze vor der Injektion- Aktivität in der Spritze nach der Injektion

4. Micro-PET/CT Imaging

  1. Die micro-PET/CT Bildgebung beginnt 1 Stunde nach der FDG Injektion oder 5 Stunden nach der Kältebehandlung. Legen Sie das Tier in einer Narkose Kammer mit 3% Isofluran in Sauerstoff.
  2. Sobald Anästhesie induziert wird, wird das Tier auf eine Mikro-CT Pellet (Tierbettes) mit seinem Kopf ruht in einem Kegel Gesichtsmaske, die kontinuierlich liefert Isofluran (2%) mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 L / min bewegt. Eine elektrische Heizkissen (BioVet, m2m Imaging Corp) wird unter das Tier gelegt zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur.
  3. Schieben Sie das Tier zum Eingang des MM-Scanner, aktivieren Sie die "Laser"-Symbol in der Symbolleiste, und verwenden Sie das Touchpad-Steuerung, um das Bett zu bewegen, so dass die Brust des Tieres ist an der Kreuzung der horizontalen und vertikalen Laserlinien. In der "Laser ausrichten"-Fenster wählen Sie "ersten Scan-Typ" als CT-Scan und "PET Akquisition im Workflow enthalten" als option.
  4. Öffnen Sie die "Scout View"-Fenster und erwerben ein Scout view Röntgenaufnahme. Verwenden IAW, um die Position des Tieres Bett einzustellen, so dass das Zentrum des Sichtfeldes CT in der Mitte der Maus Körper (Leber) befindet. Wiederholen Sie diesen Schritt, falls erforderlich.
  5. Starten Sie den "Workflow" in Schritt 2 eingerichtet. Wenn Optionen auftauchen, wählen Sie eine entsprechende 3D-PET-CT Transformationsmatrix Datei in CT-Rekonstruktion verwendet werden, und wählen Sie eine neu geschaffene Normalisierung Datei für PET-Rekonstruktion ohne Schwächungskorrektur. Das IAW startet dann CT-und PET-Scans nacheinander als programmiert.
  6. Nach der gesamte Workflow abgeschlossen ist, die 20 bis 25 Mai min dauern, kurz bewerten die Qualität der erworbenen CT-und PET-Bilder mit dem ASIPro VM, ein Mikro-PET-Analyse-Software mit IAW mitinstalliert. Archivieren der Bilddaten zu einer Datenspeichereinrichtung oder die Daten über das Netzwerk an einen Pfosten Bildanalyse Arbeitsstation (siehe Schritt 5) für eine weitere Analyse.
  7. Release das Tier aus den bildgebenden Systemen und legen Sie es auf eine saubere Gehäusekäfig mit normalen Lebensmittel-und Wasserversorgung für die Erholung bei Raumtemperatur. Die Systeme sind nun bereit für die nächste Tier in der Warteschlange. Beachten Sie die Pflege und Behandlung von post-Bildgebung Tiere sollten des Instituts Vorschriften über "Umgang mit Labortieren mit RAM injiziert" folgen. Beachten Sie auch, dass gebrauchte Nadeln / Spritzen, die Saugkissen, Handschuhe und alle Betten und Fäkalien sollte als radioaktiver Abfall betrachtet werden, Umgang und des Instituts relevant RAM Entsorgungsvorschriften.

5. Post-Imaging-Analyse

  1. Offene Inveon Research Workplace (IRW) Software (Siemens) und manuell importieren sowohl CT-und PET-Datensätzen. Co-Register CT-und PET-Bilder in Fenster "Registrierung" Einsatz von Werkzeugen mit dem "General-Analyse" Funktion, und unter dem "Review"-Fenster stellen Sie sicher, eine perfekte Ausrichtung zwischen CT-und PET-Bilder in allen 3 Dimensionen.
  2. Von "Region of Interest (ROI) Quantifizierung"-Fenster, mit den Referenzen von den Ko-registrierten CT-Bilder zur Verfügung gestellt, identifizieren BAT am interskapularen Bereich des Halses, die vorherrschende kälteinduzierbare BAT in erwachsenen Mäusen, und ziehen Volumen von Interesse (VOI) von BAT auf den PET-Datensatz. Wählen Sie "Voxel Intensity" als "Quantifizierung Type" und notieren Sie die mittlere Radioaktivität innerhalb des VOI als Bq / ml. Ein Kalibrierungsfaktor die Counts / sec umwandelt Bq / ml wurde zuvor durch Abtasten eines Phantoms mit bekannten Radioaktivität errichtet.
  3. FDG-Aufnahme in BAT wird als Prozentsatz der injizierten Dosis pro Gramm Gewebe (% ID / g) mit Zerfallskorrektur quantifiziert. Die injizierte Dosis ist das Ergebnis von Schritt 3.5, jedoch Becquerel (Bq) Einheit (1 uCi = 37.000 Bq) umgewandelt wird; wir an, dass 1 ml bis 1 g Gewebe entspricht.

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Representative Results

Ein Beispiel für micro-PET/CT Bildgebung von Maus BAT ist in Abbildung 1 gezeigt. Während die CT-Bildgebung liefert anatomische Informationen codiert die PET-Bildgebung die Verteilung und Menge von 18 F-FDG durch den ganzen Körper. Diese Bilddaten können separat betrachtet werden (1A und 1B), fusioniert (1C), oder sich mit einem 3D-Merkmal, wie maximale Intensität (MIP, 1D). Mit Hilfe eines 3D-Bildgebung Werkzeug, ein Volumen von Interesse (VOI), hier der interskapularen BAT Region (durch Pfeile in 1), wird im Laufe der PET-Bilder und den insgesamt Signale innerhalb des VOI gezogen werden in% ID umgewandelt werden / g, Darstellung der prozentualen injizierten Dosis (% ID) pro Gramm Gewebe. In die Maus gezeigt hat, ist die FDG-Aufnahme in der BAT 19% ID / g. Um zu verifizieren, ob diese kalte-Induktion und Bildgebungsprotokoll ist empfindlich genug, um eine veränderte Aktivität nachzuweisen BAT in beiden Fällen der Hochregulation oder Herunterregulation verwendeten wir βAdrenozeptor-Antagonisten Propranolol die BAT-Aktivierung 15 und β3-Agonist BRL37344 BVT Induktion 16 bzw. verbessern zu unterdrücken. Diese pharmakologischen Interventionen bei der Kältebehandlung aufgebracht und genau bei 30 Minuten vor der Injektion von FDG. PET / CT-Bildgebung (2A) und der Analyse (Abbildung 2B) zeigten, dass die Propranolol Behandlung reduzierte die FDG-Aufnahme in BAT, während BRL37344 deutlich erhöht die Aufnahme, verglichen mit der Fahrzeugsteuerung.

Abbildung 1
Abbildung 1. Micro-PET/CT Bildgebung von BAT in einem Maus nach 5 Stunden kalt Behandlung. (A) Eine koronalen Abschnitt des CT-Bildes. (B) Ein koronalen Abschnitt des Bildes mit dem PET-CT in "A" co-registriert. (C) Ein kondensierten PET / CT-Bild ergab sich aus der Überlagerung von "A" und "B". (D) Maximale Stärke projection (MIP) Präsentation der fusionierten PET / CT-Bilder. Gelbe Pfeile: der Bereich entsprechend interskapularen braunen Fettgewebe.

Abbildung 2
Abbildung 2. Micro-PET/CT Demonstration von BAT Aktivität Veränderung durch Adrenozeptor Drogen. (A) 18 F-FDG PET / CT-Bildgebung von Mäusen mit verschiedenen Medikamenten behandelt. a) PBS (Kontrolle). b) Propranolol (β-Antagonist, 5mg/kg, ip). Beachten Sie eine deutliche Reduzierung der FDG-Aufnahme in BAT-Bereich. c) BRL37344 (β3-Agonisten, 5mg/kg, ip). Beachten Sie eine deutliche Erhöhung der FDG Anreicherung im BAT. Gelbe Pfeile: der Bereich entsprechend interskapularen braunen Fettgewebe. (B) Quantitative Analyse der FDG-Aufnahme in BAT. Werte% ID / g (die prozentuale injizierten Dosis pro Gramm Gewebe) dargestellt werden (Mittelwert ± Standardabweichung). n = 10 für die PBS-Gruppe, n = 5 für beide Propranolol und BRL37344 Gruppen. *, P <0.05; **,p <0,005, wie mit dem PBS verglichen.

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Discussion

In dieser Studie wurde eine micro-PET/CT-based Bildgebungsverfahren hat zum Erfassen BAT Aktivitäten in erwachsenen Mäusen, die einfach benötigt eine Kältebehandlung und eine Injektion von handelsüblichen 18 F-FDG entwickelt. Das gesamte Verfahren kann in einem Tag nach einer Behandlung und Imaging-Sequenz, die alle 30 Minuten beginnt, bis alle Tiere behandelt werden und abgebildet durchgeführt werden. Unter den experimentellen Bedingungen umrissen, können insgesamt 10 Mäusen (oder 2 Gruppen von 5 Mäusen) am selben Tag mit einer einzigen Bildgebungssystem getestet werden. Die Beschränkung auf diese Art der Durchsatz kann aufgehoben werden, wenn zwei oder mehrere Tiere gleichzeitig auf einem speziell Tierbettes gescannt werden, wie es zuvor bereits 17 gemeldet werden. Um die Studie wir auf die Verwendung eines Kombinationspräparates micro-PET/CT Abbildungssystem, welches ausnutzt der detaillierten anatomischen Informationen vom CT vorgesehen abzuschließen. Allerdings ist eine eigenständige Mikro-PET auch in der Lage, die Aufgabe zu erfüllen, wenn ein 57 Co Übertragung Scan wird der Workflow vor dem F18-Emission Datenerfassung aufgenommen. Die 57 Co Übertragungsdaten für Schwächungskorrektur während PET Bildrekonstruktion verwendet werden und kann auch für anatomische Lokalisierung rekonstruiert werden.

Ein entscheidender Schritt dieses Protokolls ist es, die Dauer der Kältebehandlung (z. B. 5 Stunden in dieser Studie) zu optimieren. Eine kürzere Zeit oder die Eliminierung der kalten Kontakt kann eine Aktivität nahe dem Hintergrund zu erzeugen, und das Verfahren kann unempfindlich gegen jede Herabregulierung von BAT (der Boden-Effekt). Im Gegensatz dazu kann ein längliches kalten Exposition (z. B. über Nacht oder 24 Stunden) maximieren die Induktion und die Methode kann gesättigt Maskierung keine Unterschiede in der Hochregulierung von BAT (die Decke Effekt). Die optimierten Bedingungen in diesem Protokoll beschriebenen durch die Propranolol Unterdrückung und β3-Agonist BRL37344 Stimulationstests (Abbildung 2 bestätigt

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgements

Die Autoren bedanken sich bei Laura Diaz, Kevin Phillips, Willa A. Hsueh und King C. Li für ihre hilfreichen Kommentare und technische Unterstützung bei der Entwicklung dieser Methode danken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro-PET/CT Imaging System Siemens Medical Solutions USA, Inc. Inveon Dedicated PET System and Inveon Multimodality CT/SPECT System (docked)
Propranolol Sigma P0884
BRL 37344 Sigma B169
18F-FDG Cyclotope Inc.
C57BL/6J Male Mice Jackson Laboratory 000664 3-4 months old

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