Окрашивание протоколы по правам островков поджелудочной железы

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Это видео демонстрирует процедур для характеристики человека панкреатических островков использованием гематоксилином и эозином (H & E) и иммуногистохимии (IHC). Поджелудочной разделы с головы, тела и хвоста регионов окрашиваются как H & E и IHC, чтобы определить островок состав эндокринной (инсулин, глюкагон и панкреатический полипептид), ячейка репликации (Ki67), воспалительные инфильтраты (H & E, CD3). Крючковатыми области локализован использованием IHC для панкреатический полипептид.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining Protocols for Human Pancreatic Islets. J. Vis. Exp. (63), e4068, doi:10.3791/4068 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Оценки островок области и цифры и эндокринной клеточного состава в поджелудочной железе взрослого человека варьируют от нескольких сотен тысяч до нескольких миллионов и бета масса колеблется от 500 до 1500 мг 1-3. С этой известной неоднородности, стандартной обработки и окрашивания процедура была разработана таким образом, что поджелудочной регионов были четко определены и островков характеризуются использованием строгих гистопатология и immunolocalization экзаменов.

Стандартизированных процедур обработки поджелудочной железы человека оправился от доноров органов описаны в части 1 этой серии. Поджелудочная железа перерабатывается в 3-х основных регионов (голова, тело, хвост), а затем поперечные срезы. Поперечные сечения из головки поджелудочной железы делятся, как указано в зависимости от размера, и пронумерованы в алфавитном порядке для обозначения подразделов. Такая стандартизация позволяет для полного сечения анализ главы региона, включая крючковатыми область, которая содержит островки состоятв первую очередь панкреатический полипептид клеток хвоста региона.

Нынешний доклад включает в себя части 2 этой серии, и описываются процедуры, используемые для серийных срезов и гистопатологические характеристики поджелудочной парафиновых срезах с акцентом на островковых клеток эндокринной, репликации и Т-клеточные инфильтраты. Патология поджелудочной железы разделы предназначены для характеристики как экзокринной, дуктулярных и эндокринные компоненты. Экзокринной купе оценивается на наличие панкреатита (активный или хронические заболевания), атрофия, фиброз и жир, а также системы воздуховодов, особенно в связи с наличием сахарного внутрипротокового неоплазии 4. Островки оцениваются по морфологии, размеров и плотности, эндокринных клеток, воспаление, фиброз, амилоида, а также наличие тиражирование и апоптоза клеток с использованием H & E и IHC пятна.

Последний компонент описаны в части 2 является предоставление окрашенных слайдовкак с цифровых изображений слайд целом. Оцифрованных слайдов организованы случае и поджелудочной железы в области онлайн-базы данных патологий создания виртуального Биобанк. Доступ к этому онлайн-коллекции в настоящее время обеспечивается в более чем 200 врачей и ученых, участвующих в сахарный диабет 1 типа исследований. Интернет-база данных предоставляет средства для быстрого и полного обмена данными и для исследователей, чтобы выбрать блоки для парафиновых или замороженных серийных срезов.

Protocol

1. Приготовление гистологических срезов для Неокрашенные Разделы

  1. Установите водяной бане и микротома как для стандартных приготовление гистологических срезов парафином. Используйте положительно заряженные слайдов и предварительно этикетка с номер дела, поджелудочной железы области (образца) и номер слайда. Место парафиновых блоков в микротома патрон с кассетной этикетке на левой стороне.
  2. Следуйте обычной процедуры, приготовление гистологических срезов, раздел в блоке, пока ткань равномерно встречаются. Подготовить ленту серийных срезов (4 мкм, 3-6 в зависимости от количества необходимых начальных пятна (см. пример заполненной формы, Приложение 1)). Отдельные разделы в ленте, возьмите каждый по порядку, и место на слайдах с целью пронумерованы карандашом. Обозначим, если раздел не используется по нумерации разделов в точном порядке. Поддерживать ту же ориентацию на слайде, которые содержатся в кассету с этикеткой слайд ориентированные влево. Высушите на ночь при комнатной температуре, после чего приступить к появлению пятен или распределения следователей.
  3. ResEAL поверхности парафинового блока с тонким слоем парафина, чтобы сохранить ткани и архива при комнатной температуре или при -20 ° C.
  4. Для последующих приготовление гистологических срезов, поддерживать нумерации серийные срезы на каждом уровне, что и выше. Получите 1 дополнительный слайд и пятно на слайд H & E для каждого ~ 100 мкм уровне в рамках каждого блока.

2. H & E Окрашивание

  1. Поместите первый серийный секционного слайд из каждого блока в режиме слайд-стойки, то в первом лотке на autostainer.
  2. Выберите стандартный H & E пятно программу и перейти в обычном режиме.
  3. По окончании окрашивания, удалить слайды из autostainer и место в капоте для coverslipping.
  4. Покровное использованием стандартной техники. Высохнуть и этикетки с маркировкой (см. раздел 12).

3. IHC Настройка

  1. Выберите программу, Dako двойного пятна и ввод номеров слайдов. Подготовить TBST и цитрат буферов, антител и других КГНродителей в соответствии с указанными объемами (табл. 1). Загрузите лоток реагентов и слайды. Вращение чистых и сточных линии программируются в соответствии с рекомендациями производителя.
  2. При выполнении этих тестов вручную, подготовить около томов. Инкубируйте слайды во влажной камере, чтобы избежать высыхания слайды на любом этапе. Выполните ту же процедуру для каждого реагенты, когда она используется для autostainer.

4. IHC депарафинизации и антигена поиска

  1. Положите слайды в ксилоле в течение 5 минут. Повторите еще раз. Не допускать понижения высохнуть в любой последующий момент, пока обозначены как это приведет к чрезмерному фон и бедными окрашивания.
  2. Передача слайдов до 100% этилового спирта в течение 2 минут. Повторите еще раз.
  3. Положите слайды в свежеприготовленного 3% H 2 O 2 в метаноле в течение 10 минут.
  4. Dip слайдов в 90% этанола, а затем поместить в 90% этаноле в течение 3 минут.
  5. Передача слайды70% этанола в течение 1 минуты.
  6. Промыть слайдов в деионизированной воде.
  7. Разогреть пароход и цитрат в буфер пароход в течение 5 минут.
  8. Добавить слайды цитрат буфера в пароход и пара в течение 30 минут.
  9. Немедленно передать слайды к воде и удерживайте ее, пока скользит остыть до комнатной температуры (~ 20 минут).
  10. Передача слайдов Dako autostainer стойки в соответствии с последовательностью пятна (рис. 1) и запустить программу двойным окрашиванием. Основные этапы программы autostainer перечислены так, что руководство трассы можно дублировать.

5. Первый первичных антител (Ki-67, CD3, панкреатический полипептид)

  1. Блок слайды с Снайпер решение в течение 15 минут. Мыть два раза TBST.
  2. Инкубируйте слайды в первичных антител в течение 30 минут. Мыть два раза TBST.
  3. Инкубируйте с Mach2 антимышиного (Ki-67) или анти-кролик (CD3, панкреатический полипептид) пероксидазой хрена (HRP) полимера на 30 мinutes. Мыть два раза TBST.
  4. Применение 3,3-диаминобензидина tetrahydrochloride (DAB) в слайды в течение 4 минут. Мыть два раза водой.
  5. Слайды инкубировали с панкреатический полипептид проводятся на Dako когда его анализировали одновременно и TBST использоваться для всех последующих шагов в то время как остальные слайды инкубируют со вторым набором первичных антител. Кроме того, для ручного анализы, перейдите к разделу 6.

6. Второй первичных антител (инсулин, глюкагон)

  1. Инкубируйте слайды в Диб в течение 20 минут. Мыть два раза TBST.
  2. Блок с 10% нормальной козьей сывороткой в ​​20% окон в авидин TBST (инсулин) или Снайпер (глюкагон) в TBST в течение 20 минут. Мыть два раза TBST.
  3. Инкубируйте инсулина или глюкагона первичных антител в течение 15 минут. Мыть два раза TBST.
  4. Инсулин: Инкубируйте слайды в биотинилированного козьего анти-морских свинок в разведении 1:300 в течение 30 минут. Мыть два раза TBST. Инкубируйте со стандартным веКонструктор по ABC-AP реагента в течение 30 минут. Мыть два раза TBST.
  5. Глюкагон: Инкубируйте слайды в буфере в течение 30 минут с последующим антимышиного щелочной фосфатазы (AP) полимера в течение 30 минут. Мыть два раза TBST.
  6. В то время как слайды инкубировали в конъюгатов, согреть буфер LPR до комнатной температуры. Добавьте 1 каплю жидкости постоянный красный (LPR) в 3 мл буфера немедленно перед использованием и места в стойке реагент Dako. Инкубируйте слайды в LPC в течение 4 минут. Мыть два раза водой.
  7. Инкубируйте слайды в гематоксилин в течение 1 минуты. Промыть два раза водой.
  8. Инкубируйте слайды в TBS рН 7,6 в течение 1 минуты. Промыть два раза водой.
  9. Выгрузка слайды из DAKO Autostainer.
  10. Сразу обезвоживают слайды окрашивали панкреатический полипептид. Для всех слайдов двойного окрашенных, сухих, по крайней мере 1 часа, затем обезвоживают.

7. Обезвоживание

  1. Место скользит в 80% этаноле в течение 1 минуты.
  2. Опустите слайдов в 95% этанола. Держите слайдов в 95% этаноле в течение 30 секунд.
  3. Передача слайдов на 100% этанола и удерживайте нажатой клавишу 1 минуту. Повторите.
  4. Dip слайдов в ксилол.
  5. Держите слайды в ксилоле в течение 1 минуты. Повторите.
  6. Сразу установить покровные на слайды, используя cytoseal.

8. Слайд маркировки

  1. Введите информацию случае выявления в том числе органов и номер блока, пятна, а также дату и печать. Серийный номер раздела не является обязательным для первых пятен слайд каждого блока. Последующие уровни обозначены нумерации.
  2. Поместите этикетки на слайдах.

9. Сканирование слайдов

  1. Поместите окрашенных слайдов в лоток сканера и сканировать по приборов.
  2. Организация слайдов донора и типа ткани (поджелудочной железы, головы, туловища, хвоста, селезенка).
  3. Архив окрашенных слайды при комнатной температуре и оставшиеся неокрашенными слайды при температуре -20 ° C до использования.

10. RepreseРезультаты ntative

Это окрашивание процедуры были разработаны для сети JDRF для поджелудочной органов доноров с сахарным диабетом (nPOD), чтобы обеспечить базовые характеристики парафина и свежезамороженной блоков. Каждый донор имеет базовые характеристики осуществляется в составе окрашивание в 2 кварталах от каждой области поджелудочной железы (голова, тело и хвост) и селезенки (рис. 1, см. также случай отправки формы, Приложение 1). H & E окрашивание проводится с использованием autostainer запрограммированы как на медицинское учреждение с клиническими класса решений, используемых во всем. В качестве дополнительных блоков доноры подразделяются, у каждого есть слайд приняты для H & E, чтобы показать ткани морфологии. Когда блоки подразделяются вновь, как и для распространения среди исследователей, более глубоких уровнях будут также приняты на слайдах представитель H & E слайды документировать ткани морфология весь блок, а также нумерация серийных срезов на каждом уровне. Витражи слайды помеченыслучае идентификации, поджелудочной железы региона, номер блока, пятна и даты (рис. 2) и сканирования в онлайн патологии системы управления информацией. Представитель изображения с контролем доноров показано на рисунке 3 при низких и высоких увеличениях, чтобы показать ожидаемые результаты после этой процедуры. Слайд окрашенных панкреатический полипептид (D, H) была проверена на другой день с анализа выполняется вручную и показывает уменьшить интенсивность окрашивания гематоксилин контрастирующая окраска. Различия в интенсивности окрашивания первичных антител или контрастирующая окраска между анализов следует избегать, особенно если, используя анализ изображения в противном случае скользит, требуют индивидуальной коррекции цвета для достижения тех же областях ячейки или на счету.

Каждая лаборатория должна рассчитывать на оптимизацию концентрации антител, как много к много вариаций и других реагентов и условия могут повлиять на интенсивность окраски и специфичностью. С приобретением новых REAгоспода, окрашивание процедуры проверки с известными положительные и отрицательные контрольные образцы для достижения той же степени интенсивности окраски, как и бывший реагентов. Дополнительная антител оптимизированы основные nPOD патологии приведены в таблице 2 в качестве справочного источника и были использованы для multilabeling иммунофлюоресценции анализы для конфокальной микроскопии.

Рисунок 1
Рисунок 1. Dako окрашивания сетки. Эта схема изображена рутинного анализа с nPOD поджелудочной железы донора осуществляется на autostainer Dako. NPOD доноров кодируются с 4-значный идентификационный номер. Два лотка слайде показаны слайды с организованной пятно. Альтернативная конфигурация слайд ожидается в зависимости от количества доноров слайдов. Положительный контроль включает включение известного положительного донора для двух двойных пятен и селезенки донора для Ki-67 и CD3. Отрицательные элементы управления в два раза и включает два SLIде от одного донора поджелудочной железы блок инкубировали с иммуноглобулинов (Ig) от принимающей видов первичных антител и двух слайдов доноров селезенки для инсулина и глюкагона.

Рисунок 2
Рисунок 2. Представитель двойные окрашенные слайдов. Типичный слайд готовой показан слайд с параметрами маркировки и тканей размещение до цифрового сканирования выполняется.

Рисунок 3
Рисунок 3. Представитель H & E и IHC пятна в поджелудочной разделов. Разделы из поджелудочной железы взрослой женщины донорского органа (6096-04 Panhead) были окрашены и цифровое сканирование проводили, как описано в протоколе. Изображения были получены с использованием ImageScope программой просмотра всего раздела (AD) и от одного островка (ГБ). Ожидается островок пятна интенсивности на инсулин, глюкагон, панкреатический полипептид и являютсянаблюдается на участках, как BD разделе разъясняются D, что этот блок головки поджелудочной железы содержит небольшую часть крючковатыми региона или вентральной доли поджелудочной железы, как и все островки содержат в основном панкреатический полипептид-положительных клеток. Обратите внимание, что гематоксилин контрастирующая окраска в панели D слишком светлое время гематоксилин контрастирующая окраска интенсивности в В и С являются оптимальными. Панели EH показать островок из спинной доли с ожидаемым распределением β-клеток и α-клеток. Несколько панкреатический полипептид клетки находятся в нижней левой части островка (H). А, Е-Н &E; B, F-Ki67 + инсулин, C, G-CD3 + глюкагон, D, H-панкреатический полипептид. Н.э., 0,2 x, EH-12.8x.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Стандартизация процедур IHC имеет решающее значение для анализа изображений, особенно при использовании компьютерных алгоритмов через большое количество слайдов с течением времени. Процедура IHC окрашивания, описанные в этом докладе, позволит партии анализ образцов данного донора, используя autostainer в ​​течение 8-часового рабочего дня и изменение от предыдущего доклада 5. Оцифрованные целом изображений слайд каждого слайда окрашенных предоставляется nPOD аффилированных следователи через веб-сайте патологии системы. Следователи могут просматривать доноров демографии, лабораторных данных, а также других соответствующих клинических истории наряду с горками и имеют возможность выбирать блоки наиболее подходящим для их исследований (см. http://www.jdrfnpod.org/online-pathology.php для получения дополнительной информации) . Такая система онлайн патологии является "виртуальным Биобанк". Дальнейшее совершенствование этой системы будет осуществляться Wheэтикетки Рэбы слайд включать штрих-код для отслеживания серийных срезов и уровней для каждого блока с конечной целью 3-D реконструкция поджелудочной железы.

Две двойные процедуры окрашивания в основном были выбраны, чтобы определить островок β-клеточного состава (инсулин) совместно с сотовыми репликации (Ki-67), учитывая важность понимания механизмов для взрослых β-клеток в регенерации сахарным диабетом 1 типа 5,6. В качестве второй двойной тест IHC проводится на серийных срезов к первому, каждый островок характеризуется как β-клеток (инсулин) и α-клеточный состав (глюкагон). Кроме того, наличие Т-лимфоцитов (CD3) определяется в сочетании с α-клеток окрашивание по двум основным причинам. В основе T-клеточный аутоиммунных прогрессирования диабета 1 типа, было ясно еще оценил характер инициирующего вещества (вирусные, бактериальные, воспалительных клеток) или состав хронический инфильтрат с Resulважные β-клеток дисфункции и смерти еще не определены (см. обзор в 7,8). Во-вторых, доноры с сахарным диабетом 1 типа имеют также характеризуется дефицитом β-клеток, так что сочетание CD3 и глюкагон пятна обеспечивает идентификацию островков даже тогда, когда β-клеток тяжелые потери 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Авторы благодарят доноров, семей и органов заготовительных организаций, участвующих в этом исследовании и Эмили Монтгомери, Роберт Петрас, Энн-фу, Mitali Agarwal, и Roshan Agarwal за экспертную помощь. Эта работа финансировалась по делам несовершеннолетних исследований диабета Foundation (MC-T.) в поддержку сети поджелудочной доноров органов с диабетом.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30% Hydrogen Peroxide (H2O2) Fisher Scientific H325-500 Endogenous peroxidase blocking
ABC-Alkaline Phosphatase (AP) Vector Laboratories AK-5000 AP conjugate
Antibody Diluent Invitrogen 003218 Primary antibody
Avidin blocker Vector Laboratories SP-2001 Block endogenous biotin
Biotinylated Goat anti-guinea pig Vector Laboratories BA-7000 Secondary antibody
Bluing Reagent Fisher Scientific 7301 Leica autostainer
Citrate buffer, pH 6.0 BioGenex HK086-9K Antigen retrieval
Clarifier 1 Fisher Scientific 7401 Leica autostainer
Cytoseal XYL Fisher Scientific 8312-4 Coverslip mountant
DAB Vector Laboratories SK-4100 HRP chromogen
DEEB Dako S2003 Endogenous AP blocking reagent
Eosin Y Alcoholic Fisher Scientific 71204 Leica autostainer
Ethanols- 100%, 95%, 90%, 70% Fisher Scientific Various Deparaffinization and coverslipping
Hematoxylin Dako S3301 Dako autostainer
Hematoxylin 7211 Fisher Scientific 7211 Leica autostainer
IgG (all host species for primary antibodies) Various Various Negative controls for primaries
Liquid Permanent Red (LPR) Dako K0640 AP chromogen
Mach2 AP Biocare Medical MALP521L Goat anti-Mouse AP conjugate
Mach2 HRP Biocare Medical MHRP520L Goat anti-Mouse HRP conjugate
Mach2 HRP Biocare Medical RHRP520L Goat anti-Mouse HRP conjugate
Methanol Fisher Scientific Various H2O2 diluent
Normal goat serum Vector Laboratories S-1000 IHC blocking reagent
Sniper Biocare Medical BS966M IHC blocking reagent
TBST 20X Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-999-TT IHC buffer
Triology 20x Cell Marque 920P-06 Antigen Retrieval
Xylene Fisher Scientific Various Deparaffinization and coverslipping
Table 1. Specific reagents.
Name Company Catalog Number Comments
Paraffin
Amylase Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-46657 Mouse
Amylin Serotec MCA11267 Mouse
Carbonic anhydrase 19.9 Abcam ab15146 Mouse
Caspase-3, cleaved Cell Signaling Technology 9961 Rabbit
CD20 Dako M0755 Mouse
CD3 Dako A0452 Rabbit
CD34 Cell Signaling Technology 3569 Mouse
CD4 Dako M7310 Mouse
CD45 Dako M0754 Mouse
CD68 Dako M0876 Mouse
CD8 Dako M7103 Mouse
Chromogranin A Dako A0430 Rabbit
CK17 Dako M7046 Mouse
CK19 Dako M0772 Mouse
CK7 Dako M7018 Mouse
C-peptide Cell Signaling Technology 4593 Rabbit
Foxp3 e Bioscience 14-4776-80 Rat
Ghrelin Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-10386 Goat
Ghrelin Abcam ab85104 Rabbit
Glucagon Dako A0565 Rabbit
Glucagon Abcam ab10988 Mouse
Glucagon Bachem T-5037 Guinea Pig
Glut-1 Abcam ab40084 Mouse
Glut-2 Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-9117 Rabbit
Insulin Dako A0564 Guinea Pig
Ki-67 Dako M7240 Mouse
Mafa Novus Biological NB400-137A Rabbit
Pancreatic polypeptide Invitrogen 18-0043 Rabbit
Pdx-1 Abcam ab47308 Guinea Pig
Proinsulin Novocastra NCL-proin-1G4 Mouse
Proinsulin Developmental Studies Hybridoma Bank GS-9A8 Mouse
Secretagogin Sigma-Aldrich HPA 006641 Rabbit
Smooth muscle actin Abcam ab5694 Rabbit
Somatostatin Dako A0566 Rabbit
Synaptophysin Dako M0776 Mouse
Fresh Frozen
CD11b Abcam ab6332 Rat
CD11c Serotec AHP1226 Rabbit
CD25 Novus Biological NB 600-564 Mouse
CD94 Abcam ab61874 Mouse
GAD65 Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-130569 Mouse
HLA-ABC Dako M0736 Mouse
Table 2. Primary antibodies.
Name Company Catalog Number Comments
Aperio Scanscope CS Aperio Technologies Digital slide scanner
DAKO Autostainer Plus Dako IHC stains
Label Matrix printing software BioCarta LM7UP57 Slide label software
Leica XL Autostainer Leica Microsystems H&E stains
Premium Coverglass Fisher Scientific 12-548-5J Coverslip
Spectrum Information Manager Aperio Technologies Scanner software
Superfrost Plus slides Fisher Scientific 12-550-15 Positively charged slides
Vegetable steamer Black and Decker Various Antigen retrieval
Zebra TLP 3742 CDWG TLP3742 Slide label printer
Table 3. Specific supplies and equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. In't Veld, P., Marichal, M. Microscopic anatomy of the human islet of Langerhans. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 1-19 (2010).
  2. Matveyenko, A. V., Butler, P. C. Relationship between beta-cell mass and diabetes onset. Diabetes Obes. Metab. 10, Suppl . 4. 23-31 (2008).
  3. Saisho, Y. Pancreas volumes in humans from birth to age one hundred taking into account sex, obesity, and presence of type-2 diabetes. Clin. Anat. 20, 933-942 (2007).
  4. Hruban, R. H. Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions. Am. J. Surg. Pathol. 25, 579-586 (2001).
  5. Campbell-Thompson, M. Pancreatic adenocarcinoma patients with localised chronic severe pancreatitis show an increased number of single beta cells, without alterations in fractional insulin area. Diabetologia. 52, 262-270 (2009).
  6. Meier, J. Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans. Diabetes. 57, 1584-1594 (2008).
  7. Rowe, P. A., Campbell-Thompson, M. L., Schatz, D. A., Atkinson, M. A. The pancreas in human type 1 diabetes. Semin. Immunopathol. 33, 29-43 (2011).
  8. Veld, I. n't, P, Insulitis in human type 1 diabetes: The quest for an elusive lesion. Islets. 3, 131-138 (2011).
  9. van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol Rev. 91, 79-118 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics