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एकल कोशिका के जीन प्रतिलेखन की शाही सेना प्रतिदीप्त द्वारा विश्लेषण

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Biology

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Summary

प्रतिदीप्ति

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Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073, doi:10.3791/4073 (2012).

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Abstract

प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम मानव endothelial रिसेप्टर्स करने के लिए संक्रमित (आईई) मलेरिया के संक्रमण के दौरान एरिथ्रोसाइट्स के आसंजन PfEMP1 var जीन द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन वेरिएंट की अभिव्यक्ति द्वारा मध्यस्थता है.

अगुणित पी. फाल्सीपेरम जीनोम लगभग 60 विभिन्न var जीन जिनमें से केवल एक सेल प्रति एक समय में संक्रमण के रक्त चरण के दौरान लिखित माना गया है harbors. Var जीन प्रतिलेखन के ऐसे परस्पर अनन्य विनियमन कैसे हासिल की है यह स्पष्ट नहीं है, के रूप में व्यक्तिगत var जीन या var अलग पी. के नैदानिक ​​परिणाम पर और अंतर बाध्यकारी परिणाम रिसेप्टर्स के साथ जुड़े जीन की उप समूहों की पहचान है फाल्सीपेरम संक्रमण. हाल ही में, परस्पर अनन्य ट्रांसक्रिप्शन प्रतिमान प्रतिलेखन व्यक्ति पी. पर आधारित assays द्वारा किया गया है संदेह में बुलाया फाल्सीपेरम एकल inf में प्रतिलिपि पहचानपी. की व्यक्तिगत नाभिक में परजीवी द्वारा ected एरिथ्रोसाइटिक स्वस्थानी संकरण में शाही सेना फ्लोरोसेंट का उपयोग कोशिकाओं (मछली) var जीन प्रतिलेखन के विश्लेषण फाल्सीपेरम IE 1.

यहाँ, हम बाहर पी. के एकल नाभिक में शाही सेना मछली पद्धति ले जाने लिए var जीन प्रतिलेखन के विश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित फाल्सीपेरम मानव एरिथ्रोसाइट्स संक्रमित. विधि के प्रयोग पर आधारित है digoxigenin और antisense शाही सेना जांच TSA प्लस प्रतिदीप्ति पैलेट 2 प्रणाली (Perkin एल्मर), सूक्ष्म विश्लेषण और हौसले से चयनित पी. बायोटिन लेबल फाल्सीपेरम IE. स्वस्थानी संकरण विधि में पी. के विभिन्न चरणों के दौरान व्यक्त प्रतिलेखन और जीन की एक किस्म के विनियमन पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है फाल्सीपेरम जीवन और चक्र अन्य मलेरिया परजीवी प्रजातियों और अन्य जीवों और सेल प्रकार के लिए अनुकूल है.

Protocol

1. हौसले से चयनित संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स की पीढ़ी

इस परख के लिए, सबसे अच्छा परिणाम जब PfEMP1 प्रोटीन की सतह अभिव्यक्ति के लिए हौसले से चयनित संस्कृतियों का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं. यह विशेष रूप से प्रयोग 3D7 पी. फाल्सीपेरम वंश विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर के रूप में पहले से वर्णित 1 चयनित किया गया था.

1 दिन

  1. हार्वेस्ट पैक पी. से रक्त कोशिकाओं के 200 μl फाल्सीपेरम संस्कृति centrifugation द्वारा 800 XG में 8 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 2-5% देर मंच IE युक्त.
  2. 2 मिलीलीटर में 37 की रक्त गोली पुनः को निलंबित ° सी गर्म 0.75% एक 14 मिलीलीटर बाँझ ट्यूब में जेलाटीन समाधान है, और असंक्रमित और अंगूठी चरण तलछट IE की अनुमति के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 15-20 मिनट के लिए छोड़ दें.
  3. IE देर चरण फसल, ऊपरी चरण यानी, एक नया 14 मिलीलीटर ट्यूब में और धो दो बार 37 डिग्री सेल्सियस गर्म मीडिया आरबीसी धोने के 10 मिलीलीटर के साथ.
  4. 50 विशिष्ट विरोधी PfEMP के μl पतला37 के 2 मिलीलीटर ° C गर्म आरबीसी धोने मीडिया और बाँझ फिल्टर में 1 एंटीबॉडी.
  5. 37 पर 30 मिनट के लिए एक 14 मिलीलीटर बाँझ ट्यूब और सेते में निष्फल पतला antisera ° सी कोमल आंदोलन के साथ साथ धोया IE देर चरण मिलाएं.
  6. कमरे के तापमान पर 8 मिनट के लिए 800 XG पर नीचे, स्पिन और धो दो बार 37 डिग्री सेल्सियस गर्म मीडिया आरबीसी धोने के 10 मिलीलीटर के साथ.
  7. Dynabead प्रोटीन की 50 μl आरबीसी धोने एक DynaMaq 15-चुंबक का उपयोग करते हुए मीडिया के साथ एक निलंबन दो बार धो लें.
  8. Resuspend 300 μl आरबीसी धोने मीडिया में Dynabeads और उन्हें धोया IE देर चरण के लिए जोड़ने. कोमल आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
  9. चुंबक DynaMaq-15 ट्यूब स्थानांतरण. 1-2 मिनट के लिए छोड़ दें और सभी तरल निकालने.
  10. Resuspend आरबीसी धोने मीडिया की 4-5 मिलीलीटर में Dynabeads. चुंबक पर ट्यूब वापस स्थानांतरण और यह सभी तरल निकालने से पहले 1-2 मिनट के लिए छोड़ दें. धोने कदम एक बार दोहराएँ.
  11. एक 25 सेमी 2 बाँझ संस्कृति च धोया मोती स्थानांतरणLask 200 μl हौसले पैक लाल रक्त कोशिकाओं से युक्त. संस्कृति में Albumax मीडिया के 5-6 मिलीलीटर जोड़ें. 37 पर 5% सीओ 2 में रातोंरात स्टोर डिग्री सेल्सियस

2 दिन

  1. संस्कृति जब एक 14 मिलीलीटर बाँझ ट्यूब सभी संस्कृति स्थानांतरित द्वारा चयनित IE ताजा लाल रक्त कोशिकाओं reinvaded से Dynabeads निकालें. ट्यूब DynaMaq 15-चुंबक पर रखो और 1-2 मिनट के लिए छोड़ दें. फिर, एक संस्कृति फ्लास्क सभी तरल वापस डाल.
  2. के रूप में 5-10% की एक पेरासाइटिमिया तक संभव के रूप में कुछ चक्र और परजीवी के लिए संस्कृति ringstage में हैं.
  3. IE FACS द्वारा विश्लेषण किया जाना चाहिए यकीन है कि सही सतह phenotype, यानी प्रोटीन अभिव्यक्ति या तो PFD1235w and/orPF11_0008 की 1 प्राप्त किया गया गया है.

2. जांच की तैयारी

antisense शाही सेना जांच PFD1235w और PF11_0008 var का सबसे चर क्षेत्रों से उत्पन्न किया गया </ Em> पी. से जीन फाल्सीपेरम 3D7 जीनोमिक डीएनए. डीएनए पीसीआर द्वारा परिलक्षित किया गया था और प्रतिलेखन के लिए pSPT18 या 19 वेक्टर में क्लोन क्रमशः निर्माता विवरण (Roche) के अनुसार. जांच (580 आधार जोड़े (बीपी) और लंबाई में 590 बीपी) (डीआईजी) Digoxigenin या बायोटिन थे लेबल के साथ एक डीआईजी शाही सेना लेबलिंग किट या एक बायोटिन शाही सेना लेबलिंग मिक्स, क्रमशः. हम उत्तरी धब्बा विश्लेषण द्वारा दोनों और एकल लेबल मछली 1 विश्लेषण द्वारा जांच की विशिष्टता की पुष्टि की.

3. पतला और स्वस्थानी संकरण में परजीवियों का निर्धारण करने के लिए पिछले स्मियर

1 दिन

सभी कदम एक RNase मुक्त वातावरण में प्रदर्शन कर रहे हैं और सभी अभिकर्मकों RNase मुक्त या पूर्व diethyl (DEPC) pyrocarbonate या RNase जैप (Invitrogen) के साथ इलाज कर रहे हैं. स्लाइड और कवर फिसल जाता है शराब के साथ साफ किया जाना चाहिए अवशिष्ट विनिर्माण तेल निकालने के. यह महत्वपूर्ण है करने के लिए कदम के बीच में किसी को थामने के बिना प्रोटोकॉल प्रदर्शनक्रम में nuclease संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए.

  1. मानक के प्रसार के 3 विधि द्वारा एक पतली खून फिल्म बनाओ. माइक्रोस्कोप के 100x तेल उद्देश्य लेंस का प्रयोग, IE गिनती और संस्कृति में IE के प्रतिशत की गणना. जाँच करें कि परजीवी चरणों अनुमानित synchrony में अंगूठी और IE चक्र के जल्दी trophozoite चरणों में हैं. ये पूर्व प्रतिकृति, ऊनि नाभिक चरणों, व्यक्त var जीन mRNA और भी इस प्रकार के सेल मछली प्रतिलेखन assays के लिए उपयुक्त हैं.
  2. परजीवी संस्कृति का 50 μl स्थानांतरण, 5-10% की एक पेरासाइटिमिया में 1.5 मिलीलीटर RNase मुक्त Eppendorf ट्यूब. 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 2,000 rpm पर अपकेंद्रित्र.
  3. मीडिया निकालें और DEPC पानी का इलाज में 50 μl पीबीएस 7.2 पीएच जोड़ें. ट्यूब धीरे आंदोलन. मीडिया और सेल मलबे से मुक्त कोशिकाओं धोने केन्द्रापसारक अवसादन कदम दो बार दोहराएँ.
  4. चार अच्छी गुणवत्ता पतली स्मीयरों. प्रत्येक स्मीयर के लिए, पर एक धब्बाएक अच्छी तरह से एक अच्छी तरह से 4 स्लाइड, यानी कुल में चार गिलास स्लाइड RNase मुक्त हुड में (एक महत्वपूर्ण कदम) 11 मिमी व्यास. वेव शुष्क हवा में संक्षेप में स्लाइड. एकल किसी अन्य अप्रासंगिक जीन के लिए जांच धुंधला के लिए नियंत्रण एक नकारात्मक स्लाइड के लिए एक विशेष जांच, RNase उपचार और एक तिहाई व्यक्त हित के जीन नहीं IE युक्त स्लाइड के लिए एक और स्लाइड का उपयोग करके तीन अतिरिक्त स्लाइड बनाने. स्लाइड्स के बेंच पर 10-20 मिनट के लिए सूखी छोड़ दें.
  5. नियतन कुओं में 4% paraformaldehyde और 5% हिमनदों एसिटिक एसिड युक्त समाधान के 60 μl जोड़कर फिक्स पतली फिल्मों. कमरे के तापमान पर बेंच पर 10 मिनट के लिए छोड़ दें.
  6. 2x SSPE बफर में 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोमल आंदोलन द्वारा स्लाइड्स धो लें. संक्षेप में कोशिकाओं को एक कागज ऊतक के साथ धीरे युक्त कुओं को छू द्वारा अतिरिक्त तरल हटा दें.
  7. 2 मिनट के लिए 0.01 एम एचसीएल में 0.01% पेप्सिन साथ 37 ° C (एक अत्यंत महत्वपूर्ण कदम पर स्लाइड कवर). 2x SSPE में कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए स्लाइड्स धो लें.
  8. RNase 10 ग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए समाधान पतला. RNase समाधान के 60 μl के साथ नकारात्मक नियंत्रण स्मीयरों कवर. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं और तो 2x SSPE में कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए स्लाइड धोने.
  9. संकरण कदम के लिए तुरंत आगे बढ़ें.

4. शाही सेना जांच के फिक्स्ड स्लाइडों को संकरण

1 दिन

  1. संकरण कक्ष, एक 100 HC4 ThermoStar या एक खाली विंदुक टिप बॉक्स एक साफ ओवन में RNase जैप के साथ छिड़काव और यह एक कागज ऊतक के साथ साफ पोंछते, डाल के रूप में तैयार करें. संकरण कक्ष या DEPC पानी का इलाज के साथ बॉक्स के लिए सुनिश्चित करें कि स्लाइड संकरण के दौरान बाहर सूखी नहीं होगा बनाने के नीचे के चैनल भरें. 48 कक्ष और पहले से गरम बंद डिग्री सेल्सियस
  2. संकरण 12 एनजी / μl की एक अंतिम एकाग्रता के लिए समाधान में जांच पतला. एक हीटिंग ब्लॉक में 5 मिनट के लिए 65 में जांच समाधान डिग्री सेल्सियस denature. तुरंत बर्फ पर ठंडा.
  3. संक्षेप में हवा 2x SSPE धोने के बाद स्लाइड सूखी. ध्यान कुओं के आसपास एक पेपर ऊतकों के साथ अतिरिक्त तरल हटा दें.
  4. संकरण कक्ष खोलें और चैम्बर में स्लाइड्स जगह. अच्छी तरह से प्रति 60 μl की कुल मात्रा में से एक या दोनों जांच लागू करें. बाँझ संदंश का उपयोग कर एक RNase मुक्त कवर पर्ची के साथ सावधानी से तरल ड्रॉप कवर.
  5. चैम्बर बंद और 48 डिग्री सेल्सियस पर रात से अधिक कम से कम 16 घंटे के लिए स्लाइड संकरण.

5. एंटीबॉडी संयुग्मन और प्रतिदीप्ति प्रवर्धन

2 दिन

निम्नलिखित कदम TSA प्लस Perkin एल्मर से प्रतिदीप्ति पैलेट सिस्टम पर आधारित हैं. सभी चरणों को कमरे के तापमान पर किया जाता है.

  1. स्लाइड कोमल आंदोलन के साथ 5 मिनट के लिए 3 बार धोएं में टीएनटी बफर.
  2. TNB बफर के 150 μl में 30 मिनट के लिए कुओं ब्लॉक.
  3. TNB के बफर में 1:500 का अनुपात 1:100 के अनुपात और TNB बफर में एचआरपी संयुग्मित एंटीबॉडी α बायोटिन एचआरपी संयुग्मित एंटीबॉडी α डीआईजी, पतला. एक कागज ऊतक के साथ स्लाइड से किसी भी अतिरिक्त TNB बफर निकालें. जब एक साथ दो टेप का पता लगाने, दोनों एंटीबॉडी एक बार में जा सकते हैं. अच्छी तरह से प्रति प्रतिरक्षी - TNB समाधान के 100 μl की कुल राशि लागू करें और ध्यान एक कवर पर्ची के साथ कवर. 2 घंटे के लिए स्लाइड सेते हैं.
  4. कवर फिसल जाता है ध्यान से निकालें. टीएनटी बफर में स्लाइड्स धो 3 बार 5 मिनट के लिए.
  5. Tyramide प्रवर्धन अभिकर्मक में FITC fluorophore 1:500 के अनुपात में और पतला एक अच्छी तरह से समाधान के 100 μl लागू. कवर फिसल जाता है के साथ कुओं कवर और 12 मिनट के लिए सेते हैं.
  6. कवर फिसल जाता है ध्यान से निकालें और स्लाइड कोमल आंदोलन द्वारा टीएनटी बफर में 5 मिनट के लिए 3 बार धो लो.
  7. 1:500 के अनुपात में tyramide प्रवर्धन अभिकर्मक में Cyan3 fluorophore पतला. 100 प्रति μl जोड़ेंइस समाधान के लिए अच्छी तरह से. कवर फिसल जाता है के साथ कुओं कवर और 12 मिनट के लिए सेते हैं.
  8. कवर निकालें ध्यान से फिसल जाता है और फिर स्लाइड टीएनटी बफर में विसर्जन द्वारा जल्दी कुल्ला.
  9. स्लाइड टीएनटी बफर के साथ 5 मिनट के लिए 3 बार धोएं.
  10. स्लाइड्स जल्दी DEPC का इलाज पानी में विसर्जित कर दिया.
  11. स्लाइड्स छोड़ शुष्क हवा. विरोधी फीका DAPI युक्त अभिकर्मक के साथ स्लाइड माउंट. नेल पॉलिश के साथ कवर पर्चियों के कोनों सील.
  12. स्लाइड्स अब माइक्रोस्कोपी के लिए तैयार कर रहे हैं. 4 में एल्यूमीनियम पन्नी और दुकान के साथ कवर स्लाइड्स रखें ° C अगर प्रयोग करने के लिए अगले दिन पूरा किया जाना है. स्लाइड के पक्षों के एक पूरा सील किया जा सकता है अभिकर्मक विरोधी फीका लागू करने के बाद 24 घंटे. इस स्लाइड्स के लिए imaged करने के लिए प्रोटोकॉल के एक सप्ताह के बाद पूरा हो गया है की अनुमति देगा.

6. Hybridized जांच की विज़ुअलाइज़ेशन

  1. माइक्रोस्कोप पर मुड़ें. एक मानक immunofluorescence खुर्दबीन suffic हैप्रयोग के लिए इस तरह की ient, लेकिन अगर आप एक confocal खुर्दबीन का उपयोग कर सकते है आप भी 3 डी छवियों के लिए उपयोग कर सकते हैं या अपने दाग कोशिकाओं के वीडियो प्राप्त करने के लिए. माइक्रोस्कोप 15-30 मिनट के लिए गर्म करने के लिए अनुमति दें. कंप्यूटर और सॉफ्टवेयर पर स्विच.
  2. Immunofluorescence खुर्दबीन पर धुंधला हो की गुणवत्ता की जाँच करें. एक जगह कुछ परजीवी युक्त चुनें.
  3. एक लेजर का लाभ मैन्युअल रूप से समायोजित करें. पिक्सेल समायोजित 4-6 मीटर -1 एस -1 और 512 x 512 पिक्सल के लिए कदम के लिए ध्यान केन्द्रित करना है.
  4. एक परीक्षण फ्रेम Lambda का उपयोग कर तस्वीर ले लो. लेजर लाभ मरम्मत करना.
  5. फ्लोरोसेंट एकल कक्षों के 20 अच्छे चित्रों का एक न्यूनतम रखना. एक 5-20 परजीवी युक्त क्षेत्र के कम से कम 2-5 चित्रों की जरूरत क्रम में सकारात्मक परजीवी के प्रतिशत के एक निष्पक्ष सिंहावलोकन प्राप्त करने के लिए कर रहे हैं.

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Representative Results

चित्रा 1 प्रमुख कदम है और आरएनए मछली पद्धति के समय की अवधि के एक प्रवाह संचित्र दिखाता है.

एकल पी. का उपयोग अच्छी तरह से और खराब संरक्षित दाग mRNA मछली प्रयोगों के प्रतिनिधि छवियों की एक श्रृंखला फाल्सीपेरम IE चित्रा 2 में दिखाया जाता है. इस intracellular प्रोटोजोआ एक छोटे (1-1.5 सुक्ष्ममापी व्यास) नाभिक जो DAPI के साथ नीले रंग दाग है. पी. में एरिथ्रोसाइट आक्रमण के बाद चौबीस घंटे फाल्सीपेरम schizogony, यानी परमाणु विभाजन के प्रक्रिया शुरू होता है. Var जीन प्रतिलेखन का इष्टतम मछली का पता लगाने इस 48 घंटा अंतर एरिथ्रोसाइटिक lytic चक्र में 10-22 के आसपास घंटा होता है. जांच आम तौर पर प्रजाति है जो मुख्य परमाणु शरीर को निकट दिखाई देते हैं, जो शायद परमाणु लिफाफा जुड़े endoplasmic जालिका mRNA संकरण. पंक्ति में अच्छी गुणवत्ता की छवियों FITC एक शो (हरी) और Cyan3 (लाल) लेबल PFD1235w और पी के लिए इसी जांचF11_0008 var जीन, डबल चयनित पी. में क्रमशः, उप लाइन फाल्सीपेरम, PFD1235w/PF11_0008 3D7. जीन के सह स्थानीयकरण स्पष्ट है लेकिन पूर्ण नहीं है. पंक्ति बी परजीवी है जो या तो अपमानित या काफी हद तक var mRNA transcribing रह गए हैं दोनों जांच के गरीब संकरण से पता चलता है. पंक्ति सी में, एक अच्छा मछली संकरण प्राप्त है लेकिन सेलुलर संरक्षण गरीब है, के रूप में बुरी तरह से फैला है और परजीवी कुल दिखाया.

चित्रा 1
चित्रा 1. आरएनए मछली प्रयोग प्रवाह संचित्र. फ्लोचार्ट मुख्य मछली प्रक्रिया के समय और अंक दिखाता है.

चित्रा 2
चित्रा 2 डबल चयनित पी. में शाही सेना मछली के confocal छवियों. simultanous mR संकेत फाल्सीपेरमNA दो अलग var या तो (हरा) FITC या Cyan3 संकेत (लाल) के साथ लेबल जीनों के प्रतिलेखन. DAPI धुंधला हो जाना (नीला) परजीवी परमाणु डीएनए को इंगित करता है. ऊर्ध्वाधर पंक्ति A1, B1, और C1 परजीवी के संचरण चित्र दिखाते हैं. स्केल बार 5 सुक्ष्ममापी.

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Discussion

आरएनए मछली विश्लेषण, उत्तरी सोख्ता और RT-पीसीआर के रूप में इस तरह के तरीकों के विपरीत, विशिष्ट mRNA टेप के एकल कोशिका के स्तर पर भेदभाव की अनुमति देता है. यह transcriptionally सक्रिय और निष्क्रिय कोशिकाओं के बीच भेदभाव करने के लिए संभव बनाता है, इस उदाहरण में, पी. फाल्सीपेरम मानव लाल रक्त कोशिकाओं के अंदर प्रोटोजोआ परजीवी. इस तरह के पूरे सेल टिप्पणियों अक्सर जरूरी हैं और महत्वपूर्ण और उपन्यास transcriptional पैटर्न एक सुलझाना सकता है.

हालांकि अन्य शाही सेना मछली तरीकों 4-10 वर्णित किया गया है, वहाँ पी. में युगपत var mRNA प्रतिलेखन के अध्ययन के लिए एक नया और परिष्कृत प्रोटोकॉल के विकास के लिए एक की जरूरत है फाल्सीपेरम. उपकरणों का पता लगाने के रूप में asRNA जांच का उपयोग करके, mRNA गतिविधि के विशेष अस्थायी पैटर्न को आसानी से कोशिकाओं में स्थानीयकृत किया जा सकता है. इसके अलावा, जांच asRNA अन्य प्रयोगात्मक सिस्टम जो उनके 1 विशिष्टता का समर्थन करेगा में भी इस्तेमाल किया जा सकता है. अन्य critराजनैतिक पैरामीटर है कि महत्वपूर्ण हैं जब एक नए प्रोटोकॉल विकसित निर्धारण और कोशिकाओं के permeabilzation शामिल. ये कदम empirically विभिन्न रासायनिक अभिकर्मकों परीक्षण के रूप में अन्य लेखकों द्वारा 5 सुझाव दिया द्वारा परिभाषित किया गया. हम यह निष्कर्ष निकाला है कि धीमी गति से अभिनय पार linker paraformaldehyde कौयगुलांट लगानेवाला एसिटिक एसिड के साथ साथ संयोजन के द्वारा हम ऊतक morphology का एक अच्छा संरक्षण प्राप्त कर सकता है. इसके अलावा, हमें पता चला है कि पूर्व जांच जोड़ने से पहले अवरुद्ध कोशिकाओं के लिए आवश्यक है, इसी तरह अन्य वर्णित आरएनए मछली 5 प्रोटोकॉल नहीं था. इसके अलावा, वर्तमान प्रोटोकॉल में हम कोमल washes, कम मात्रा में एक हल्के protease (पेप्सिन) और एक कम ऊष्मायन अवधि का उपयोग करने के लिए जांच और एंटीबॉडी के नाभिक में फैलाना और ईआर पर संलग्न mRNA के साथ संकरण के लिए अनुमति देने के लिए, कम से कम झिल्ली (अंजीर 2A1-2A4) को नुकसान होता है.

इसके अलावा, आरएनए मछली और उच्च संकल्प छवियों camer द्वारा उत्पन्नएक संलग्न confocal खुर्दबीन से पता चलता है कि क्या एक विशेष सेल धुंधला हो जाना या नहीं करने के लिए सकारात्मक है और भी दाग ​​antisense शाही सेना और DAPI दाग नाभिक के बीच स्थानिक रिश्तों के बारे में बहुमूल्य जानकारी देता है. जैसा कि आंकड़ा 2A4 में छवियों में हल, mRNA नाभिक, शायद endoplasmic जालिका में है, और यह की चोटी पर नहीं संलग्न हो सकता है, के रूप में एक डीएनए मछली 11-12 छवि में उम्मीद दिखाई देता है.

एकल कक्षों का अध्ययन कई परजीवी के और अलग अलग समय बिंदुओं पर टिप्पणियों एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण परिणाम प्राप्त करने की आवश्यकता है. इस प्रकार, आरएनए मछली विश्लेषण एक नहीं बल्कि समय लेने वाली तकनीक है कि धैर्य और काफी परीक्षण और त्रुटि प्रयोग की मांग करने के लिए तकनीक जांचना है. आरएनए मछली के रूप में कई मापदंडों के एक तकनीक है एक मुसीबत शूटिंग इस प्रोटोकॉल के मुख्य कदम गाइड तालिका 1 में दिया जाता है.

समस्या संभव cauसे सिफारिश
कमजोर संकेत या कोई संकेत नहीं
  • कम mRNA अभिव्यक्ति.
  • गिरावट mRNA.
  • जांच अपमानित एकाग्रता में लेबल में कुशलता या बहुत कम है.
  • बहुत उच्च संकरण तापमान.
  • बहुत लंबा पेप्सिन उपचार.
  • कोशिकाओं को पर्याप्त नहीं permeabilized कर रहे हैं.
  • FACS द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति की जाँच करें.
  • RNase मुक्त शर्तों के तहत काम करते हैं और केवल हौसले से तैयार समाधान का उपयोग करें.
  • जेल पर लेबल जांच की गुणवत्ता की जांच करते हैं और एक लेबल नियंत्रण शाही सेना की तुलना करें. जांच एकाग्रता में मछली की एक अनुमापन श्रृंखला बनाओ.
  • संकरण तापमान stepwise कम करें.
  • पेप्सिन उपचार की लंबाई कम है.
  • पेप्सिन trea लम्बाtment लंबाई या किसी अन्य डिटर्जेंट का प्रयास करें.
गरीब सेलुलर संरक्षण
  • बहुत उच्च parasitaemia या बल दिया परजीवी.
  • बहुत मोटी फिल्मों.
  • बुरी तरह से साफ स्लाइड्स.
  • स्लाइड पर कोशिकाओं deattached हैं.
  • 10% के तहत पेरासाइटिमिया रखने और सेल मीडिया हर दिन बदल एक स्वस्थ परजीवी संस्कृति का प्रयोग करें.
  • परजीवी संस्कृति पतला.
  • शराब के साथ स्लाइड साफ करें और कम से कम 10 मिनट के लिए सूखी स्लाइड्स के लिए रुको.
  • का प्रयोग करें हौसले पैरा formaldehyde और / तैयार है या paraformaldehyde ऊष्मायन लंबाई बढ़ाने के.
उच्च पृष्ठभूमि
  • बहुत उच्च जांच एकाग्रता.
  • के अपर्याप्त धोनेपरजीवी.
  • Shizonts जला.
  • अपर्याप्त पोस्ट संकरण धोने.
  • अवरुद्ध बफर दूषित है या अक्षम है.
  • जांच एकाग्रता में मछली की एक अनुमापन श्रृंखला बनाओ.
  • परजीवी दो बार धो पतली फिल्मों की तैयारी से पहले.
  • संस्कृति और अधिक मजबूती से सिंक्रनाइज़ करें.
  • संख्या और / या washes की लंबाई बढ़ाएँ.
  • नए अवरुद्ध बफर तैयार. अन्य अवरुद्ध अभिकर्मक, एकाग्रता की कोशिश करो या अवरुद्ध अवधि लम्बा
RNase इलाज नियंत्रण सकारात्मक है
  • Rnase समाधान निष्क्रिय है.
  • बहुत कम RNase एकाग्रता.
  • ऊष्मायन बहुत छोटा था.
  • एक नया Rnase समाधान तैयार करेंtion.
  • एकाग्रता बढ़ाने के लिए. अनुमापन श्रृंखला बनाओ.
  • लम्बा RNase उपचार की अवधि.
नकारात्मक नियंत्रण परजीवी की झूठी सकारात्मक पहचान
  • जांच विशिष्ट नहीं है.
  • परजीवी जांच से पता चला mRNA व्यक्त नहीं करते.
  • जांच की विशिष्टता की जाँच करें.
  • जाँच करें कि परजीवी लाइन सही एक का उपयोग किया है और हौसले से चयनित है.

तालिका 1 Troobleshooting मार्गदर्शन.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

लेखकों के लिए उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए परजीवी और क्रिस्टीना होल्म जीनोटाइपिंग के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा माइकल Alifrangis और उल्ला Abildtrup. इस काम हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल संस्थान (55005511 अनुदान), लंडबेक फाउंडेशन (अनुदान R9-A840) और नील्स बोह्र फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic Acid Sigma/Aldrich 338826-100ml
Albumax media: RPMI 1640 Glutamine solution Lonza BE12-115F 500 ml RPMI 1640
5 ml glutamine solution
Albumax media: Gentamycin sulphate Albumax-solution Lonza BE02-012E 2.5 ml gentamycin sulphate
50 ml Albumax-solution
Albumax-solution: Hypoxanthine Sigma-Aldrich H9377 0.8 g Hypoxanthine
Albumax-solution: AlbuMAX II Invitrogen 11021-037 200 g Albumax
Albumax-solution: RPMI 1640 Lonza BE12-115F 4 liter RPMI 1640
Dissolve with magnet at max. 50 °C. Filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Amberlite Sigma A5710-110G Resin to deionize formamide.
Anti-biotin goat pAb Peroxidase Conjugate Calbiochem 203206
Anti-Dig antibody Novus biologicals NB100-41330
Anti-fade reagent with DAPI Invitrogen P36931 The mounting media has to cure for 24 hr before sealing the slide completely.
Biotin RNA Labeling Mix Roche 11685597910
Camera digital Nikon digital sight DC-F11
Coverslips Menzel-glaser 631-1570
culture flask 25 cm2 Nunclon surface Nunc 156340
DEPC Fluka/Sigma 32490-100ml 1 ml DEPC in 1000 ml deinonized water. Add a stir bar and stir for 12 hr. Autoclave for 30 min.
Digital camera Nikon digital sight DC-F11
Dynabeads Protein A Invitrogen 10002D
DynaMaq-15 Magnet Invitrogen 123-01D
Formamide bioultra 99 % Fluka/Sigma 47671-1l-F Deionized formamide: 5 g of ion exchange resin per 100 ml of formamide. Stir 30 min. Filter through Whatman paper.
Gelatine 0.75% solution: Gelatine Sigma-Aldrich G2500 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Gelatine 0.75% solution: RPMI 1640 Lonza BE12-115F 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: L-glutamin Sigma-Aldrich G3126 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: HCl Sigma H1758 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Hybridization solution: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x Fluka/Sigma 47671-1l-F Total 20 ml, keep frozen at -20 °C in aliquots
10 ml deionized formamide
Hybridization solution: Denhardt's 50x concentrate Sigma D2532 5 ml 20xSSC
Hybridization solution: Yeast tRNARoche blocking reagent Sigma R-6750 2 ml 50x Denhardt's
250 μl 20 mg per ml yeast tRNA
Hybridization solution: Salmon sperm DNA Fluka/Sigma 31149-106GF 0.4 g Roche blocking reagent
1 ml of 10 mg per ml salmon sperm DNA (Critical: denature salmon spermDNA at 96 °C for 5 min before adding to the hybridization solution)
Hybridizer ThermoStar 100 HC4 Quantifoil Instruments GmbH 1004-0011 Can be replaced by hybridization oven and RNase free hybridization chambers padded with DEPC water.
Immersion oil UV transparent fluorescence free Sigma 10976-1EA
Immunofluorescence or confocal microscope Nikon D-Eclipse TE2000C
Nailpolish Available in any drugstore
PBS 20x:NaCl
KCl
Na2HPO4 x 2H2O
KH2PO4 DEPC deionized H2O
Ajust pH to 7.4
160 g
4 g
23 g
4 g
1 l
Paraformaldehyde 4 % Fluka/chemika 76240 4 g PFA in 80 ml PBS/DEPC. Heat to 65 °C until the PFA dissolves. Add 20 ml PBS, allow the solution to cool. Adjust the pH to 7.4. Filter. Store in aliquots at -20 °C.
Paraformaldehyde 4 %/ Acid acetic 5 % 950 μl paraformaldhyde + 50 μl Acetic acid
Pepsin Sigma/Aldrich P7000
Peroxidase-conjugated anti-biotin Calbiochem 203206
RBC-wash media: RPMI 1640 Glutamine solution Lonza BE12-115F 500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution
RBC-wash media: Gentamycin sulfate Lonza BE02-012E 2.5 ml gentamycin sulphate
RNase Sigma/Aldrich Make a 10 mg/ml stock solution.
RNase free 1.5 ml tube Ambion AM12450
RNase Zap Ambion AM9780
Slides 4 wells 11 mm Thermo Scientific MENZXER306W
SSC 20x: NaCl Sigma/Aldrich S9625 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSC 20x: Sodium citrate dehydrate Sigma/aldrich W302600 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSPE 20x: NaCl Sigma/Aldrich S9625 175.3 g NaCl
SSPE 20x: NaH2PO4 Sigma/Aldrich S0751 27.6 g NaH2PO4.
SSPE 20x:4 EDTA powder 9.4 g EDTA powder
Add DEPC water, adjust pH 7.4. Autoclave for 20 min
TNB buffer: TNT buffer 10 ml TNT buffer
TNB buffer: Blocking reagent 0.05 g Blocking reagent
To dissolve the blocking reagent, heat the solution to 60 °C for one hour with stirring. Store at -20 °C. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TNT buffer: Tris/HCl Sigma T1503 1M Tris/HCl, pH 8.0
TNT buffer: NaCl Sigma Aldrich S9625 100 ml
TNT buffer: Tween20 Sigma 93773 5 M NaCl 30 ml
1 ml DEPC dH2O 869 Ml
Adjust pH to 7.5 at room temperature. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TSA plus Cyanine3/ Fluorescein system Perkin Elmer NEL753000IKT Read the protocol from the TSA Plus Fluorescence Palette System carefully before starting the experiment.
Tubes 14 ml sterile Almeco - CM LAB Aps 91016

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References

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