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Analyse de la transcription génique unique cellule par l'ARN fluorescent

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Biology

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Summary

Fluorescent

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Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073, doi:10.3791/4073 (2012).

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Abstract

L'adhérence des érythrocytes infectés par Plasmodium falciparum (IE) à l'homme récepteurs endothéliaux au cours des infections de paludisme est médiée par l'expression de PfEMP1 variantes de protéines codées par les gènes var.

Le P. haploïde falciparum génome abrite environ 60 différents gènes var dont une seule a été soupçonnés d'être transcrit par cellule à la fois pendant la phase de l'infection du sang. Comment une telle réglementation mutuellement exclusif de la transcription des gènes var est atteint n'est pas claire, ainsi que l'identification des différents gènes var ou sous-groupes de gènes var associés aux différents récepteurs et les conséquences de la liaison différentielle sur les résultats cliniques de P. infections à P. falciparum. Récemment, le paradigme de la transcription mutuellement exclusive a été mise en doute par des essais de transcription individuelle sur la base de P. identification transcription falciparum chez inf uniqueète cellules érythrocytaires en utilisant l'ARN d'hybridation fluorescente in situ (FISH) de la transcription des gènes var par le parasite dans différents noyaux de P. falciparum IE 1.

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour la réalisation de la méthodologie ARN-FISH pour l'analyse de la transcription des gènes var dans un seul noyau de P. falciparum infection des érythrocytes humains. La méthode est basée sur l'utilisation de la digoxigénine marqué à la biotine et des sondes d'ARN antisens en utilisant la TSA plus Fluorescence Palette Système 2 (Perkin Elmer), des analyses microscopiques et fraîchement sélectionné P. falciparum IE. Dans le procédé d'hybridation in situ peut être utilisé pour contrôler la transcription et la régulation d'une variété de gènes exprimés au cours des différentes étapes du P. cycle de vie falciparum et est adaptable à d'autres espèces de parasites du paludisme et d'autres organismes et des types cellulaires.

Protocol

1. Génération de fraîchement sélectionnées érythrocytes infectés

Pour ce test, les meilleurs résultats sont obtenus en utilisant des cultures fraîchement sélectionnés pour l'expression en surface de la protéine PfEMP1. Dans cette expérience particulière du P. 3D7 lignée falciparum a été sélectionné en utilisant des anticorps spécifiques, comme décrit précédemment 1.

Jour 1

  1. Récolte 200 ul de cellules sanguines emballés à partir d'un P. falciparum culture contenant 2-5% IE tardivement par centrifugation à 800 xg pendant 8 min à température ambiante.
  2. Remettre en suspension le culot dans 2 ml de sang de 37 ° C au chaud solution à 0,75% de gélatine dans un tube de 14 ml stérile et laisser reposer pendant 15-20 min à 37 ° C pour permettre l'IE non infectés et la bague au stade de sédiments.
  3. Récolter les IE au stade avancé, c'est à dire la phase supérieure, dans un nouveau tube 14 ml et laver deux fois avec 10 ml de 37 ° C chaudes RBC-lavage médias.
  4. Diluer 50 ul d'anticorps spécifiques anti-PfEMP1 anticorps dans 2 ml de 37 ° C chaudes RBC-lavage médias et filtre stérile.
  5. Mélanger la chaux stade avancé IE avec l'antisérum dilué stérilisé dans un tube de 14 ml stérile et incuber pendant 30 min à 37 ° C sous agitation douce.
  6. Centrifuger à 800 xg pendant 8 min à température ambiante, et laver deux fois avec 10 ml de 37 ° C chaudes RBC-lavage médias.
  7. Lavez 50 pi de la protéine Dynabead Une suspension à deux reprises avec RBC-lavage médias utilisant une DynaMaq-15 aimant.
  8. Remettre en suspension les Dynabeads dans 300 ul RBC-WASH pour les médias et les ajouter à la chaux stade avancé IE. Incuber pendant 30 min à 37 ° C sous agitation douce.
  9. Transférer le tube de l'aimant DynaMaq-15. Laissez-le pendant 1-2 min et éliminer tout le liquide.
  10. Remettre en suspension les Dynabeads dans 4-5 ml de RBC de lavage médias. Transfert à l'arrière du tube sur l'aimant et le laisser pendant 1-2 min avant de retirer tout le liquide. Répéter l'étape de lavage une fois.
  11. Transférer les billes lavées à un 25 cm 2 f de culture stérilelask contenant 200 ul fraîchement concentré de globules rouges. Ajouter 5-6 ml de Albumax médias dans la culture. Stockez nuit à 5% de CO 2 à 37 ° C.

Jour 2

  1. Supprimer les Dynabeads de la culture lorsque la ré-envahi IE a sélectionné les cellules rouges du sang frais, en transférant toute la culture dans un tube de 14 ml stérile. Placer le tube sur le DynaMaq-15 aimant et laisser reposer pendant 1-2 min. Ensuite, versez tout le retour du liquide dans un flacon de culture.
  2. La culture pour que les cycles possible jusqu'à une parasitémie de 5-10% et les parasites sont à l'ringstage.
  3. IE doivent être analysés par FACS pour s'assurer que le phénotype de surface correcte, à savoir l'expression des protéines soit and/orPF11_0008 PFD1235w a été obtenue 1.

2. Préparation des sondes

Les sondes antisens d'ARN ont été générés à partir des régions les plus variables du PFD1235w et le var PF11_0008 </ Em> des gènes de P. l'ADN génomique falciparum 3D7. L'ADN a été amplifié par PCR et cloné dans le vecteur pSPT18 ou 19 pour la transcription, respectivement selon la description du fabricant (Roche). Les sondes (580 paires de bases (pb) et 590 pb de longueur) ont été marqués par la digoxigénine (DIG) ou biotine en utilisant un kit de marquage DIG ARN ou une biotine ARN étiquetage Mix, respectivement. Nous avons confirmé la spécificité des sondes à la fois par des analyses par Northern blot et par une seule partie analyse FISH 1.

3. Frottis mince et fixation des parasites Avant hybridation in situ

Jour 1

Toutes les étapes sont réalisées dans un environnement exempt de RNase et tous les réactifs sont sans RNase ou pré-traitées avec diéthyl pyrocarbonate (DEPC) ou RNase Zap (Invitrogen). Les diapositives et les lamelles couvre-objets doivent être nettoyés avec de l'alcool pour enlever la graisse de résidu de fabrication. Il est important d'effectuer le protocole sans aucune pause entre les étapesafin de minimiser le risque de contamination nucléase.

  1. Faire un frottis sanguin par la méthode standard propagation 3. Utilisation de la lentille de l'objectif 100x du microscope, compter l'IE et de calculer le pourcentage d'IE dans la culture. Vérifiez que les stades parasitaires sont en synchronie approximative, dans l'anneau et les premiers stades trophozoïtes du cycle de IE. Il s'agit de la pré-réplication, uni-nucléés étapes, exprimant l'ARNm du gène var et adapté à des dosages de cellules simples de transcription POISSONS de ce type.
  2. Transférer 50 ul de la culture du parasite, à une parasitémie de 5-10%, 1,5 ml d'une RNase-free tube Eppendorf. Centrifuger pendant 1 min à 2.000 tours par minute à température ambiante.
  3. Retirez le support et ajouter 50 ul de PBS pH 7,2 en eau traitée au DEPC. Agiter doucement le tube. Répétez l'étape sédimentation centrifuge à deux reprises pour laver les cellules libres de médias et les débris cellulaires.
  4. Faites quatre frottis minces de bonne qualité. Pour chaque frottis, faire un frottis surun 11 mm de diamètre et d'une diapositive 4 Les diapositives de verre soit quatre au total, dans une hotte sans RNase (une étape critique). Vague glisse brièvement en l'air pour sécher. Faire trois lames supplémentaires pour les contrôles négatifs tiroir-une sonde de marquage unique pour tout autre gène pertinent à l'aide d'une sonde spécifique, une autre lame pour le traitement RNase et un troisième chariot contenant IE n'exprimant pas le gène d'intérêt. Laisser les lames sécher sur le banc pendant 10-20 min.
  5. Fixer les couches minces en ajoutant 60 pl de solution de fixation contenant du paraformaldéhyde à 4% et 5% d'acide acétique glacial dans le puits. Laisser reposer 10 minutes sur le banc à la température ambiante.
  6. Laver les lames dans un tampon 2x SSPE pendant 5 minutes par agitation douce à température ambiante. Retirez brièvement l'excès de liquide en touchant les puits contenant les cellules délicatement avec un mouchoir en papier.
  7. Couvrir les lames avec de la pepsine 0,01% à 0,01 M HCl pendant 2 min à 37 ° C (une étape extrêmement critique). Laver les lames en 2x SSPE pendant 5 min à température ambiante.
  8. Diluer la solution RNase à une concentration finale de 10 pg / ml. Recouvrir le frottis de contrôle négatif avec 60 ul de la solution de RNase. Incuber pendant 30 min à 37 ° C, puis laver les lames en 2x SSPE pendant 5 min à température ambiante.
  9. Procéder immédiatement à l'étape d'hybridation.

4. L'hybridation des sondes d'ARN aux diapositives fixes

Jour 1

  1. Préparer la chambre d'hybridation, comme un ThermoStar 100 HC4 ou une boîte vide pipette pointe mis dans un four propre, par pulvérisation avec de la RNase Zap et essuyant le nettoyer avec un mouchoir en papier. Remplir les canaux de la chambre d'hybridation ou le fond de la boîte à eau traitée au DEPC à faire en sorte que les lames ne sèche pas pendant l'hybridation. Fermer la chambre et préchauffer à 48 ° C.
  2. Diluer les sondes dans la solution d'hybridation à une concentration finale de 12 ng / pl. Dénaturer la solution de sonde à 65 ° C pendant 5 min dans un bloc de chauffage. Immédiatement refroidir sur glace.
  3. En bref l'air sécher les lames après le lavage 2x SSPE. Retirez délicatement l'excès de liquide dans le puits avec un mouchoir en papier.
  4. Ouvrez la chambre d'hybridation et placer les lames dans la chambre. Appliquer une ou deux sondes dans un volume total de 60 ul par puits. Couvrez soigneusement la goutte de liquide avec une lamelle RNase-free à l'aide des pinces stériles.
  5. Fermer la chambre et l'hybridation des lames à 48 ° C pendant au moins 16 heures pendant la nuit.

5. Conjugaison d'anticorps et d'amplification de fluorescence

Jour 2

Les étapes suivantes sont basées sur le CST Plus System Palette de fluorescence de Perkin Elmer. Toutes les étapes sont réalisées à température ambiante.

  1. Laver les lames 3 fois dans du tampon TNT pendant 5 min sous agitation douce.
  2. Bloquer le puits dans 150 ul de tampon TNB pendant 30 min.
  3. Diluer le conjugué HRP-α-DIG anticorps dans un tampon TNB dans un rapport de 1:100 et le conjugué HRP-α-biotine dans du tampon TNB, selon un rapport de 1:500. Retirez tout excès de tampon TNB les lames avec un mouchoir en papier. Lors de la détection deux transcrits simultanément, les deux anticorps peut aller à la fois. Appliquer un montant total de 100 ul de la solution d'anticorps-TNB par puits et soigneusement couvrir avec une lamelle. Incuber les lames pendant 2 h.
  4. Retirez les lamelles avec précaution. Laver les lames dans du tampon TNT 3 fois pendant 5 min.
  5. Diluer le FITC-fluorophore dans le réactif d'amplification tyramide à un ratio de 1:500 et appliquer 100 ul de la solution dans chaque puits. Couvrir les puits avec lamelles et laisser incuber pendant 12 min.
  6. Retirez le couvercle glisse avec précaution et laver les lames 3 fois pendant 5 minutes dans le tampon TNT par agitation douce.
  7. Diluer le Cyan3-fluorophore dans le réactif d'amplification tyramide à un rapport de 1:500. Ajouter 100 ul paret de cette solution. Couvrir les puits avec lamelles et laisser incuber pendant 12 min.
  8. Retirez le couvercle glisse soigneusement puis rincez rapidement les diapositives par immersion dans du tampon TNT.
  9. Laver les lames 3 fois avec du tampon TNT pendant 5 min.
  10. Immerger les lames rapidement en eau traitée au DEPC.
  11. Laisser les lames sécher à l'air. Monter les préparations anti-décoloration réactif contenant du DAPI. Sceller les coins des lamelles avec du vernis à ongles.
  12. Les diapositives sont maintenant prêts pour la microscopie. Gardez les lames recouvertes d'une feuille d'aluminium et conserver à 4 ° C si l'expérience doit être rempli le jour suivant. Une étanchéité complète des faces des lames peut être effectuée 24 heures après l'application du réactif anti-décoloration. Cela permettra aux diapositives à numériser jusqu'à une semaine après le protocole a été complété.

6. Visualisation des sondes hybridées

  1. Allumez le microscope. Un microscope standard immunofluorescence est sufficient pour ce genre d'expérience, mais si vous avez accès à un microscope confocal, vous pouvez également l'utiliser pour des images en 3D ou pour obtenir des vidéos de vos cellules colorées. Laissez microscope pour se réchauffer pendant 15-30 min. Allumez l'ordinateur et le logiciel.
  2. Vérifier la qualité de la coloration au microscope par immunofluorescence. Choisissez un endroit contenant quelques parasites.
  3. Ajuster le gain de chaque laser manuellement. Ajuster le séjour de pixels à 4-6 m -1 -1 s et les étapes à 512 x 512 pixels.
  4. Prenez une photo de test en utilisant Cadre Lambda. Réajuster le gain laser.
  5. Prenez un minimum de 20 bonnes photos de fluorescence des cellules individuelles. Au moins 2-5 photos d'un champ contenant 5-20 parasites sont nécessaires afin d'obtenir une vue d'ensemble juste le pourcentage des parasites positifs.

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Representative Results

La figure 1 illustre un organigramme des principales étapes et pendant la durée de la méthodologie FISH ARN.

Une série d'images représentatives de bien et mal conservés tachées expériences FISH ARNm en utilisant unique P. falciparum IE sont présentés dans la figure 2. Ce protozoaire intracellulaire a une petite (1-1.5 um de diamètre) dans le noyau qui est coloré en bleu au DAPI. Vingt-quatre heures après l'invasion érythrocytaire de P. falciparum le processus de schizogonie, c'est à dire la division nucléaire, commence. Détection optimale des poissons de la transcription des gènes var se produit aux alentours de 10-22 heures en 48 heures cette intra-érythrocytaire du cycle lytique. Sondes généralement s'hybrider à l'ARNm espèces qui apparaissent à côté du corps principal nucléaire, dans ce qui est probablement associé à enveloppe nucléaire réticulum endoplasmique. Les images de bonne qualité dans la rangée Un spectacle FITC (vert) et Cyan3-(rouge) des sondes marquées correspondant à la PFD1235w et PF11_0008 gènes var, respectivement, dans le double P. sélectionné falciparum sous-ligne, 3D7 PFD1235w/PF11_0008. Co-localisation des gènes est apparent, mais non absolue. Ligne B montre l'hybridation des deux sondes pauvres à des parasites qui ont dégradé ou en grande partie cessé de transcrire l'ARNm var. Dans la ligne C, une hybridation FISH on obtient une bonne, mais la préservation cellulaire est médiocre, comme le montre mal répartis et l'agrégation des parasites.

Figure 1
Figure 1. Organigramme ARN expérience FISH. L'organigramme illustre les points principaux et le calendrier de la procédure FISH.

Figure 2
Figure 2. Images confocales de l'ARN-FISH en double choisis P. falciparum indiquant simultanous mRNA transcription de deux gènes différents var étiquetés soit avec FITC (vert) ou Cyan3 (rouge) du signal. Coloration au DAPI (bleu) indique l'ADN parasite nucléaire. La ligne verticale a1, b1 et c1 montrer les images de transmission des parasites. Barre d'échelle 5 microns.

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Discussion

Analyse FISH ARN, contrairement aux méthodes telles que Northern blot et RT-PCR, permet la discrimination des transcrits d'ARNm spécifiques au niveau de la cellule unique. Cela permet de faire la distinction entre les cellules transcriptionnellement actifs et inactifs, dans cet exemple, P. falciparum protozoaires parasites à l'intérieur des globules rouges humains. Ces cellules entières observations sont souvent nécessaires et peuvent percer importantes et nouvelles tendances de la transcription 1.

Bien que d'autres méthodes FISH ARN ont été décrits 4-10, il ya eu une nécessité pour le développement d'un nouveau protocole et raffiné pour l'étude de la transcription de l'ARNm simultanée var dans P. falciparum. À l'aide de sondes asRNA comme outils de détection, les motifs spéciale-temporelles de l'activité d'ARNm peut être facilement localisée dans les cellules. En outre, les sondes asRNA peut également être utilisé dans d'autres systèmes expérimentaux qui appuient leur spécificité 1. Autre critiquegiques paramètres qui sont importants lors de l'élaboration d'un nouveau protocole comprend la fixation et permeabilzation des cellules. Ces étapes ont été définies empiriquement en testant divers réactifs chimiques comme suggéré par d'autres auteurs 5. Nous avons conclu que, en combinant la lenteur paraformaldéhyde agissant réticulant avec l'acide acétique coagulant fixateur nous avons pu obtenir une bonne conservation de la morphologie des tissus. En outre, nous avons constaté que de pré-blocage des cellules avant d'ajouter les sondes n'était pas nécessaire, comme pour les autres protocoles FISH ARN décrit 5. En outre, dans le présent protocole, nous utilisons lavages doux, une protéase doux (pepsine) en fonction des montants faibles et une période d'incubation courte pour permettre la sonde et les anticorps pour diffuser dans le noyau et s'hybrider avec l'ARNm fixé sur l'urgence, en minimisant le dégâts aux membranes environnantes (figure 2a1-2a4).

En outre, le FISH ARN et les images haute résolution générée par le camerune joint au microscope confocal permet de déterminer si une cellule particulière est positif pour la coloration ou non, et donne également des informations précieuses sur les relations spatiales entre l'ARN antisens taché et le noyau coloré au DAPI. Comme l'a décidé dans les images de la figure 2a4, l'ARNm semble être fixé à côté du noyau, probablement dans le réticulum endoplasmique, et non sur le dessus de celui-ci, comme prévu dans une image d'ADN-FISH 11-12.

Des études sur des cellules individuelles nécessitent des observations de nombreux parasites et à des moments différents pour obtenir un résultat statistiquement significatif. Ainsi, l'analyse FISH ARN est une technique assez de temps qui exige de la patience et beaucoup expérimentation par essais et erreurs pour calibrer la technique. Comme FISH ARN est une technique de nombreux paramètres d'un guide de dépannage pour les principales étapes de ce protocole sont donnés dans le tableau 1.

Problème Possibilité de prudencesoi Recommandation
Signal faible ou pas de signal
  • Faible expression de l'ARNm.
  • ARNm dégradation.
  • Sonde est dégradée, en efficacement étiquetés ou trop faible concentration.
  • Température d'hybridation trop élevé.
  • Traitement par la pepsine trop longtemps.
  • Les cellules sont perméabilisées pas assez.
  • Vérifiez l'expression des protéines par FACS.
  • Travailler dans des conditions RNAse-free et n'utiliser que des solutions fraîchement préparées.
  • Faites une vérification de la qualité de la sonde marquée sur gel et comparer à un ARN de contrôle étiquetés. Faites une série de titrage de la concentration de la sonde FISH.
  • Réduire la température d'hybridation par étapes.
  • Réduire la durée du traitement par la pepsine.
  • Prolongez la pepsine traitéslongueur tement ou essayer un autre détergent.
Mauvais cellulaire préservation
  • Parasitémie trop élevée ou parasites stressés.
  • Films trop épais.
  • Mal nettoyée diapositives.
  • Les cellules sur les lames sont deattached.
  • Utilisez une culture de parasites saine en gardant la parasitémie inférieure à 10% et la modification des milieux cellulaires tous les jours.
  • Diluer la culture de parasites.
  • Nettoyez les lames avec de l'alcool et attendez au moins 10 minutes pour les diapositives pour les faire sécher.
  • Utilisez fraîchement préparée para-formaldéhyde et / ou augmenter la durée d'incubation paraformaldéhyde.
Contexte grande
  • Concentration de la sonde trop élevée.
  • Un lavage insuffisant desparasites.
  • Débordant shizonts.
  • L'insuffisance des lavages d'hybridation de poste.
  • Tampon de blocage est contaminé ou inefficace.
  • Faites une série de titrage de la concentration de la sonde FISH.
  • Laver deux fois les parasites avant de préparer des films minces.
  • Synchroniser la culture plus étroitement.
  • Augmenter le nombre et / ou la durée de lavage.
  • Préparer un nouveau tampon de blocage. Essayez un autre réactif de blocage, de concentration ou de prolonger la période de blocage
Le contrôle est positif traité à la RNase
  • La solution de RNase est inactif.
  • Trop faible concentration de RNase.
  • L'incubation a été trop court.
  • Préparez une nouvelle solution de RNasetion.
  • Augmenter la concentration. Faites une série de titrage.
  • Prolonger la période de traitement RNAse.
Fausse détection positive des parasites témoins négatifs
  • La sonde n'est pas spécifique.
  • Les parasites n'expriment pas l'ARNm détecté par la sonde.
  • Vérifiez la spécificité des sondes.
  • Vérifiez que la ligne parasite utilisé est la bonne et fraîchement sélectionné.

Tableau 1. Troobleshooting d'orientation.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier Michael Alifrangis et Ulla Abildtrup pour le génotypage des parasites et Christina Holm pour l'assistance technique excellente. Ce travail a été financé par Howard Hughes Medical Institute (subvention 55.005.511), la Fondation Lundbeck (subvention R9-A840) et par la Fondation Niels Bohr.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic Acid Sigma/Aldrich 338826-100ml
Albumax media: RPMI 1640 Glutamine solution Lonza BE12-115F 500 ml RPMI 1640
5 ml glutamine solution
Albumax media: Gentamycin sulphate Albumax-solution Lonza BE02-012E 2.5 ml gentamycin sulphate
50 ml Albumax-solution
Albumax-solution: Hypoxanthine Sigma-Aldrich H9377 0.8 g Hypoxanthine
Albumax-solution: AlbuMAX II Invitrogen 11021-037 200 g Albumax
Albumax-solution: RPMI 1640 Lonza BE12-115F 4 liter RPMI 1640
Dissolve with magnet at max. 50 °C. Filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Amberlite Sigma A5710-110G Resin to deionize formamide.
Anti-biotin goat pAb Peroxidase Conjugate Calbiochem 203206
Anti-Dig antibody Novus biologicals NB100-41330
Anti-fade reagent with DAPI Invitrogen P36931 The mounting media has to cure for 24 hr before sealing the slide completely.
Biotin RNA Labeling Mix Roche 11685597910
Camera digital Nikon digital sight DC-F11
Coverslips Menzel-glaser 631-1570
culture flask 25 cm2 Nunclon surface Nunc 156340
DEPC Fluka/Sigma 32490-100ml 1 ml DEPC in 1000 ml deinonized water. Add a stir bar and stir for 12 hr. Autoclave for 30 min.
Digital camera Nikon digital sight DC-F11
Dynabeads Protein A Invitrogen 10002D
DynaMaq-15 Magnet Invitrogen 123-01D
Formamide bioultra 99 % Fluka/Sigma 47671-1l-F Deionized formamide: 5 g of ion exchange resin per 100 ml of formamide. Stir 30 min. Filter through Whatman paper.
Gelatine 0.75% solution: Gelatine Sigma-Aldrich G2500 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Gelatine 0.75% solution: RPMI 1640 Lonza BE12-115F 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: L-glutamin Sigma-Aldrich G3126 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: HCl Sigma H1758 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Hybridization solution: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x Fluka/Sigma 47671-1l-F Total 20 ml, keep frozen at -20 °C in aliquots
10 ml deionized formamide
Hybridization solution: Denhardt's 50x concentrate Sigma D2532 5 ml 20xSSC
Hybridization solution: Yeast tRNARoche blocking reagent Sigma R-6750 2 ml 50x Denhardt's
250 μl 20 mg per ml yeast tRNA
Hybridization solution: Salmon sperm DNA Fluka/Sigma 31149-106GF 0.4 g Roche blocking reagent
1 ml of 10 mg per ml salmon sperm DNA (Critical: denature salmon spermDNA at 96 °C for 5 min before adding to the hybridization solution)
Hybridizer ThermoStar 100 HC4 Quantifoil Instruments GmbH 1004-0011 Can be replaced by hybridization oven and RNase free hybridization chambers padded with DEPC water.
Immersion oil UV transparent fluorescence free Sigma 10976-1EA
Immunofluorescence or confocal microscope Nikon D-Eclipse TE2000C
Nailpolish Available in any drugstore
PBS 20x:NaCl
KCl
Na2HPO4 x 2H2O
KH2PO4 DEPC deionized H2O
Ajust pH to 7.4
160 g
4 g
23 g
4 g
1 l
Paraformaldehyde 4 % Fluka/chemika 76240 4 g PFA in 80 ml PBS/DEPC. Heat to 65 °C until the PFA dissolves. Add 20 ml PBS, allow the solution to cool. Adjust the pH to 7.4. Filter. Store in aliquots at -20 °C.
Paraformaldehyde 4 %/ Acid acetic 5 % 950 μl paraformaldhyde + 50 μl Acetic acid
Pepsin Sigma/Aldrich P7000
Peroxidase-conjugated anti-biotin Calbiochem 203206
RBC-wash media: RPMI 1640 Glutamine solution Lonza BE12-115F 500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution
RBC-wash media: Gentamycin sulfate Lonza BE02-012E 2.5 ml gentamycin sulphate
RNase Sigma/Aldrich Make a 10 mg/ml stock solution.
RNase free 1.5 ml tube Ambion AM12450
RNase Zap Ambion AM9780
Slides 4 wells 11 mm Thermo Scientific MENZXER306W
SSC 20x: NaCl Sigma/Aldrich S9625 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSC 20x: Sodium citrate dehydrate Sigma/aldrich W302600 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSPE 20x: NaCl Sigma/Aldrich S9625 175.3 g NaCl
SSPE 20x: NaH2PO4 Sigma/Aldrich S0751 27.6 g NaH2PO4.
SSPE 20x:4 EDTA powder 9.4 g EDTA powder
Add DEPC water, adjust pH 7.4. Autoclave for 20 min
TNB buffer: TNT buffer 10 ml TNT buffer
TNB buffer: Blocking reagent 0.05 g Blocking reagent
To dissolve the blocking reagent, heat the solution to 60 °C for one hour with stirring. Store at -20 °C. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TNT buffer: Tris/HCl Sigma T1503 1M Tris/HCl, pH 8.0
TNT buffer: NaCl Sigma Aldrich S9625 100 ml
TNT buffer: Tween20 Sigma 93773 5 M NaCl 30 ml
1 ml DEPC dH2O 869 Ml
Adjust pH to 7.5 at room temperature. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TSA plus Cyanine3/ Fluorescein system Perkin Elmer NEL753000IKT Read the protocol from the TSA Plus Fluorescence Palette System carefully before starting the experiment.
Tubes 14 ml sterile Almeco - CM LAB Aps 91016

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1. PLoS Pathog. 2, 1001083 (2010).
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