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Análise de uma única célula de transcrição do gene pela RNA Fluorescente

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Biology

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Summary

Fluorescente

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Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073, doi:10.3791/4073 (2012).

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Abstract

Adesão de eritrócitos infectados por Plasmodium falciparum (IE) para receptores endoteliais humanas durante infecções de malária é mediada pela expressão de PfEMP1 variantes proteicas codificadas pelos genes var.

O P. haplóide falciparum genoma alberga aproximadamente 60 diferentes genes var de que um só tenha sido acreditados para ser transcrito por célula de cada vez, durante o estágio de sangue da infecção. Como regra, tais mutuamente exclusivos da transcrição de genes var é alcançado não é clara, assim como a identificação de genes individuais var ou sub-grupos de genes var associados com diferentes receptores e da consequência da ligação diferencial sobre os resultados clínicos de P. falciparum. Recentemente, o paradigma transcrição mutuamente exclusivos tem sido posta em dúvida por ensaios de transcrição com base no P. indivíduo falciparum identificação transcrição em inf únicoected células eritrocitários usando RNA hibridização in situ fluorescente (FISH) de análise de transcrição do gene var pelo parasita em núcleos individuais de P. falciparum IE 1.

A seguir, apresentamos um protocolo detalhado para a realização do método RNA-FISH para análise da transcrição de genes var em núcleos única de P. falciparum infectados eritrócitos humanos. O método baseia-se na utilização de digoxigenina e biotina marcado com sondas de RNA anti-sentido, utilizando o sistema de Fluorescência de TSA Além paleta 2 (Perkin Elmer), as análises microscópicas e P. recém seleccionada falciparum IE. O método de hibridização in situ pode ser usado para controlar a transcrição e a regulação de uma variedade de genes expressos durante as diferentes fases do P. falciparum ciclo de vida e é adaptável a espécie de malária outros parasitas e outros organismos e tipos de células.

Protocol

1. Geração de recentemente selecionados eritrócitos infectados

Para este ensaio, os melhores resultados são obtidos quando se utiliza as culturas de fresco seleccionados para a expressão de superfície da proteína PfEMP1. Nesta experiência particular, a P. 3D7 linhagem falciparum foi seleccionada utilizando anticorpos específicos como previamente descrito 1.

Dia 1

  1. Ul 200 de colheita de células do sangue compactados a partir de um p falciparum de cultura contendo IE fase final de 2-5% por centrifugação a 800 xg durante 8 minutos à temperatura ambiente.
  2. Re-suspender o sedimento de sangue em 2 ml de 37 ° C uma solução de 0,75% de gelatina quente em um tubo de 14 ml estéril, e deixar durante 15-20 min a 37 ° C para permitir que o IE não infectados e anel estágio para sedimentar.
  3. Colheita do IE de fase final, isto é, a fase superior, para um tubo novo ml 14 e lavar duas vezes com 10 ml de 37 ° C, lavagem quente RBC-media.
  4. Diluir 50 ul de anticorpos específicos anti-PfEMP1 anticorpos em 2 ml de 37 ° C quentes RBC-lavagem e meios filtrantes estéreis.
  5. Misture o IE de fase final lavada com anti-soros diluídos esterilizada num tubo de 14 ml estéril e incubar durante 30 min a 37 ° C com agitação suave.
  6. Girar a 800 xg durante 8 minutos à temperatura ambiente, e lava-se duas vezes com 10 ml de 37 ° C, lavagem quente RBC-media.
  7. Lave 50 ul da Proteína Dynabead A suspensão por duas vezes com RBC-lavagem mídia usando um ímã-15 DynaMaq.
  8. Ressuspender as Dynabeads em 300 uL RBC-lavagem de mídia e adicioná-los ao IE fase final de lavada. Incubar durante 30 min a 37 ° C com agitação suave.
  9. Transferir o tubo para o íman DynaMaq-15. Deixe por 1-2 minutos e retirar todo o líquido.
  10. Ressuspender as Dynabeads em 4-5 ml de RBC-lavagem de mídia. Transfira a volta tubo sobre o ímã e deixe por 1-2 minutos antes de retirar todo o líquido. Repetir o passo de lavagem uma vez.
  11. Transferir as pérolas lavadas para um 25 cm f cultura 2 estérillask contendo 200 ul de fresco glóbulos vermelhos. Adicionar 5-6 ml de Albumax mídia na cultura. Armazenar durante a noite a 5% de CO2 a 37 ° C.

Dia 2

  1. Remover as Dynabeads da cultura quando o IE seleccionou reocuparam as novas células vermelhas do sangue através da transferência de toda a cultura para um tubo de 14 ml estéril. Coloque o tubo sobre o ímã-15 DynaMaq e deixe por 1-2 min. Em seguida, despejar todo o líquido de volta para um frasco de cultura.
  2. Cultura para o maior número possível de ciclos até a parasitemia de 5-10% e parasitas estão no ringstage.
  3. IE devem ser analisadas por FACS para se certificar de que o fenótipo de superfície correcta, ou seja, a expressão da proteína de um ou outro and/orPF11_0008 PFD1235w foi obtida 1.

2. Preparação de Sondas

As sondas de RNA anti-sentido foram obtidas a partir das regiões mais variáveis ​​do PFD1235w e o var PF11_0008 </ Em> genes de P. falciparum 3D7 DNA genómico. O DNA foi amplificado por PCR e clonado no vector pSPT18 ou 19 para a transcrição, respectivamente de acordo com a descrição do fabricante (Roche). As sondas (580 pares de bases (pb) e 590 bp de comprimento) foram marcadas com digoxigenina (DIG) ou biotina utilizando um kit de marcação de ARN DIG ou a biotina RNA Mix rotulagem, respectivamente. Foi confirmada a especificidade das sondas tanto por análise de Northern blot e por um único rótulo análise FISH 1.

3. Smear fina e Fixação de Parasitas Antes de Hibridização In Situ

Dia 1

Todos os passos são executados em um ambiente livre de RNase e todos os reagentes são RNase ou pré-tratadas com pirocarbonato de dietilo (DEPC) ou Zap RNase (Invitrogen). Os slides e lamínulas devem ser limpos com álcool para remover manchas de graxa fabricação residual. É importante realizar o protocolo, sem qualquer pausa entre os passosa fim de minimizar o risco de contaminação por nuclease.

  1. Fazer uma película fina de sangue pelo método de difusão padrão 3. Usando a lente 100x óleo objetivo do microscópio, contar o IE e calcular o percentual de IE na cultura. Verifique se os estágios do parasita estão em sincronia aproximada, no ringue e fases iniciais do ciclo de trofozoíto IE. Estes são pré-reprodução, uni-nucleadas fases, o mRNA do gene que expressa var e adequados para células individuais ensaios FISH transcrição deste tipo.
  2. Transferir 50 uL da cultura parasita, a uma parasitemia de 5-10%, para um tubo Eppendorf de 1,5 ml sem RNase. Centrifugar durante 1 minuto a 2000 rpm à temperatura ambiente.
  3. Remova a mídia e adicionar 50 pH PBS 7,2 em água tratada com DEPC. Agitar suavemente o tubo. Repetir o passo de sedimentação por centrifugação duas vezes para lavar as células livres a partir de meios de comunicação e os resíduos celulares.
  4. Fazer quatro esfregaços finos de boa qualidade. Para cada esfregaço, fazer um esfregaço paraum diâmetro de 11 mm poço de uma corrediça 4 bem, ou seja, quatro lâminas de vidro, no total, em uma capa sem RNase (um passo crítico). Onda desliza brevemente ao ar para secar. Fazer três lâminas extra para slides negativo e um controlo para coloração única sonda para qualquer outro gene irrelevante usando uma sonda específica, uma outra corrediça para o tratamento com RNase e uma terceira lâmina contendo IE não expressa o gene de interesse. Deixe os slides para secar no banco por 10-20 min.
  5. Fixar os filmes finos por adição de 60 ul de solução de fixação contendo paraformaldeído a 4% e 5% de ácido acético glacial para os poços. Deixe por 10 minutos no banco à temperatura ambiente.
  6. Lavar as lâminas em 2x SSPE tampão durante 5 minutos por meio de agitação suave à temperatura ambiente. Resumidamente remover o excesso de líquido por tocar os poços que contêm as células suavemente com um lenço de papel.
  7. Cobrir as lâminas com pepsina a 0,01% em HCl 0,01 M durante 2 min a 37 ° C (um passo extremamente crítico). Lavar as lâminas em 2x SSPE, durante 5 min à temperatura ambiente.
  8. Dilui-se a solução de RNase para obter uma concentração final de 10 ug / ml. Cobrir os esfregaços de controlo negativo com 60 ul da solução de RNase. Incubar durante 30 min a 37 ° C e depois lavar as lâminas em 2x SSPE, durante 5 min à temperatura ambiente.
  9. Prosseguir imediatamente para a etapa de hibridização.

4. A hibridação de sondas de RNA de lâminas fixas

Dia 1

  1. Preparar a câmara de hibridação, tal como um ThermoStar 100 HC4 ou uma caixa vazia ponta da pipeta colocar num forno limpo, por pulverização com RNase Zap e limpando-a limpa com um lenço de papel. Encher os canais da câmara de hibridação ou o fundo da caixa com água tratada com DEPC para certificar-se de que as lâminas não sequem durante a hibridação. Fechar a câmara e pré-aquecimento a 48 ° C.
  2. Diluir as sondas em solução de hibridização para uma concentração final de 12 ng / ul. Desnaturar a solução de sonda a 65 ° C durante 5 minutos num bloco de aquecimento. Imediatamente relaxar no gelo.
  3. Resumidamente as lâminas de ar seco após a lavagem 2x SSPE. Cuidadosamente remover o excesso de líquido em torno dos poços com um lenço de papel.
  4. Abrir a câmara de hibridação e colocar as lâminas na câmara. Aplicar uma ou ambas as sondas em um volume total de 60 ul por cavidade. Cuidadosamente cobrir a gota de líquido com uma lamela de cobertura isenta de RNase usando fórceps estéreis.
  5. Fechar a câmara e hibridizar as lâminas a 48 ° C durante pelo menos 16 horas durante a noite.

5. Conjugação de anticorpos e de amplificação de fluorescência

Dia 2

Os passos que se seguem têm por base o TSA Plus Sistema Paleta de fluorescência a partir de Perkin Elmer. Todos os passos são realizados à temperatura ambiente.

  1. Lavar as lâminas três vezes em tampão TNT durante 5 minutos com agitação suave.
  2. Bloquear os poços em 150 ul de tampão de TNB para 30 min.
  3. Dilui-se o anticorpo conjugado com HRP α DIG-TNB em tampão na proporção de 1:100 e o anticorpo conjugado com HRP α-biotina em tampão de TNB, na proporção de 1:500. Remover qualquer excesso de tampão TNB se as lâminas com um lenço de papel. Ao detectar duas transcrições simultaneamente, ambos os anticorpos podem ir de uma vez. Aplicar uma quantidade total de 100 ul da solução de anticorpo-TNB por poço e cuidadosamente cobrir com uma lamela. Incubar as lâminas durante 2 horas.
  4. Retire as lamínulas cuidadosamente. Lavar as lâminas em tampão TNT 3 vezes durante 5 min.
  5. Dilui-se o fluoróforo FITC no reagente de amplificação tiramida em uma proporção de 1:500 e utilizar a 100 ul da solução em cada poço. Cobrir os poços com lamelas e incubar durante 12 min.
  6. Remover a tampa desliza cuidadosamente e lavar as lâminas três vezes durante 5 min em tampão TNT, por agitação suave.
  7. Dilui-se a Cyan3 fluoróforo no reagente de amplificação tiramida a uma razão de 1:500. Adicionam-se 100 ul porbem desta solução. Cobrir os poços com lamelas e incubar durante 12 min.
  8. Remova a tampa desliza cuidadosamente e depois enxaguar as lâminas rapidamente por imersão em tampão TNT.
  9. Lavar as lâminas três vezes com tampão TNT, durante 5 min.
  10. Imergir os slides rapidamente em água tratada com DEPC.
  11. Deixe as lâminas para o ar seco. Montar as lâminas com anti-fade reagente contendo DAPI. Selar os cantos das lamínulas com unha polonês.
  12. Os slides estão prontos para microscopia. Manter as lâminas cobertas com folha de alumínio e armazenar a 4 ° C se a experiência é para ser completada no dia seguinte. A vedação completa dos lados das lâminas pode ser realizada 24 horas após a aplicação do reagente anti-desbotamento. Isto irá permitir que as lâminas a ser trabalhada por até uma semana após o protocolo ter sido completado.

6. A visualização das sondas hibridizadas

  1. Ligue o microscópio. Um microscópio de imunofluorescência padrão é suffictário para esse tipo de experiência, mas se você tiver acesso a um microscópio confocal você também pode usar isso para imagens 3D ou obter vídeos de suas células coradas. Permitir microscópio para aquecer por 15-30 min. Ligue o computador eo software.
  2. Verificar a qualidade da coloração no microscópio de imunofluorescência. Escolha um local que contém alguns parasitas.
  3. Ajustar o ganho de cada laser manualmente. Ajuste o pixel habitam a 4-6 m -1 s -1 e os passos para 512 x 512 pixels.
  4. Tire uma foto de teste usando Frame Lambda. Reajustar o ganho do laser.
  5. Ter um mínimo de 20 fotos boas de fluorescentes células individuais. Pelo menos 2-5 imagens de um campo que contém 5-20 parasitas são necessários a fim de obter uma visão apropriada a percentagem de parasitas positivos.

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Representative Results

A Figura 1 ilustra um fluxograma dos passos principais e do tempo de duração da metodologia FISH RNA.

Uma série de imagens representativas de bem e mal conservadas experiências FISH manchadas de mRNA utilizando P. única falciparum IE são mostrados na Figura 2. Este protozoário intracelular tem um núcleo (1-1,5 um de diâmetro) de pequeno porte, que é tingido de azul com DAPI. Vinte e quatro horas após a invasão dos eritrócitos em P. falciparum o processo de esquizogonia, ou seja a divisão nuclear, começa. Detecção FISH óptima da transcrição de genes var ocorre em cerca de 10-22 horas em 48 horas deste ciclo intra-eritrocítico lítico. Sondas hibridar com o ARNm geralmente espécies que aparecem adjacentes ao corpo principal nuclear, no que é provavelmente envelope retículo endoplasmático associada nuclear. As boas imagens de qualidade em linha Um show com FITC (verde) e Cyan3-(vermelho) sondas correspondentes ao PFD1235w e PF11_0008 genes var, respectivamente, na P. dupla seleccionada falciparum sub-line, 3D7 PFD1235w/PF11_0008. Co-localização dos genes é aparente, mas não absoluta. Linha B mostra hibridização pobres de ambas as sondas para parasitas que têm degradados ou cessaram transcrever mRNA var. Na fileira C, uma hibridização bom peixe é obtido, mas a preservação celular é pobre, como mostrado por mal se espalhar e agregando parasitas.

Figura 1
Figura 1. RNA fluxograma experiência FISH. O fluxograma ilustra os principais pontos e ao momento do procedimento de FISH.

Figura 2
Figura 2. Imagens confocal de RNA dupla-FISH em P. selecionados falciparum indicando simultânea de mRNA transcrição de dois diferentes genes var marcadas com FITC ou (verde) ou sinal Cyan3 (vermelho). Coloração DAPI (azul) indica o DNA nuclear parasita. O vertical linha A1, B1 e C1 mostram as imagens de transmissão dos parasitas. Escala da barra 5 um.

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Discussion

RNA análise FISH, em contraste com os métodos tais como a Northern blotting e RT-PCR, permite a discriminação de transcritos de mRNA específicos ao nível da célula individual. Isto torna possível a discriminação entre as células transcricionalmente activos e inactivos, neste exemplo, P. falciparum protozoários parasitas dentro glóbulos vermelhos humanos. Tais células inteiras observações são muitas vezes necessário e pode desvendar importantes e romance padrões de transcrição 1.

Embora os métodos de outros peixes de RNA foram descritos 4-10, tem havido uma necessidade de desenvolvimento de um protocolo novo e refinado para o estudo da transcrição do mRNA simultânea var em P. falciparum. Usando sondas de asRNA como ferramentas de detecção, os padrões de especial-temporais da actividade de mRNA podem ser facilmente localizados nas células. Além disso, as sondas de asRNA pode também ser utilizado em outros sistemas experimentais que suportam a sua especificidade 1. Outros critical parâmetros que são importantes no desenvolvimento de um novo protocolo inclui a fixação e permeabilzation das células. Estes passos foram definidos empiricamente, testando reagentes químicos diversos, como sugerido por outros autores 5. Concluiu-se que, combinando o paraformaldeído linker lento atuando transversal em conjunto com o ácido acético fixador coagulante podíamos obter uma boa preservação da morfologia dos tecidos. Além disso, descobrimos que a pré-bloqueio das células antes de se adicionar a sonda não foi necessário, de forma semelhante a outros protocolos de FISH RNA descrita 5. Além disso, no presente protocolo, usamos lavagens suaves, uma protease leve (pepsina) em quantidades baixas e um período de incubação é curto, para permitir a sonda e os anticorpos para difundir para dentro do núcleo e hibridar com o ARNm ligado no ER, minimizando o danos às membranas circundantes (Fig. 2a1-2A4).

Além disso, a FISH RNA e as imagens de alta resolução gerada pelo camerum anexo para o microscópio confocal revela se uma célula particular é positivo para a coloração ou não, e também dá valiosa informação sobre as relações espaciais entre o ARN anti-sentido e corado do núcleo corado com DAPI. Como resolvido nas imagens da figura 2A4, o mRNA parece estar ligada ao lado do núcleo, provavelmente no retículo endoplasmático, e não na parte superior do mesmo, como se espera numa imagem de ADN FISH-11-12.

Estudos de células individuais requerem observações de parasitas numerosas e em pontos de tempo diferentes para obter um resultado estatisticamente significativo. Assim, RNA análise FISH é uma técnica bastante demorado, que exige paciência e de experimentação por tentativa e erro considerável para calibrar a técnica. Como FISH RNA é uma técnica de muitos parâmetros de um guia de resolução de problemas para os passos principais deste protocolo são indicados no Quadro 1.

Problema Cau possívelse Recomendação
Sinal fraco ou sem sinal
  • Expressão do mRNA de baixo.
  • mRNA de degradação.
  • Sonda é degradado, de forma eficiente, rotulado ou muito baixos de concentração.
  • Temperatura de hibridização muito alto.
  • Tratamento com pepsina demasiado longo.
  • As células não são permeabilizadas suficiente.
  • Verifique a expressão da proteína por FACS.
  • Trabalhar em condições RNAse e usar apenas soluções preparadas na hora.
  • Fazer um controlo de qualidade da sonda marcada em gel e comparação a um controlo RNA marcadas. Fazer uma série de titulação da concentração de sonda de FISH.
  • Reduzir a temperatura de hibridação em etapas.
  • Reduzir o tempo de tratamento com pepsina.
  • Prolongar a trea pepsinacomprimento tamento ou tentar outra detergente.
Pobre celular preservação
  • Parasitemia muito alta ou parasitas estressados.
  • Filmes muito grosso.
  • Mal limpas slides.
  • As células nas lâminas são deattached.
  • Use uma cultura parasita saudável, mantendo a menos de 10% de parasitemia e mudar o suporte de célula a cada dia.
  • Dilui-se a cultura do parasita.
  • Limpar as lâminas com álcool e espere pelo menos 10 minutos para os slides para secar.
  • Use recentemente preparada par-formaldeído e / ou aumentar o comprimento da incubação paraformaldeído.
Antecedentes alta
  • Concentração da sonda muito alto.
  • Lavagem insuficiente deparasitas.
  • Estourando shizonts.
  • Lavagens de hibridização insuficientes post.
  • Tampão de bloqueio está contaminado ou ineficiente.
  • Fazer uma série de titulação da concentração de sonda de FISH.
  • Lavar os parasitas duas vezes antes de preparar os filmes finos.
  • Sincronizar a cultura com mais força.
  • Aumentar o número e / ou o comprimento de lavagens.
  • Preparar o tampão de bloqueio nova. Tente outra bloqueio reagente de concentração, ou prolongar o período de bloqueio
O controle positivo é tratado com RNase
  • A solução Rnase está inativo.
  • Muito baixa concentração de RNase.
  • A incubação foi muito curto.
  • Prepara-se uma nova solução de ARNaseção.
  • Aumentar a concentração. Fazer uma série de titulação.
  • Prolongar o período de tratamento RNAse.
Detecção de falso positivo de parasitas de controlo negativo
  • A sonda não é específico.
  • Parasitas não expressam o mRNA detectado pela sonda.
  • Verificar a especificidade das sondas.
  • Verifique se a linha parasita utilizado é o direito e recém-selecionado.

Tabela 1. Troobleshooting orientação.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer a Michael Alifrangis e Ulla Abildtrup para a genotipagem de parasitas e Holm Christina de assistência técnica excelente. Este trabalho foi financiado pelo Howard Hughes Medical Institute (concessão 55.005.511), a Fundação Lundbeck (concessão R9-A840) e pela Fundação Niels Bohr.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic Acid Sigma/Aldrich 338826-100ml
Albumax media: RPMI 1640 Glutamine solution Lonza BE12-115F 500 ml RPMI 1640
5 ml glutamine solution
Albumax media: Gentamycin sulphate Albumax-solution Lonza BE02-012E 2.5 ml gentamycin sulphate
50 ml Albumax-solution
Albumax-solution: Hypoxanthine Sigma-Aldrich H9377 0.8 g Hypoxanthine
Albumax-solution: AlbuMAX II Invitrogen 11021-037 200 g Albumax
Albumax-solution: RPMI 1640 Lonza BE12-115F 4 liter RPMI 1640
Dissolve with magnet at max. 50 °C. Filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Amberlite Sigma A5710-110G Resin to deionize formamide.
Anti-biotin goat pAb Peroxidase Conjugate Calbiochem 203206
Anti-Dig antibody Novus biologicals NB100-41330
Anti-fade reagent with DAPI Invitrogen P36931 The mounting media has to cure for 24 hr before sealing the slide completely.
Biotin RNA Labeling Mix Roche 11685597910
Camera digital Nikon digital sight DC-F11
Coverslips Menzel-glaser 631-1570
culture flask 25 cm2 Nunclon surface Nunc 156340
DEPC Fluka/Sigma 32490-100ml 1 ml DEPC in 1000 ml deinonized water. Add a stir bar and stir for 12 hr. Autoclave for 30 min.
Digital camera Nikon digital sight DC-F11
Dynabeads Protein A Invitrogen 10002D
DynaMaq-15 Magnet Invitrogen 123-01D
Formamide bioultra 99 % Fluka/Sigma 47671-1l-F Deionized formamide: 5 g of ion exchange resin per 100 ml of formamide. Stir 30 min. Filter through Whatman paper.
Gelatine 0.75% solution: Gelatine Sigma-Aldrich G2500 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Gelatine 0.75% solution: RPMI 1640 Lonza BE12-115F 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: L-glutamin Sigma-Aldrich G3126 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: HCl Sigma H1758 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Hybridization solution: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x Fluka/Sigma 47671-1l-F Total 20 ml, keep frozen at -20 °C in aliquots
10 ml deionized formamide
Hybridization solution: Denhardt's 50x concentrate Sigma D2532 5 ml 20xSSC
Hybridization solution: Yeast tRNARoche blocking reagent Sigma R-6750 2 ml 50x Denhardt's
250 μl 20 mg per ml yeast tRNA
Hybridization solution: Salmon sperm DNA Fluka/Sigma 31149-106GF 0.4 g Roche blocking reagent
1 ml of 10 mg per ml salmon sperm DNA (Critical: denature salmon spermDNA at 96 °C for 5 min before adding to the hybridization solution)
Hybridizer ThermoStar 100 HC4 Quantifoil Instruments GmbH 1004-0011 Can be replaced by hybridization oven and RNase free hybridization chambers padded with DEPC water.
Immersion oil UV transparent fluorescence free Sigma 10976-1EA
Immunofluorescence or confocal microscope Nikon D-Eclipse TE2000C
Nailpolish Available in any drugstore
PBS 20x:NaCl
KCl
Na2HPO4 x 2H2O
KH2PO4 DEPC deionized H2O
Ajust pH to 7.4
160 g
4 g
23 g
4 g
1 l
Paraformaldehyde 4 % Fluka/chemika 76240 4 g PFA in 80 ml PBS/DEPC. Heat to 65 °C until the PFA dissolves. Add 20 ml PBS, allow the solution to cool. Adjust the pH to 7.4. Filter. Store in aliquots at -20 °C.
Paraformaldehyde 4 %/ Acid acetic 5 % 950 μl paraformaldhyde + 50 μl Acetic acid
Pepsin Sigma/Aldrich P7000
Peroxidase-conjugated anti-biotin Calbiochem 203206
RBC-wash media: RPMI 1640 Glutamine solution Lonza BE12-115F 500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution
RBC-wash media: Gentamycin sulfate Lonza BE02-012E 2.5 ml gentamycin sulphate
RNase Sigma/Aldrich Make a 10 mg/ml stock solution.
RNase free 1.5 ml tube Ambion AM12450
RNase Zap Ambion AM9780
Slides 4 wells 11 mm Thermo Scientific MENZXER306W
SSC 20x: NaCl Sigma/Aldrich S9625 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSC 20x: Sodium citrate dehydrate Sigma/aldrich W302600 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSPE 20x: NaCl Sigma/Aldrich S9625 175.3 g NaCl
SSPE 20x: NaH2PO4 Sigma/Aldrich S0751 27.6 g NaH2PO4.
SSPE 20x:4 EDTA powder 9.4 g EDTA powder
Add DEPC water, adjust pH 7.4. Autoclave for 20 min
TNB buffer: TNT buffer 10 ml TNT buffer
TNB buffer: Blocking reagent 0.05 g Blocking reagent
To dissolve the blocking reagent, heat the solution to 60 °C for one hour with stirring. Store at -20 °C. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TNT buffer: Tris/HCl Sigma T1503 1M Tris/HCl, pH 8.0
TNT buffer: NaCl Sigma Aldrich S9625 100 ml
TNT buffer: Tween20 Sigma 93773 5 M NaCl 30 ml
1 ml DEPC dH2O 869 Ml
Adjust pH to 7.5 at room temperature. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TSA plus Cyanine3/ Fluorescein system Perkin Elmer NEL753000IKT Read the protocol from the TSA Plus Fluorescence Palette System carefully before starting the experiment.
Tubes 14 ml sterile Almeco - CM LAB Aps 91016

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References

  1. Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1. PLoS Pathog. 2, 1001083 (2010).
  2. Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization. Nat. Protoc. 3, 1370-1379 (2008).
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