الجينومية التحول من Picoeukaryote

Biology
 

Summary

توضح هذه المقالة التحول الجيني للطحلب البحرية وحيدة الخلية

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

van Ooijen, G., Knox, K., Kis, K., Bouget, F. Y., Millar, A. J. Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri. J. Vis. Exp. (65), e4074, doi:10.3791/4074 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

المشاكل المشتركة التي تعوق التقدم السريع في علوم النبات وتشمل الخلوية والأنسجة وتعقيد الكائن الحي كله، وخصوصا على مستوى عال من التكرار الجيني التي تؤثر على الوراثة بسيط في النباتات العليا. الكائن الحي نموذج رواية Ostreococcus tauri هو أصغر حرة المعيشة حقيقي النواة معروف حتى الآن، وتمتلك حجم الجينوم تقلص إلى حد كبير والخلوية 1،2 التعقيد، والذي تجلى من خلال وجود واحد فقط من معظم العضيات (الحبيبات الخيطية، بلاستيدات الخضراء، جولجي كومة) في الخلية، والتي تحتوي على الجينوم فقط ~ 8000 الجينات. وعلاوة على ذلك، فإن الجمع بين unicellularity والثقافة سهل توفر منصة قابلة للنهج البيولوجيا الكيميائية. مؤخرا، تم Ostreococcus استخدامها بنجاح لدراسة الآليات الأساسية الكامنة وراء ضبط الوقت الإيقاعية 3-6. وقد أثرت نتائج من هذا الكائن الحي نموذج ليس فقط علوم النبات، ولكن أيضا بيولوجيا الثدييات 7. ويوضح هذا المثال كيف التجريب السريع فييمكن حقيقي النواة بسيط من سلالته الخضراء تسريع البحوث في كائنات حية أكثر تعقيدا عن طريق توليد الفرضيات القابلة للقياس باستخدام وسائل ممكنة من الناحية التقنية فقط في هذه الخلفية من تعقيد مخفضة. علم الجينوم وإمكانية لتعديل الجينات هي أدوات لا غنى عنها في أي نوع نموذجي. الجينومية Transcriptomic والبروتين 9 معلومات عن هذه الأنواع هي متاحة بحرية، في حين من المعروف أن الأساليب وذكرت سابقا 6،10 لتحويل وراثيا Ostreococcus إلى المختبرات القليلة على مستوى العالم.

في هذه المقالة، والطرق التجريبية وراثيا لتحويل هذا الحي نموذج الرواية مع overexpression ترد عن طريق بناء electroporation بالتفصيل، فضلا عن طريقة إدراج الخلايا تحولت في الاغاروز انخفاض النسبة المئوية للسماح للاختيار من خطوط تحويل منشؤها من واحد تحول الخلية. بعد التطبيق الناجح للOstreococcus للبحوث الإيقاعية، يمكن توقع تزايد الاهتمام في Ostreococcus من المجالات البحثية المختلفة داخل وخارج علوم النبات، بما في ذلك مجالات التكنولوجيا الحيوية. يمكن للباحثين من طائفة واسعة من العلوم البيولوجية والطبية التي تعمل على المسارات البيوكيميائية حفظها النظر في البحوث السعي في Ostreococcus، وخالية من التعقيد الجيني والعضوي من نوع أكبر نموذج.

Protocol

1. إعداد المواد الطحالب

  1. يتم استزراع خلايا Ostreococcus في مياه البحر الاصطناعي (ASW). وتذوب أملاح البحر (حوالي 40 غراما عادة للتر الواحد) في المياه deionised إلى الملوحة من 30 جزء في الألف، كما يقاس باستخدام متر الملوحة. تضاف المتوسطة تخصيب 11،12، بعض العناصر المعدنية والفيتامينات التتبع كما هو موضح في الجداول 1-3. وسائل الإعلام ثم فلتر تعقيمها من خلال 0.22 ميكرون فلتر.
  2. للصيانة، وخلايا من سلالة Ostreococcus OTTH95 هي شبه مثقف جو معقم و مطهر حتى التخفيف من 100/1 في ASW جديدة كل 7 أيام، وتنمو تحت ضوء مستمر في محطة حاضنة نمو مزودة ضوء القمر الأزرق مرشح. وينبغي أن شدة الضوء تكون قريبة إلى 20 μmol م -1 ق -2 ويتم الحفاظ على درجة حرارة 20 درجة مئوية الخلايا لا تحتاج إلى تحريض مستمر، ولكن اهتزت مرة واحدة كل يوم 2 إلى 3 لمنع تجميع.
  3. لكل تحول، ويلزم 50 مل من الخلايا في خلية ديnsity من 20-30 مل 10 6 س -1، والتي ينبغي تحقيقها 5-7 أيام الفرعية التالية زراعة. ويمكن تحديد تقريبي كثافة الخلايا وaxeny باستخدام التدفق الخلوي أو haemocytometer واحد على الحد الأدنى من تكبير X40.

2. Electroporation

  1. تحضير الحمض النووي لهذا التحول. لكل تحول، مطلوب 5 ميكروغرام من الحمض النووي linearised نقي، البلازميد بتركيز 1 ميكروغرام / ميكروليتر في المياه deionised العقيمة. للحصول على هذا الحمض النووي، والكتاب يوصي باستخدام ميدي QIAGEN الإعدادية عدة، على الرغم من أساليب أخرى يمكن أن تعمل بشكل جيد على قدم المساواة. هضم المنتج مع الانزيم الذي يقطع في العمود الفقري للناقلات المستعملة، ولكن ليس في التحوير أو الجينات اختيار. مزيد من تنقية وتركيز الحمض النووي الناتج خطي من قبل هطول الأمطار الإيثانول، وresuspend المنتج في حجم مناسب من المياه ذات الجودة العالية deionised العقيمة.
  2. إعداد أنابيب microcentrifuge تحتوي على 5 الحمض النووي ميكروغرام لكل تحويل. وكنترولل مع عدم وجود الحمض النووي ضروري لأن تتحول كل سطر الخلية. تبقى هذه الأنابيب على الجليد، جنبا إلى جنب مع كوفيت electroporation 2 مم لكل تحويل.
  3. إعداد 2.2 مل من العازلة إعادة تعليق في التحول. حل سوربيتول في التوصل إلى حل 1 م في DDH 2 O، إضافة 0.1٪ حمض pluronic F68 وفلتر تعقيم.
  4. إضافة pluronic حامض F68، إلى تركيز النهائي من 0.1٪ إلى الخلايا، وبيليه لهم لمدة 10 دقائق في ز 8000x على 10 درجة مئوية في أنبوب 50 مل مع قاع مخروطي. resuspend فورا الخلايا في 1 مل من العازلة إعادة تعليق من قبل pipetting صعودا وهبوطا، ونقل إلى أنبوب microfuge. تدور باستمرار لمدة 10 دقائق في 8000 XG على 10 درجة مئوية، والعمل بسرعة، كرر هذه الخطوة يغسل مرة أخرى.
  5. مع طرف قطع، resuspend كل بيليه النهائي في 40 ميكرولتر من العازلة إعادة تعليق. اضافة 40 ميكروليتر من الخلايا معلق على كل أنبوب من الحمض النووي linearised على الجليد، مزيج بلطف ونقل إلى كوفيت electroporation.
  6. وضع كفيت في electropخطبة آلة. تغيير الإعدادات لسم كيلو فولت 6 -1، 600 Ω، وμF 25. Electroporate الخلايا.
  7. احتضان خلايا electoporated في cuvettes في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق، واستخدام هذا الوقت لإعداد قوارير زراعة الأنسجة. تسمية لهم وإضافة 30 مل من ASW جديدة للكل. أخذ 1 مل من كل قارورة وإضافة برفق إلى كوفيت المقابلة. احتضان لمدة 2 دقيقة وإزالتها بلطف ASW، تحتوي الآن على كرية من الخلايا وبلطف وببطء ماصة مباشرة في ASW في قارورة الثقافة.
  8. الخلايا تبقى عادة في كرية. والحرص على عدم اهتزاز أو زعزعة الخلايا مجمعة في هذه اللحظة. السماح للخلايا لاسترداد في الحاضنة لمدة 1-2 ساعات، ثم resuspend عن طريق هز قوارير. في هذا الوقت، يجب أن الخلايا resuspend بحرية وكتل لا يجب أن يكون مرئيا. ترك الثقافات لاسترداد بين عشية وضحاها في الحاضنة.

3. إدراج خلايا في لوحات في شبه صلبة متوسطة

    2 O في زجاجة تحتوي على قضيب التحريك. إبقاء المنصهر في 65-90 درجة مئوية في أكبر كوب يحتوي على ماء على النمام التدفئة المغناطيسي. لكل تحول تحضير 8 أطباق بتري (55 مم القطر) و 8 × 15 مل أنابيب تحتوي كل منها على 9 مل من ASW بالإضافة إلى اختيار المطلوبة. إذا باستخدام Nourseothricin أو G418، استخدام 2 ملغ / مل.
  1. جمع الخلايا تتحول من الحاضنة. العمل في flowhood معقم، إضافة 1 مل من الاغاروز LMP الغليان إلى مل 9 في واحد من الأنابيب. إغلاق أنبوب، وتخلط بواسطة قلب. ثم يضاف 0.5 مل من الخلايا تحولت حديثا، مزيج بسرعة وتصب في صحن. كرر هذه العملية مع أنابيب 7 المتبقية ومن ثم الشروع في قارورة التحول المقبل.
  2. ترك لوحات فتح غطاء محرك السيارة في تدفق لمدة ساعة، لالاغاروز لتعيين. ثم إغلاق لوحات وتحويلها إلى أطباق بتري كبير مربع، والذي سوف يعقد كل 4 لوحات. ختم خفة دم لوحات مربعح parafilm. لاحظ أن لوحات لن يضع تماما، ونتيجة لذلك، فإن جل هشة جدا. ينبغي الحرص على عدم كسر هلام عند التعامل مع لوحات. إخضاع جميع لوحات مربع في الحاضنة.

4. اختيار المستعمرات المحولة

  1. وينبغي أن المستعمرات تظهر بعد 10 إلى 21 يوما على لوحات التحول، ولكن ليس على لوحات وهمية تحول. لاختيار المستعمرات استخدام ماصة 200 ميكرولتر مع قطع نصائح. ببساطة اختيار المستعمرات حرة وامتصاص المستعمرة الخضراء. والحرص على عدم إدراج أي خلايا من المستعمرات المجاورة.
  2. نقل الخلايا إلى 2 مل من المتوسط ​​السائلة التي تحتوي على التحديد، في لوحة الآبار 24. عند استخدام Nourseothricin، استخدم 1.75 ملغم / لتر. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا. حدد 24-50 المستعمرات في التحول. ختم لوحات مع parafilm ونقلها إلى الحاضنة.
  3. بعد أسبوع، نقل 100 ميكرولتر من كل بئر إلى 2 مل جديدة مضادة للغواصات مع التحديد في لوحة الآبار 24 و تنمو لadditionaل 7 أيام. ويمكن استخدام خطوط الخلايا على قيد الحياة لمزيد من الدراسات. وينبغي تحليل التكامل مستقر في عدد الجينوم والإدراج باستخدام PCR، وصمة عار للجنوب. ويمكن الحصول على الحمض النووي الجيني لهذه الأغراض استخدام أي وسيلة لأسفل تحجيم مستوى لاستخراج الحمض النووي المصنع.

5. ممثل النتائج

انقسام الخلايا 1/100 وصلت إلى كثافة 25 مليون الخلايا في المليلتر بعد تزايد لمدة 7 أيام. أدى Electroporation من الخلايا مع الإعدادات المناسبة في الألف بين 10 و 14 وقتا ثابت. عندما يتم نقل الخلايا والمتوسطة في قوارير والثقافة، ويجب أن كرية من الخلايا تشكل. عندما اهتزت طفيفة بعد ساعة، وينبغي أن الخلايا resuspend بسهولة. وينبغي إدراج الخلايا 1 مل تتحول أجار آخر دورة شهرية بنسبة 0.2٪ ينتج مادة هلامية شبه صلبة بما يتفق ولكن فقط. وينبغي أن المستعمرات تظهر بعد 10 إلى 21 يوما. عندما تحول 5 ميكروغرام من الحمض النووي linearised باستخدام بروتوكول أعلاه، 50-100 المستعمرات في التحولوكان من المتوقع عادة لوحة، مقابل لا شيء على لوحات التحكم سلبي. ~ تم اختيارهم بشكل إيجابي 80٪ من المستعمرات التقطت من قبل المقاومة للمضادات الحيوية في وسط سائل، وكانت تستخدم في دراسات لاحقة.

نهائي تركيز الأسهم حل لحجم 1 لتر
NANO 3 8.83 × 10 م -4 75 غ / لتر درهم O 2 1 مل
NH 4 الكلور 3،63 X 10 -5 M 2.68 غ / ل DH O 2 1 مل
β-جليسروفوسفات 1 × 10 -5 م 2.16 غ / ل DH 2 O 1 مل
H 2 3 سيو 1 × 10 -8 م 1.29 ملغم / لتر درهم O 2 1 مل
تريس قاعدة (درجة الحموضة 7.2) 1 × 10 م -3 121.1 جرام / لتر درهم O 2 1 مل
K حل المعادن النزرة الجدول 2 1 مل
و / 2 فيتامين حل الجدول 3 0.5 مل

الجدول رقم 1. المتوسطة المكونة للنمو من O. tauri 11 و 12. يشكلون إجمالي حجم 1 لتر من مياه البحر الاصطناعي إلى الملوحة من 30 جزء في الألف، وإضافة العناصر المذكورة أعلاه من الحلول الأوراق المالية كما هو محدد. فلتر تعقيم المتوسطة واستخدامها في غضون أسبوع. ويمكن تجميع مخزون من جميع المركبات ما عدا فيتامين حل لإضافة 6 مل من هذا المحلول لكل لتر من المتوسط.

نهائي تركيز الأسهم حل المبلغ 1 ليتر
غ 2 2 O 1 × 10 م -4 41،6 ز
FeCl 3 • 6H 2 O 1 × 10 -5 م 3،15 غرام
نا 2 مو 4 • 2H 2 O 1 × 10 -8 م 6،3 غ / ل DH O 2 1 مل
ZnSO 4 • 7H 2 O 1 × 10 -9 م 22.0 جرام / لتر درهم O 2 1 مل
كوكلي 2 • 6H 2 O 1 × 10 -9 م 10.0 جرام / لتر درهم 2 O 1 مل
MnCl 2 • 4H 2 O 1 × 10 -8 م 180.0 جرام / لتر درهم O 2 1 مل
CUSO 4 • 5H 2 O 1 × 10 -8 م 9.8 غرام / DH L 1 مل

الجدول 2. تتبع معدن حل 11،12. جعل ما يصل الى ما مجموعه 1 ليتر، في DH 2 O، والحرارة إلى حل. قسامة الحل والتجميد للتخزين. وأشار تركيزات النهائية تشير إلى متوسط ​​نهائي وليس الحل المعادن النزرة.

نهائي تركيز الأسهم حل المبلغ 1 ليتر
فيتامين ب 12 1 × 10 -10 م 1 غرام / لتر درهم O 2 1 مل
البيوتين 1 × 10 -9 م 0.1 غ / لتر درهم 2 O 10 مل
الثيامين • حمض الهيدروكلوريك 1 × 10 -7 M 200 ملغ

الجدول 3. و / 2فيتامين حل 11. مستحضرات التجميل إلى ما مجموعه 1 ليتر في DH 2 O، فلتر تعقيم، قسامة والتجميد. وأشار تركيزات النهائية تشير إلى متوسط ​​نهائي وليس الحل فيتامين.

الشكل 1
الشكل 1. رسومية محة عامة عن إجراءات التحول. تمثيل تخطيطي لإجراء لتحويل وراثيا Ostreococcus tauri بواسطة electroporation.

الشكل 2
الشكل 2. نمو الثقافة. الخلايا هي شبه مثقف جو معقم و مطهر حتى التخفيف من 100/1 في ASW جديدة كل 7 أيام، وتنمو تحت ضوء مستمر في محطة حاضنة للنمو مزودة ضوء القمر الأزرق مرشح. وينبغي أن شدة الضوء تكون قريبة إلى 20 μmol م -2 ث -1، ويتم الاحتفاظ درجة الحرارة عند 20 درجة مئوية خلايا لا تحتاج إلى تحريض مستمر، ولكن لياليصخر مرة واحدة كل يوم 2 إلى 3 لمنع تجميع.

الشكل (3)
الشكل 3. تشكيل مستعمرة في الاغاروز LMP 0.2٪. نقل 4 لوحات على طبق بيتري كبيرة مربعة، وختم مع parafilm (أعلى اليسار). عندما شكلت مستعمرات، ببساطة اختيار حر (مثالي على شكل مخروطي) المستعمرات (أعلى يمين) وأمتص لهم للخروج من لوحة مع ماصة P200. وينبغي أن يكون هناك مستعمرات في وحدة التحكم السلبية (أسفل اليمين).

Discussion

الخلوية الدولة وثقافة axeny له أهمية حاسمة بالنسبة لإجراء تحول. على الرغم من أن يتم الاحتفاظ عادة الخلايا في دورات من 12 ساعة ضوء ذلك، تم العثور على 12 ساعة مظلمة، وكفاءة في تحويل خلايا نمت في ظل هذه الظروف غير كافية. خلال الخطوات التكوير / إعادة تعليق المتكررة، يجب أن الخلايا resuspend دائما بسهولة. إذا خلايا الكلية، أو على مادة تشبه المخاط موجودا، فمن الأفضل لبدء هذا الإجراء من البداية مرة أخرى. عادة، يمكن توقع ~ 50 المستعمرات في كل لوحة تحول، مقابل لا شيء على لوحة تحكم سلبي. في حالة انخفاض كفاءة التحويل، ينبغي أن تختلف ظروف زراعة لضمان الخلايا هي في حالة مثلى. المتغيرات التي تؤثر على كفاءة تحويل وتشمل درجة الحرارة المحيطة في المختبر (يجب أن تكون قريبة من 20 درجة مئوية)، وسرعة التعامل مع (إجراء من التكوير خلايا [2.3] لاسترداد [2،7] ينبغي أن تأخذ ~ 1 ساعة). من المهم أيضا أن كل الحلول 1جعل إعادة الطازجة قبل كل تحول. لإدراجها في لوحات، وتركيز الاغاروز LMP أمر بالغ الأهمية. الخلايا Ostreococcus لن تنمو في تركيزات عالية الاغاروز، وسيتم نشرها في التركيزات المنخفضة.

وقد تم نشر ثلاث ناقلات تحول لOstreococcus سابقا ويتوقع المزيد من ناقلات إلى أن ولدت، ونشرت في وقت قريب. الموجه الحالية وعاء لوك 6 يسمح استعمال promotor من خيار في تركيبة مع علامة اليراع C-محطة luciferase المراسل السماح أسرع المعدلة وراثيا اختيار خط زائد أنماط التعبير لين العريكة، في حين أن ناقلات Potox 6 يحمل قوي محرض 13 promotor مأخوذة من Ostreococcus ارتفاع الناقل الفوسفات الانجذاب (اللمس) جين overexpression من هذا الجين من الفائدة. الموجه Potox لوك مستمد من Potox، يحمل علامة luciferase المراسل الإضافية التي يمكن استخدامها لاختيار غير المباشرة للخطوط overexpression Ostreococcus هي مقاومة عالية للكثير من المضادات الحيوية، وتركيزات المركبات الضرورية لتحديد الخلايا المعدلة وراثيا Ostreococcus أعلى من النموذج التقليدي للنظم (2 ملغ / مل).

على الرغم من أن عملية يبدو غير فعال، وعدد كبير من الخلايا والحمض النووي البلازميد اللازمة لهذا الإجراء لا يشكل عقبة كبيرة. وأكبر القيد هو أن كل خط المولدة التي هي مقاومة للعلامة اختيار يحتاج إلى تحليل فردي للتأكد من أن يتم دمج كامل التركيبة في الحمض النووي. وقد لاحظنا في الأمثلة التي التعبير الناجح لعلامة اختيار لم تكن مناسبة للادراج في الجينات الفعلية في المصالح؛ التكاملات أي جزئية يمكن أن يحدث. من الواضح، الإدراج عشوائية في جينوم يعني أيضا أنه ليست هناك سيطرة من موقع الإدراج باستخدام هذا الأسلوب، وأساليب بويجري حاليا ased على إعادة التركيب مماثل يجري وضعها. ومع ذلك، وصفت طريقة هنا هو، لمعرفة أفضل لنا، في الوقت الراهن أسلوب يتميز فقط على توليد خلايا Ostreococcus المعدلة وراثيا.

كما تم مؤخرا فقط Ostreococcus tauri تستخدم كائن النموذج التجريبي، ومعظم أساليب العمل مع هذه الخلايا من المحتمل أن تتطور ويتم تكريره من قبل الأوساط البحثية المتنامية المعنية. ويهدف هذا البروتوكول لمساعدة الناس على الشروع في العمل مع Ostreococcus، ولكن بأي حال من الأحوال يدعي لوصف كل ما يمكن معرفته عن التحول الجيني لهذا microalga. على ثقة من الكتاب أن القراء سوف تكون قادرة على التكيف مع هذا البروتوكول لاحتياجاتها الخاصة والفروق الصغيرة في الحاضنات (مستويات الضوء أو النوعية) وغيرها من المعالم وجود وسوف يكون من المحتمل أن يكون الأمثل في كل مختبر الفردية للحصول على الثقافات الصحية اللازمة لهذا بروتوكول. بعد اتقان التقنيات وصفت هنا،ويمكن بناء ناقلات لتوليد الانارة، فلوري، أو غيرها من خطوط الانصهار الموسومة تحت سيطرة مجموعة من الدعاة. وهذه التجارب رواية مثيرة منصة مفيدة لدراسة كيفية حل مشاكل معقدة البيوكيميائية في خفض حقيقي النواة من التعقيد، والتي هي سهلت للغاية نهج الدوائية 3.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

SynthSys مركز بيولوجيا الأنظمة التكاملية تموله BBSRC وجائزة EPSRC D019621. وقد مول الاتحاد الأوروبي FP6 شبكة التميز منحة "الجينوم البحرية" لFYB تطوير أساليب التحول الجيني.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Medium constituents
Instant Ocean Marine Salt from amazon.co.uk or rocketaquatics.co.uk
NaNO3 S5506-250G Sigma
NH4Cl A9434-500G Sigma
Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate G9422-100G Sigma
H2SeO3 84920-250G Sigma
Ultra pure tris 15504-020 Invitrogen
Na2EDTA∙2H2O BPE120-500G Fisher Scientific
FeCl3∙6H2O 157740 Sigma
Na2MoO4∙2H2O 31439-100G-R Sigma
ZnSO4∙7H2O Z0251 Sigma
CoCl2∙6H2O 31277 Sigma
MnCl2∙4H2O 203734-5G Sigma
CuSO4∙5H2O C8027 Sigma
Vitamin B12 (cyanocobalamin) V2876 Sigma
Biotin 47868 Sigma
Thiamine ∙ HCl T4625 Sigma
Ampicillin A9518-25G Sigma
Neomycin N6386 Sigma
Kanamycin K4000 Sigma
Consumables for culturing
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1810.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1813.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1812.502 Starstedt
TPP Bottle top filters, 1L, complete 99950T Helena Bioscience
TPP Bottle top filters, 500ml, 99500T Helena Bioscience
TPP Bottle top filters, 250ml, 99250T Helena Bioscience
TPP Bottle top filters, 150ml, 99150T Helena Bioscience
Salinity Meter for Marine Aquarium DSG-10 Daeyoon
Chemicals for transformation
D-Sorbitol S6021-1KG Sigma
Pluronic F-68 solution P5556-100ML Sigma
ClonNat 51000 Werner
Low melting point agarose 16520-050 Invitrogen
Consumables for transformation
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1810.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1813.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1812.502 Starstedt
Greiner centrifuge tubes 50ml 227261 GBO
Gene Pulser/MicroPulser Cuvettes, 0.2 cm gap, 50 165-2086 Bio-Rad
Petri dish round PS 3 VENTS H14.2 Φ55 391-0895 VWR International
Petri dish square with four vents polystyrene sterile by irradiation clear 120mm FB51788 Fisher Scientific
Moonlight Blue light filter 183 Lee Lighting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Derelle, E. Genome analysis of the smallest free-living eukaryote Ostreococcus tauri unveils many unique features. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11647-11652 (2006).
  2. Henderson, G. P., Gan, L., Jensen, G. J. 3-D ultrastructure of O. tauri: electron cryotomography of an entire eukaryotic cell. PLoS One. 2, e749 (2007).
  3. O'Neill, J. S. Circadian rhythms persist without transcription in a eukaryote. Nature. 469, 554-558 (2011).
  4. van Ooijen, G., Dixon, L. E., Troein, C., Millar, A. J. Proteasome function is required for biological timing throughout the twenty-four hour cycle. Curr. Biol. 21, 869-875 (2011).
  5. Troein, C. Multiple light inputs to a simple clock circuit allow complex biological rhythms. Plant. J. 66, 375-385 (2011).
  6. Corellou, F. Clocks in the green lineage: comparative functional analysis of the circadian architecture of the picoeukaryote ostreococcus. Plant Cell. 21, 3436-3449 (2009).
  7. O'Neill, J. S., Reddy, A. B. Circadian clocks in human red blood cells. Nature. 469, 498-503 (2011).
  8. Monnier, A. Orchestrated transcription of biological processes in the marine picoeukaryote Ostreococcus exposed to light/dark cycles. B.M.C. Genomics. 11, 192 (2010).
  9. Le Bihan, T. Shotgun proteomic analysis of the unicellular alga Ostreococcus tauri. J. Proteomics. 74, 2060-2070 (2011).
  10. Expression of polypeptides from the nuclear genome of Ostreococcus sp. US application patent. Corellou, F., Bouget, F. -Y. 201001174050 (2010).
  11. Guillard, R. R. L., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Can. J. Microbiol. 8, 229-239 (1962).
  12. Keller, M. D., Selvin, R. C., Claus, W., Guillard, R. R. L. Media for the culture of oceanic ultraphytoplankton. J. Phycol. 23, 633-638 (1987).
  13. Djouani-Tari, elB. A phosphate-regulated promoter for fine-tuned and reversible overexpression in Ostreococcus: Application to circadian clock functional analysis. PLoS One. 6, e28471 (2011).
  14. Moulager, M. Integration of light signals by the retinoblastoma pathway in the control of S phase entry in the picophytoplanktonic cell Ostreococcus. PLoS. Genet. 6, e1000957 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics