Genomic Transformatie van de Picoeukaryote

Biology
 

Summary

Dit artikel beschrijft genetische transformatie van de eencellige mariene algen

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

van Ooijen, G., Knox, K., Kis, K., Bouget, F. Y., Millar, A. J. Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri. J. Vis. Exp. (65), e4074, doi:10.3791/4074 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Veel voorkomende problemen belemmeren een snelle vooruitgang in de Plant Sciences zijn cellulair, weefsel en hele organisme complexiteit, en met name het hoge niveau van genomische redundantie die simpele genetica in hogere planten. De nieuwe modelorganisme Ostreococcus tauri de kleinste vrijlevende eukaryote tot dusver bekend, en heeft een sterk verminderde genoomgrootte en cellulaire complexiteit 1,2, blijkt uit de aanwezigheid van slechts een van de organellen (mitochondrion, chloroplast, Golgi stack) per cel en een genoom dat alleen ~ 8000 genen. Bovendien is de combinatie van unicellularity gemakkelijk cultuur een platform vatbaar chemische biologie benaderingen. Onlangs heeft Ostreococcus met succes gebruikt om fundamentele mechanismen ten grondslag liggen aan circadiane tijdwaarneming 3-6 te bestuderen. De resultaten van dit model organisme zijn niet alleen gevolgen voor planten wetenschap, maar ook zoogdieren biologie 7. Dit voorbeeld maakt hoe snel experimenten in eeneenvoudige eukaryoot van de groene lijn kan versnellen onderzoek in meer complexe organismen door het genereren van toetsbare hypothesen met behulp van methoden technisch mogelijk alleen in de achtergrond van de verminderde complexiteit. Kennis van een genoom en de mogelijkheid om genen te passen essentiële elementen zijn in een model soort. Genomic 1, transcriptoom 8 en 9 Proteoom informatie voor deze soort is vrij beschikbaar, terwijl de eerder gemelde 6,10 methoden om genetisch te transformeren Ostreococcus is bekend dat ze enkele laboratoria overal ter wereld.

In dit artikel, de proefmethoden genetisch transformeren deze nieuwe modelorganisme overexpressie construeren door middel van elektroporatie worden beschreven in detail, alsmede de wijze van toevoeging van getransformeerde cellen bij lage percentage agarose om selectie van getransformeerde lijnen afkomstig van een een getransformeerde cel. Na de succesvolle toepassing van Ostreococcus naar circadiane onderzoek kan groeiende belangstelling voor Ostreococcus worden verwacht van diverse onderzoeksgebieden binnen en buiten Plant Sciences, met inbegrip van biotechnologische gebieden. Onderzoekers van een breed scala aan biologische en medische wetenschappen die werken aan geconserveerde biochemische pathways kunnen overwegen bezighouden met onderzoek in Ostreococcus, vrij van de genomische en organismaal de complexiteit van groter model soorten.

Protocol

1. Voorbereiding van algen Materiaal

  1. Ostreococcus cellen worden gekweekt in kunstmatig zeewater (ASW). Zeezouten (typisch ongeveer 40 g per liter) worden opgelost in gedeïoniseerd water tot een saliniteit van 30 ppt, zoals gemeten met een saliniteit meter. Aanrijkingsmedium 11,12, zware metalen elementen en vitaminen worden toegevoegd zoals beschreven in tabellen 1-3. De media is dan filter-gesteriliseerd door een 0,22 pm filter.
  2. Voor het onderhoud, de cellen van Ostreococcus stam OTTH95 zijn sub-gekweekt aseptisch in een verdunning van 1/100 in zoet ASW om de 7 dagen en geteeld onder constant licht in een groei van de plant incubator uitgerust met Moonlight Blue filter. De lichtintensiteit moet ongeveer 20 mol m -2 s -1 zijn en temperatuur wordt op 20 ° C. Cellen niet nodig constant roeren, maar geschud om de 2 tot 3 dagen aggregatie te voorkomen.
  3. Voor elke transformatie worden 50 ml cellen vereist bij de celnsity 20-30 x 10 6 ml-1, dat moet 5-7 dagen worden bereikt na sub-kweken. Geschatte celdichtheid axeny kan worden bepaald met behulp van flow cytometrie of een hemocytometer op minimaal x40 vergroting.

2. Elektroporatie

  1. Bereid DNA voor de transformatie. Per transformatie wordt 5 ug zuivere gelineariseerde plasmide DNA vereist bij een concentratie van 1 pg / pl in steriel gedeïoniseerd water. Om dit DNA te verkrijgen, de auteurs raden het gebruik van een Qiagen midi prep-kit, maar ook andere methoden kan even goed werken. Digest het product met een enzym dat snijdt in de ruggengraat van de gebruikte vector, maar niet in de transgene of selectie gen. Verder te zuiveren en te concentreren de resulterende lineaire DNA door ethanol precipitatie, en mengen van het product in de juiste hoeveelheid hoogwaardige steriel gedeïoniseerd water.
  2. Bereid microcentrifugebuizen met 5 ug DNA voor elke transformatie. Een control zonder DNA nodig voor elke cellijn worden getransformeerd. Houd deze buizen op ijs, met een 2 mm elektroporatie cuvet voor elke transformatie.
  3. Bereid 2,2 ml van resuspentie buffer per transformatie. Los Sorbitol een 1 M oplossing in DDH 2 O toevoegen 0,1% pluronisch zuur F68 en filter-steriliseren.
  4. Voeg pluronisch zuur F68 tot een eindconcentratie van 0,1% van de cellen en hun pellet gedurende 10 minuten bij 8000x g bij 10 ° C in een 50 ml buis konische bodem. Onmiddellijk resuspendeer de cellen in 1 ml buffer resuspensie door en neer te pipetteren, en over te dragen aan een microfugebuis. Spin down gedurende 10 minuten bij 8000 xg bij 10 ° C en snel te werken, herhaalt u deze wasstap nog een keer.
  5. Met een snee tip, resuspendeer elke laatste pellet in 40 pi van resuspensie buffer. Voeg 40 ul van de geresuspendeerde cellen aan elke buis van gelineariseerde DNA op het ijs, voorzichtig mengen en over te dragen aan de elektroporatie cuvette.
  6. Plaats de cuvet in de electroporatie machine. Wijzig de instellingen tot 6 kV cm -1, 600 Ω, en 25 uF. Electroporate de cellen.
  7. Incubeer de electoporated cellen in de cuvetten bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en gebruikt die tijd de weefselkweekflessen bereiden. Label ze en voeg 30 ml vers ASW aan elk. Neem 1 ml uit elke kolf en voorzichtig toe te voegen aan de betreffende kuvet. Incubeer gedurende 2 minuten en verwijder voorzichtig de ASW, nu met het bolletje van cellen en voorzichtig en langzaam direct pipet in de ASW in de cultuur kolf.
  8. Cellen meestal nog een globule. Zorg ervoor dat u schudden of de geaggregeerde cellen verstoren op dit moment. Laat de cellen in de incubator te herstellen gedurende 1-2 uur, daarna mengen door schudden van de kolven. Op dit moment moet de cellen vrij te resuspenderen en geen klonten zichtbaar moeten zijn. Laat de culturen om 's nachts terug in de incubator.

3. Opname van cellen op platen in Semi-vast medium

    2 O in een fles met een roerstaaf. Houd gesmolten bij 65-90 ° C in een grotere bekerglas met water op een verwarmingsinrichting magneetroerder. Voor elke transformatie bereiden 8 petrischalen (55 mm diameter) en 8 x 15 ml; elk met 9 ml ASW plus de gewenste selectie. Bij gebruik van Nourseothricin of G418, gebruik dan 2 mg / ml.
  1. Verzamel de getransformeerde cellen uit de incubator. Het werken in een steriele flowhood, 1 ml kokend LMP agarose de 9 ml in een van de buizen. Sluit de buis, en meng door. Voeg vervolgens 0,5 ml van een vers getransformeerde cellen, snel door elkaar en giet het in de plaat. Herhaal dit proces met de resterende 7 buizen en ga verder met de volgende transformatie kolf.
  2. Laat de platen te openen in de stroom kap voor een uur, voor de agarose op te zetten. Sluit vervolgens de borden en zet ze tot grote vierkante Petri-schalen, en een capaciteit van 4 borden elk. Sluit de vierkante borden with Parafilm. Merk op dat de platen niet volledig vastgesteld, en daardoor de gel is zeer kwetsbaar. Zorg ervoor dat u niet om de gel te breken bij het hanteren van de platen. Plaats alle vierkante borden in de incubator.

4. Selectie van getransformeerde kolonies

  1. Kolonies moeten verschijnen na 10 tot 21 dagen op de transformatie platen, maar niet op de mock getransformeerd platen. Op te halen kolonies een 200 ul pipet te gebruiken met cut-off tips. Selecteer gewoon gratis kolonies en zuigen het groene kolonie. Zorg ervoor dat u alle cellen van naburige kolonies op te nemen.
  2. Breng de cellen 2 ml vloeibaar medium bevatten de selectie, in een 24 wells plaat. Bij gebruik Nourseothricin gebruikt 1,75 mg / ml. Meng door en neer te pipetteren. Kies 24-50 kolonies per transformatie. Sluit de platen met parafilm en transfer naar de incubator.
  3. Na een week overdracht 100 pi van elk putje 2 ml verse ASW met selectie in een 24 wells plaat en groeien op een additionaliteitsdebatl 7 dagen. Overlevende cellijnen worden gebruikt voor verdere studies. Stabiele integratie in het genoom en insertie nummer moet worden geanalyseerd met PCR en Southern blot. Genomisch DNA kan worden verkregen voor deze doeleinden gebruik van een down-schaal standaardmethode voor het planten DNA-extractie.

5. Representatieve resultaten

Cellen verdeeld honderdste een dichtheid van 25 miljoen cellen per milliliter na het kweken gedurende 7 dagen. Elektroporatie van cellen met de gewenste instellingen resulteerde in een tijdconstante tussen 10 en 14 milliseconden. Wanneer cellen worden overgebracht naar medium in kweekflessen moet een bolletje cellen vormen. Bij het licht geschud na een uur, moeten de cellen goed kunnen mengen. Opneming van 1 ml getransformeerde cellen in 0,2% agar LMP moet resulteren in een consistente maar halfvaste gel. Kolonies moeten verschijnen na 10 tot 21 dagen. Wanneer transformerende 5 ug gelineariseerde DNA met de bovenstaande protocol 50-100 kolonies per transformatieplaat werden meestal verwacht, ten opzichte van niets op de negatieve controle platen. Ongeveer 80% van kolonies werden opgepikt positief geselecteerd resistentie in een vloeibaar medium en werden gebruikt voor verdere studies.

Eindconcentratie Stock oplossing Volume voor 1 liter
NaNO 3 8,83 x 10 -4 M 75 g / L dH 2 O 1 ml
NH4CI 3,63 x 10 -5 M 2,68 g / L dH 2 O 1 ml
β-glycerofosfaat 1 x 10 ~ 5 M 2,16 g / L dH 2 O 1 ml
H 2 3 SeO 1 x 10 ~ 8 M 1,29 mg / L dH 2 O 1 ml
Tris-base (pH 7,2) 1 x 10 -3 M 121,1 g / L dH 2 O 1 ml
K trace oplossing van het metaal Tabel 2 1 ml
f / 2 vitamine oplossing Tabel 3 0,5 ml

Tabel 1. Medium bestanddelen voor de groei van O. tauri 11, 12. maken tot een totaal volume van 1 liter kunstmatig zeewater een saliniteit van 30 ppt, en voeg de hierboven beschreven onderdelen van voorraadoplossingen aangegeven. Filter-steriliseren op de middellange en gebruik binnen een week. Voorraden van alle verbindingen met uitzondering van de vitamine oplossing wordt samengevoegd tot 6 ml van deze oplossing toegevoegd per liter medium.

Eindconcentratie Stock oplossing Hoeveelheid voor 1 liter
Na 2 2 O 1 x 10 -4 M 41,6 g
FeCl 3 • 6H 2 O 1 x 10 ~ 5 M 3,15 g
Na 2 MoO 4 • 2H 2 O 1 x 10 ~ 8 M 6,3 g / L dH 2 O 1 ml
ZnSO 4 • 7H 2 O 1 x 10 9 M 22,0 g / L dH 2 O 1 ml
CoCl 2 • 6H 2 O 1 x 10 9 M 10,0 g / L dH 2 O 1 ml
MnCl2 • 4H 2 O 1 x 10 ~ 8 M 180,0 g / L dH 2 O 1 ml
CuSO 4 • 5H 2 O 1 x 10 ~ 8 M 9,8 g / L dH 1 ml

Tabel 2. Trace oplossing van het metaal 11,12. Vul aan tot een totaal van 1 liter, in dH 2 O, en warmte op te lossen. Aliquot de oplossing en bevriezen voor opslag. Final concentraties hebben betrekking op het uiteindelijke medium, niet het spoor oplossing van het metaal.

Eindconcentratie Stock oplossing Hoeveelheid voor 1 liter
Vitamine B 12 1 x 10 10 M 1 g / L dH 2 O 1 ml
Biotine 1 x 10 9 M 0,1 g / L dH 2 O 10 mL
Thiamine • HCl 1 x 10 -7 M 200 mg

Tabel 3. f / 2vitamine oplossing 11. aan tot een totaal van 1 liter in dH 2 O, filter-steriliseren, hoeveelheid en vries. Eindconcentraties betrekking op het uiteindelijke medium, niet de vitamine oplossing.

Figuur 1
Figuur 1. Grafisch overzicht van de transformatie procedure. Schematische weergave van de procedure om genetisch Ostreococcus Tauri te transformeren door middel van elektroporatie.

Figuur 2
Figuur 2. Cultuur groei. Cellen zijn sub-gekweekt aseptisch in een verdunning van 1/100 in zoet ASW om de 7 dagen en geteeld onder constant licht in een groei van de plant incubator uitgerust met Moonlight Blue filter. De lichtintensiteit gelijk zou zijn aan 20 umol m -2 s -1 en temperatuur op 20 ° C cellen niet constant roeren vereisen, maar ishaken om de 2 of 3 dagen om aggregatie te voorkomen.

Figuur 3
Figuur 3. Colony formatie op 0,2% LMP agarose. Transfer 4 borden een groot plein petrischaal en afdichting met parafilm (links boven). Wanneer kolonies zijn gevormd, selecteert u gewoon gratis (bij voorkeur conisch gevormde) kolonies (rechtsboven) en zuigen ze uit de plaat met een P200 pipet. Er mogen geen kolonies op de negatieve controle (rechtsonder).

Discussion

Cellulaire staat en cultuur axeny is van cruciaal belang voor de transformatie procedure. Hoewel cellen worden meestal onderhouden in cycli van 12 uur licht en werden 12 uur donker, efficiëntie van de omzetting in cellen gekweekt onder deze omstandigheden onvoldoende blijken te zijn. Tijdens de herhaalde pellets / resuspensie stappen moeten cellen altijd gemakkelijk mengen. Als cellen aggregaat, of een slijm-achtige substantie aanwezig is, is het beter om de procedure opnieuw te beginnen vanaf het begin. Meestal kan ~ 50 kolonies worden verwacht op elke transformatie plaat, ten opzichte van niets op de negatieve controle plaat. Bij lage efficiëntie van de omzetting dient teeltomstandigheden worden gevarieerd om cellen in de optimale stand. Variabelen die transformatie efficiëntie beïnvloeden, zijn onder de omgevingstemperatuur in het laboratorium (moet in de buurt van 20 ° C zijn) en de behandeling snelheid (Procedure van pelleteren cellen [2,3] naar herstel [2,7] moet ~ 1 uur duren). Het is ook belangrijk dat oplossingen eenre gemaakt vers voor elke transformatie. Voor opname in platen, de concentratie van LMP agarose essentieel. Ostreococcus cellen groeien niet in hoge concentraties agarose, en diffunderen in lage concentraties.

Drie transformatievectoren voor Ostreococcus zijn eerder gepubliceerd 6, en nog veel meer vectoren zullen naar verwachting worden gegenereerd en binnenkort gepubliceerd. De bestaande vector Pot-Luc 6 maakt het gebruik van een promotor naar keuze in combinatie met een C-terminale vuurvlieg luciferase-tag waardoor een snellere transgene lijn selectie plus handelbaar expressie patronen, terwijl de Potox vector 6 draagt ​​de sterke induceerbare 13 promotor uit de Ostreococcus hoge affiniteit fosfaat Transporteur (HAPT) gen voor overexpressie van het gen van belang. De Potox-Luc vector afgeleid van Potox, die een extra luciferase marker kan worden gebruikt voor indirecte selectie van lijnen overexpressie Ostreococcus cellen zeer goed bestand tegen verschillende antibiotica en de concentraties van verbindingen die nodig zijn voor selectie van transgene Ostreococcus cellen hoger dan bij conventionele modelsysteem (2 mg / ml).

Hoewel de werkwijze weergegeven inefficiënt het grote aantal cellen en plasmide DNA nodig voor deze werkwijze vormt geen significante hindernis. Een grotere beperking is dat elke opgewekte lijn die bestand is tegen de selecteerbare marker dient te worden geanalyseerd om te controleren of de gehele constructie is geïntegreerd in de DNA. Wij hebben opgemerkt voorbeelden waarin succesvolle expressie van de selecteerbare marker niet overeen met het inbrengen van het genproduct van interesse, dat wil zeggen gedeeltelijke integratie optreden. Blijkbaar willekeurige integratie in het genoom betekent ook dat er geen beperking van de insteekopening deze methode en methoden bebaseerd op homologe recombinatie worden momenteel ontwikkeld. Echter, de hier beschreven methode is, naar ons beste weten, momenteel de enige gekenmerkt methode om genetisch gemodificeerde Ostreococcus cellen te genereren.

Als Ostreococcus Tauri is pas sinds kort gebruikt als experimenteel model organisme, de meeste methoden het werken met deze cellen voor verandering vatbaar is en verfijnd worden door de groeiende betrokken onderzoeksgemeenschap. Dit protocol is bedoeld om mensen te helpen werk te starten met Ostreococcus, maar op geen enkele wijze beweert te beschrijven alles wat er te weten valt over genomische transformatie van deze microalga. De auteurs vertrouwen dat lezers in staat zijn om dit protocol aan te passen aan hun eigen behoeften als kleine verschillen in de incubators (licht of kwaliteit) en andere parameters zal bestaan ​​en waarschijnlijk geoptimaliseerd moeten worden in ieder afzonderlijk laboratorium naar de gezonde culturen die nodig zijn voor deze te verkrijgen protocol. Na het beheersen van de technieken die hier beschreven,vectoren kunnen worden geconstrueerd luminescerende, fluorescent of andere gelabeld fusie lijnen onder besturing van een aantal promotoren genereren. Deze spannende roman experimenteel platform zal nuttig zijn om te onderzoeken hoe ingewikkelde biochemische problemen worden opgelost in een eukaryoot van verminderde complexiteit, waarbij farmacologische benaderingen zeer vergemakkelijkt worden 3.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

SynthSys een Centre for Integrative Systems Biology gefinancierd door BBSRC en EPSRC award D019621. EU FP6 Network of Excellence 'Marine Genomics "subsidie ​​aan Fyb heeft gefinancierd ontwikkeling van genetische transformatie methoden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Medium constituents
Instant Ocean Marine Salt from amazon.co.uk or rocketaquatics.co.uk
NaNO3 S5506-250G Sigma
NH4Cl A9434-500G Sigma
Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate G9422-100G Sigma
H2SeO3 84920-250G Sigma
Ultra pure tris 15504-020 Invitrogen
Na2EDTA∙2H2O BPE120-500G Fisher Scientific
FeCl3∙6H2O 157740 Sigma
Na2MoO4∙2H2O 31439-100G-R Sigma
ZnSO4∙7H2O Z0251 Sigma
CoCl2∙6H2O 31277 Sigma
MnCl2∙4H2O 203734-5G Sigma
CuSO4∙5H2O C8027 Sigma
Vitamin B12 (cyanocobalamin) V2876 Sigma
Biotin 47868 Sigma
Thiamine ∙ HCl T4625 Sigma
Ampicillin A9518-25G Sigma
Neomycin N6386 Sigma
Kanamycin K4000 Sigma
Consumables for culturing
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1810.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1813.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1812.502 Starstedt
TPP Bottle top filters, 1L, complete 99950T Helena Bioscience
TPP Bottle top filters, 500ml, 99500T Helena Bioscience
TPP Bottle top filters, 250ml, 99250T Helena Bioscience
TPP Bottle top filters, 150ml, 99150T Helena Bioscience
Salinity Meter for Marine Aquarium DSG-10 Daeyoon
Chemicals for transformation
D-Sorbitol S6021-1KG Sigma
Pluronic F-68 solution P5556-100ML Sigma
ClonNat 51000 Werner
Low melting point agarose 16520-050 Invitrogen
Consumables for transformation
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1810.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1813.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1812.502 Starstedt
Greiner centrifuge tubes 50ml 227261 GBO
Gene Pulser/MicroPulser Cuvettes, 0.2 cm gap, 50 165-2086 Bio-Rad
Petri dish round PS 3 VENTS H14.2 Φ55 391-0895 VWR International
Petri dish square with four vents polystyrene sterile by irradiation clear 120mm FB51788 Fisher Scientific
Moonlight Blue light filter 183 Lee Lighting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Derelle, E. Genome analysis of the smallest free-living eukaryote Ostreococcus tauri unveils many unique features. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11647-11652 (2006).
  2. Henderson, G. P., Gan, L., Jensen, G. J. 3-D ultrastructure of O. tauri: electron cryotomography of an entire eukaryotic cell. PLoS One. 2, e749 (2007).
  3. O'Neill, J. S. Circadian rhythms persist without transcription in a eukaryote. Nature. 469, 554-558 (2011).
  4. van Ooijen, G., Dixon, L. E., Troein, C., Millar, A. J. Proteasome function is required for biological timing throughout the twenty-four hour cycle. Curr. Biol. 21, 869-875 (2011).
  5. Troein, C. Multiple light inputs to a simple clock circuit allow complex biological rhythms. Plant. J. 66, 375-385 (2011).
  6. Corellou, F. Clocks in the green lineage: comparative functional analysis of the circadian architecture of the picoeukaryote ostreococcus. Plant Cell. 21, 3436-3449 (2009).
  7. O'Neill, J. S., Reddy, A. B. Circadian clocks in human red blood cells. Nature. 469, 498-503 (2011).
  8. Monnier, A. Orchestrated transcription of biological processes in the marine picoeukaryote Ostreococcus exposed to light/dark cycles. B.M.C. Genomics. 11, 192 (2010).
  9. Le Bihan, T. Shotgun proteomic analysis of the unicellular alga Ostreococcus tauri. J. Proteomics. 74, 2060-2070 (2011).
  10. Expression of polypeptides from the nuclear genome of Ostreococcus sp. US application patent. Corellou, F., Bouget, F. -Y. 201001174050 (2010).
  11. Guillard, R. R. L., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Can. J. Microbiol. 8, 229-239 (1962).
  12. Keller, M. D., Selvin, R. C., Claus, W., Guillard, R. R. L. Media for the culture of oceanic ultraphytoplankton. J. Phycol. 23, 633-638 (1987).
  13. Djouani-Tari, elB. A phosphate-regulated promoter for fine-tuned and reversible overexpression in Ostreococcus: Application to circadian clock functional analysis. PLoS One. 6, e28471 (2011).
  14. Moulager, M. Integration of light signals by the retinoblastoma pathway in the control of S phase entry in the picophytoplanktonic cell Ostreococcus. PLoS. Genet. 6, e1000957 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics