Genomic Transformation des Picoeukaryote

Biology
 

Summary

Dieser Artikel beschreibt die genetische Transformation der einzelligen Alge

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van Ooijen, G., Knox, K., Kis, K., Bouget, F. Y., Millar, A. J. Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri. J. Vis. Exp. (65), e4074, doi:10.3791/4074 (2012).

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Abstract

Häufige Probleme behindert schnelle Fortschritte in Plant Sciences zählen Zell-, Gewebe und ganzen Organismus Komplexität und vor allem das hohe Niveau der genomischen Redundanz beeinflussen einfache Genetik in höheren Pflanzen. Das erfindungsgemäße Modellorganismus Ostreococcus tauri ist die kleinste frei lebenden eukaryotischen bisher bekannten und besitzt einen stark reduzierten Genomgröße und zelluläre Komplexität 1,2, durch die Anwesenheit von nur einer der Organellen (Mitochondrien, Chloroplasten, Golgi) pro manifestiert Zelle, und ein Genom, das nur ~ 8000 Gene. Weiterhin stellt die Kombination von unicellularity und einfache Kultur eine Plattform zugänglich chemische Ansätze. Vor kurzem hat Ostreococcus erfolgreich eingesetzt, um grundlegende Mechanismen der zirkadianen Zeitmessung 3-6 studieren. Die Ergebnisse dieser Modell-Organismus haben nicht nur Plant Science beeinflusst, sondern auch Säugetierbiologie 7. Dieses Beispiel macht deutlich, wie schnell ein Experimentieren ineinfache Eukaryoten aus der grünen Linie kann die Forschung in komplexeren Organismen beschleunigen durch die Erzeugung überprüfbare Hypothesen mit Methoden technisch möglich nur in diesem Zusammenhang von geringerer Komplexität. Wissen eines Genoms und die Möglichkeit, Gene zu verändern sind unverzichtbare Werkzeuge in jedem Modell Arten. Genomic 1, Transkriptom 8, 9 und Proteom-Daten für diese Spezies ist frei verfügbar, während die zuvor berichteten Methoden zu 6,10 genetisch verändern Ostreococcus zu wenige Labors weltweit bekannt sind.

In diesem Artikel, um die experimentellen Verfahren, genetisch transformierbar diese neuartigen Modell Organismus mit einer Überexpression Konstrukt mittels Elektroporation werden im Detail beschrieben, sowie das Verfahren der Aufnahme von transformierten Zellen in geringen Prozentsatz Agarose die Selektion transformierter Linien von einem bestimmten einzigen transformierten Zelle. Nach der erfolgreichen Anwendung der OstreocoCCUs zu circadianen Forschung, kann wachsendes Interesse an Ostreococcus aus verschiedenen Forschungsbereichen innerhalb und außerhalb der Botanik einschließlich biotechnologischen Bereichen zu erwarten. Forscher aus einem breiten Spektrum von biologischen und medizinischen Wissenschaften, die auf biochemischen Wege konservierte arbeiten kann prüfen, forscht in Ostreococcus, frei von genomischer und organismischen Komplexität des größeren Modells Arten.

Protocol

1. Vorbereitung der Algenmaterial

  1. Ostreococcus Zellen werden in künstlichem Meerwasser (ASW) kultiviert. Meersalz (typischerweise etwa 40 Gramm pro Liter) in entionisiertem Wasser auf einen Salzgehalt von 30 ppt gelöst, wie unter Verwendung eines Salzgehalt Meter. Anreicherungsmedium 11,12, Spurenelemente und Vitamine Metall-Elemente hinzugefügt werden, wie in den Tabellen 1-3 beschrieben. Das Medium wird dann steril filtriert durch ein 0,22 um-Filter.
  2. Für die Wartung sind die Zellen des Stammes Ostreococcus OTTH95 subkultiviert aseptisch in einer Verdünnung von 1/100 in frischen ASW alle 7 Tage und aufgewachsen unter konstanten Licht in einem Inkubator mit Pflanzenwachstum Moonlight Blue Filter ausgestattet. Die Lichtintensität sollte in der Nähe 20 pmol m -2 s -1 sein und die Temperatur wird bei 20 ° C gehalten Die Zellen müssen nicht ständigem Rühren, aber geschüttelt einmal alle 2 bis 3 Tagen Aggregation zu verhindern.
  3. Für jede Transformation werden 50 ml der Zellen in einer Zelle erforderlich density von 20-30 x 10 6 ml -1, was erreicht 5-7 Tagen sollte nach Subkultivierung werden. Ungefähre Zelldichte und axeny kann unter Verwendung entweder Durchflusszytometrie oder eines Hämozytometers bei einem Minimum von x40 Vergrößerung werden.

2. Die Elektroporation

  1. Planen DNA für die Transformation. Für jede Transformation wird 5 ug der reinen, linearisierte Plasmid-DNA in einer Konzentration von 1 ug / ul in sterilem deionisiertem Wasser erforderlich. Um diese DNA zu erhalten, empfehlen die Autoren unter Verwendung eines Qiagen Midi-Prep-Kit, obwohl auch andere Methoden gleich gut funktionieren könnte. Verdau des Produkts mit einem Enzym, das in der Hauptkette des verwendeten Vektors schneidet, aber nicht in das Transgen oder Selektionsgen. Weiter zu reinigen und konzentrieren die resultierende lineare DNA durch Ethanolfällung, und resuspendieren Sie das Produkt in einem geeigneten Volumen an hochwertigen steriles entionisiertes Wasser.
  2. Bereiten Mikrozentrifugenröhrchen mit 5 ug DNA für jede Transformation. Ein control, ohne DNA, die für jede Zelllinie transformiert werden. Bewahren Sie diese Röhrchen auf Eis, zusammen mit einem 2 mm Elektroporationsküvette für jede Transformation.
  3. Bereiten Sie 2,2 ml pro Resuspensionspuffer Transformation. Auflösen Sorbit zu einer 1 M Lösung in ddH 2 O, fügen Sie 0,1% Pluronsäure F68 und Filter-sterilisiert werden.
  4. In Pluronsäure F68, bis zu einer Endkonzentration von 0,1% zu den Zellen, und das Pellet sie für 10 Minuten bei 8000x g bei 10 ° C in einem 50 ml-Röhrchen mit konischem Boden. Sofort die Zellen in 1 ml Resuspensionspuffer durch Auf-und Abpipettieren und Transfer zu einem Mikrozentrifugenröhrchen. Lysat für 10 Minuten bei 8000 xg bei 10 ° C, und arbeitet schnell, wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal waschen.
  5. Bei einem Cut Spitze, Resuspendieren jedes fertige Pellet in 40 ul Resuspensionspuffer. In 40 ul der resuspendierten Zellen in jedes Röhrchen von linearisierter DNA auf Eis, vorsichtig mischen und Transfer zum Elektroporationsküvette.
  6. Setzen Sie die Küvette in den electropRede Maschine. Ändern Sie die Einstellungen zu 6 kV cm -1, 600 Ω und 25 uF. Die Zellen zu elektroporieren.
  7. Inkubieren der Zellen in den electoporated Küvetten bei Raumtemperatur für 10 Minuten, und diese Zeit nutzen, um die Gewebekulturflaschen herzustellen. Beschriften Sie sie und fügen Sie 30 ml frisches ASW zu jedem. Nehmen Sie 1 ml aus jedem Kolben und fügen Sie es sanft auf die entsprechende Küvette. Inkubieren Sie für 2 Minuten und entfernen Sie vorsichtig die ASW, jetzt mit der Kugel von Zellen und langsam und vorsichtig direkt Pipette in die ASW in der Kulturflasche.
  8. Die Zellen bleiben in der Regel in einer Kugel. Achten Sie darauf, schütteln oder stören die aggregierten Zellen in diesem Moment. Lassen Sie die Zellen in den Inkubator für 1-2 Stunden erholen, dann durch Schütteln der Kolben zu resuspendieren. Zu diesem Zeitpunkt sollten die Zellen zu resuspendieren und frei keine Klumpen sichtbar sein soll. Lassen Sie die Kulturen sich zu erholen im Inkubator über Nacht.

3. Aufnahme von Zellen auf Platten in halbfesten Medium

    2 O in einer Flasche mit einem Rührstab. Halten Sie bei 65-90 ° C geschmolzen in einem größeren Becherglas mit Wasser auf der Heizung Magnetrührer. Für jede Transformation vorzubereiten 8 Petrischalen (55 mm Durchmesser) und 8 x 15 ml Tuben mit je 9 ml ASW sowie die gewünschte Auswahl. Bei Verwendung Nourseothricin oder G418, verwenden Sie 2 mg / ml.
  1. Sammeln Sie die transformierten Zellen aus dem Inkubator. Arbeiten in einer sterilen Flowhood, 1 ml kochendem LMP-Agarose auf die 9 ml in einem der Rohre. Schließen Sie den Schlauch, und mischen durch Invertieren. Dann fügen Sie 0,5 ml frisch transformierten Zellen, schnell mischen und in die Platte. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit den restlichen 7 Röhren und dann gehen Sie zum nächsten Transformation Kolben.
  2. Lassen Sie die Platten öffnen in der Strömung Haube für eine Stunde, für die Agarose zu setzen. Schließen Sie dann die Platten und übertragen Sie sie auf großen quadratischen Petrischalen, die mit 4 Platten, die jeweils halten wird. Verschließen Sie den quadratischen Platten with Parafilm. Beachten Sie, dass die Platten nicht vollständig eingestellt, und als Ergebnis ist das Gel sehr zerbrechlich. Darauf zu achten, um das Gel zu brechen beim Umgang mit den Platten sein. Legen Sie alle quadratischen Platten im Brutschrank.

4. Die Selektion von transformierten Kolonien

  1. Kolonien sollten nach 10 bis 21 Tagen auf den Platten Transformation, nicht aber auf den Mock-Platten verwandelt erscheinen. Zur Aufnahme Kolonien mit einem 200 ul Pipette mit abgeschnittenen Spitzen. Wählen Sie einfach kostenlos Kolonien und saugen Sie die grüne Kolonie. Achten Sie darauf, dass keine Zellen aus benachbarten Kolonien gehören.
  2. Übertragen der Zellen zu 2 ml der flüssigen Medium, das die Auswahl, in einer 24 Vertiefungen Platte. Bei der Verwendung von Nourseothricin, verwenden Sie 1,75 mg / ml. Mischen Sie durch Auf-und Abpipettieren. Wählen Sie 24-50 Kolonien pro Transformation. Versiegeln Sie die Platten mit Parafilm und Transfer in den Inkubator.
  3. Nach einer Woche, dann 100 ul jeder gut bis 2 ml frisch ASW mit Auswahl in einer 24 well-Platte und wachsen für eine additional 7 Tage. Hinterbliebener Zelllinien können für weitere Untersuchungen verwendet werden. Stabile Integration in das Genom und Insertion-Nummer sollte mittels PCR und Southern-Blot werden. Genomische DNA kann für diese Zwecke mit einem beliebigen herunterskalierten Standardmethode für Pflanzen-DNA-Extraktion erhalten werden.

5. Repräsentative Ergebnisse

Zellen aufgeteilt 1/100 erreicht eine Dichte von 25 Millionen Zellen pro Milliliter nach wachsender für 7 Tage. Die Elektroporation der Zellen mit den entsprechenden Einstellungen in Folge einer Zeitkonstante zwischen 10 und 14 Millisekunden. Wenn Zellen auf Medium in Kulturflaschen übertragen werden, sollte eine Kugel von Zellen zu bilden. Als nach einer Stunde leicht geschüttelt, sollten die Zellen leicht zu resuspendieren. Die Aufnahme von 1 ml transformierten Zellen in 0,2% LMP-Agar sollten in einem durchgängig, sondern nur halbfestes Gel führen. Kolonien sollten nach 10 bis 21 Tagen erscheinen. Bei der Umwandlung von 5 ug linearisierte DNA unter Verwendung des Protokolls oben, 50-100 Kolonien pro TransformationPlatte wurden in der Regel erwartet, im Vergleich zu keiner auf die negative Kontrolle Platten. ~ 80% der Kolonien wurden gepickt positiv Antibiotikaresistenz in einem flüssigen Medium ausgewählt und in nachfolgenden Studien verwendet.

Endkonzentration Stammlösung Volumen für 1 Liter
NaNO 3 8,83 x 10 -4 M 75 g / l dH 2 O 1 ml
NH 4 Cl 3,63 x 10 -5 m 2,68 g / l dH 2 O 1 ml
β-Glycerophosphat 1 × 10 -5 M 2,16 g / l dH 2 O 1 ml
H 2 SeO 3 1 x 10 -8 M 1,29 mg / l dH 2 O 1 ml
Tris-Base (pH 7,2) 1 × 10 -3 M 121,1 g / l dH 2 O 1 ml
K Spurenmetallösung Tabelle 2 1 ml
f / 2 Vitamin-Lösung Tabelle 3 0,5 ml

Tabelle 1. Mittlere Bestandteile für das Wachstum von O. Tauri 11, 12. Make up mit einem Gesamtvolumen von 1 Liter künstlichem Meerwasser zu einem Salzgehalt von 30 ppt, und fügen Sie die oben genannten Komponenten aus Stammlösungen wie angegeben. Filter-Sterilisation des Mediums und den Einsatz innerhalb einer Woche. Die Bestände an allen Verbindungen mit Ausnahme des Vitamin-Lösung können gebündelt bis 6 ml dieser Lösung für jeden Liter Medium hinzuzufügen.

Endkonzentration Stammlösung Menge für 1 Liter
Na 2 2 O 1 × 10 -4 M 41,6 g
FeCl 3 • 6H 2 O 1 × 10 -5 M 3,15 g
Na 2 MoO 4 • 2H 2 O 1 x 10 -8 M 6,3 g / l dH 2 O 1 ml
ZnSO 4 • 7 H 2 O 1 x 10 -9 M 22,0 g / l dH 2 O 1 ml
CoCl 2 • 6 H 2 O 1 x 10 -9 M 10,0 g / l dH 2 O 1 ml
MnCl 2 • 4H 2 O 1 x 10 -8 M 180,0 g / l dH 2 O 1 ml
CuSO 4 • 5 H 2 O 1 x 10 -8 M 9,8 g / l dH 1 ml

Tabelle 2. Spurenmetallösung 11,12. Mit Wasser bis auf insgesamt 1 Liter, in dH 2 O, und Wärme zu lösen. Aliquotieren und einfrieren die Lösung für die Lagerung. Abschließende angegebenen Konzentrationen beziehen sich auf das Medium, nicht die Spur Metall-Lösung.

Endkonzentration Stammlösung Menge für 1 Liter
Vitamin B 12 1 × 10 -10 M 1 g / l dH 2 O 1 ml
Biotin 1 x 10 -9 M 0,1 g / l dH 2 O 10 ml
• Thiamin HCl 1 × 10 -7 M 200 mg

Tabelle 3. f / 2Vitamin-Lösung 11. Stellen bis zu einem Gesamtbetrag von 1 Liter in dH 2 O, Filter sterilisieren, aliquotieren und einfrieren. Abschließende angegebenen Konzentrationen beziehen sich auf das Medium, nicht die Vitamin-Lösung.

1
Abbildung 1. Grafische Übersicht der Transformation Prozedur. Schematische Darstellung des Verfahrens zu gentechnisch verändern Ostreococcus tauri durch Elektroporation.

2
Abbildung 2. Kultur Wachstum. Zellen sind subkultiviert aseptisch in einer Verdünnung von 1/100 in frischen ASW alle 7 Tage und aufgewachsen unter konstanten Licht in einem Inkubator mit Pflanzenwachstum Moonlight Blue Filter ausgestattet. Die Lichtintensität sollte in der Nähe 20 pmol m -2 s -1 und Temperatur wird bei 20 ° C gehalten Zellen benötigen kein ständiger Bewegung zu sein, aber sind shaken einmal alle 2 bis 3 Tage, um die Aggregation zu verhindern.

Abbildung 3
Abbildung 3. Colony Formation auf 0,2% LMP-Agarose. Transfer 4 Platten zu einem großen Platz Petrischale und Dichtung mit Parafilm (oben links). Wenn Kolonien gebildet haben, wählen Sie einfach kostenlos (im Idealfall konisch geformten) Kolonien (oben rechts) und saugen sie aus der Platte mit einer Pipette P200. Es sollten keine Kolonien auf der Negativ-Kontrolle (unten rechts) sein.

Discussion

Cellular Staat und Kultur axeny ist von entscheidender Bedeutung für die Transformation Prozedur. Obwohl die Zellen üblicherweise in Zyklen von 12 Stunden Licht gehalten werden, wurden 12 Stunden Dunkelheit, Transformationseffizienz in Zellen unter diesen Bedingungen angebaut wird unzureichend zu sein. Während der wiederholten Pelletierung / Resuspension Schritte sollten die Zellen immer leicht zu resuspendieren. Wenn Zellen aggregieren, oder ein Schleim-ähnliche Substanz vorhanden ist, ist es besser, das Verfahren wieder von vorne beginnen. In der Regel können ~ 50 Kolonien auf jeder Platte Transformation gerechnet werden, im Vergleich zu keiner auf der Negativ-Kontrolle Platte. Bei geringer Transformationseffizienz sollte Kulturbedingungen variiert werden, um sicherzustellen Zellen sind im optimalen Zustand sein. Variablen, die Transformationseffizienz beeinflussen, gehören Umgebungstemperatur im Labor (sollte in der Nähe 20 ° C sein) und Handling-Geschwindigkeit (Procedure aus Pelletierung Zellen [2.3] der Besserung [2.7] sollte ~ 1 Stunde dauern). Es ist auch wichtig, dass alle Lösungen einRe machte vor jeder Transformation frisch. Für die Aufnahme in Platten, ist die Konzentration der LMP-Agarose von entscheidender Bedeutung. Ostreococcus Zellen nicht in hohen Konzentrationen Agarose wachsen, und in geringen Konzentrationen zu diffundieren.

Drei Transformationsvektoren für Ostreococcus wurden bisher 6, veröffentlicht und Vektoren zu erzielenden und veröffentlicht kurz. Die vorhandenen Vektor Pot-Luc 6 ermöglicht die Verwendung eines Promotors der Wahl in Kombination mit einem C-terminalen Glühwürmchen-Luciferase-Tag eine schnellere Auswahl sowie transgene Linie handhabbar Expressionsmuster, während die Potox Vektor 6 trägt die starken induzierbaren Promotor aus der 13 entnommen Ostreococcus hoher Affinität Phosphat Transporter (HAPT)-Gen für die Überexpression des Gens von Interesse. Die Potox-Luc Vektor leitet sich von Potox, das Tragen einer zusätzlichen Marker, der Luciferase für indirekte Wahl der Überexpression Linien verwendet werden können Ostreococcus Zellen gegen viele Antibiotika, und die Konzentrationen von Verbindungen, die für Selektion von transgenen Ostreococcus Zellen höher ist als bei herkömmlichen Modellsystemen (2 mg / ml).

Obwohl das Verfahren als ineffizient, stellt die große Anzahl von Zellen und Plasmid-DNA für dieses Verfahren erforderlich keinen signifikanten Hindernis. Eine größere Einschränkung ist, dass jede Zeile erzeugt, die resistent gegen den Selektionsmarker ist es, individuell analysiert werden muss, um zu überprüfen, dass das gesamte Konstrukt in der DNA integriert wird. Wir haben Beispiele, in denen die erfolgreiche Expression des selektierbaren Markers nicht um das Einsetzen des tatsächlichen Gen von Interesse entsprach, beobachtet, dh teilweise Integrationen auftreten können. Offensichtlich zufällige Insertion in das Genom bedeutet auch, dass es keine Kontrolle der Insertionsstelle mit diesen Verfahren und Methoden, basierend auf homologe Rekombination werden derzeit entwickelt. Aber das hier beschriebene Verfahren ist, nach bestem Wissen, derzeit die einzige Methode, um dadurch genetisch veränderten Zellen Ostreococcus generieren.

Als Ostreococcus tauri hat erst vor kurzem als ein experimentelles Modell Organismus benutzt wurde, ist den meisten Methoden der Arbeit mit diesen Zellen wahrscheinlich entwickeln und durch die wachsende Forschungsgemeinschaft beteiligt verfeinert werden. Dieses Protokoll soll den Menschen helfen, initiieren Arbeit mit Ostreococcus, aber keineswegs behauptet, alles, was man über genomische Transformation dieser Mikroalge kennen zu beschreiben. Die Autoren vertrauen, dass die Leser in der Lage, dieses Protokoll, um ihre eigenen Bedürfnisse als kleine Unterschiede in Inkubatoren (Lichtverhältnisse oder Qualität) und andere Parameter anzupassen und existieren wird wahrscheinlich in jedem einzelnen Labor optimiert werden, um die gesunde Kulturen dazu benötigte erhalten Protokoll. Nach Bewältigung der hier beschriebenen Techniken,Vektoren können zur lumineszierenden, fluoreszierenden oder anderen markierte Fusionsproteine ​​Leitungen unter der Steuerung einer Reihe von Promotoren zu erzeugen. Dieses aufregende neue experimentelle Plattform wird nützlich sein, zu untersuchen, wie komplizierte biochemische Probleme in einem Eukaryonten mit reduzierter Komplexität, in denen pharmakologische Ansätze hoch 3 sind erleichtert, gelöst werden.

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

SynthSys ein Zentrum für Integrative Systems Biology von BBSRC und EPSRC Auszeichnung D019621 finanziert. EU FP6 Network of Excellence "Marine Genomics" Zuschuss an FYB hat die Entwicklung der genetischen Transformation Methoden finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Medium constituents
Instant Ocean Marine Salt from amazon.co.uk or rocketaquatics.co.uk
NaNO3 S5506-250G Sigma
NH4Cl A9434-500G Sigma
Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate G9422-100G Sigma
H2SeO3 84920-250G Sigma
Ultra pure tris 15504-020 Invitrogen
Na2EDTA∙2H2O BPE120-500G Fisher Scientific
FeCl3∙6H2O 157740 Sigma
Na2MoO4∙2H2O 31439-100G-R Sigma
ZnSO4∙7H2O Z0251 Sigma
CoCl2∙6H2O 31277 Sigma
MnCl2∙4H2O 203734-5G Sigma
CuSO4∙5H2O C8027 Sigma
Vitamin B12 (cyanocobalamin) V2876 Sigma
Biotin 47868 Sigma
Thiamine ∙ HCl T4625 Sigma
Ampicillin A9518-25G Sigma
Neomycin N6386 Sigma
Kanamycin K4000 Sigma
Consumables for culturing
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1810.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1813.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1812.502 Starstedt
TPP Bottle top filters, 1L, complete 99950T Helena Bioscience
TPP Bottle top filters, 500ml, 99500T Helena Bioscience
TPP Bottle top filters, 250ml, 99250T Helena Bioscience
TPP Bottle top filters, 150ml, 99150T Helena Bioscience
Salinity Meter for Marine Aquarium DSG-10 Daeyoon
Chemicals for transformation
D-Sorbitol S6021-1KG Sigma
Pluronic F-68 solution P5556-100ML Sigma
ClonNat 51000 Werner
Low melting point agarose 16520-050 Invitrogen
Consumables for transformation
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1810.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1813.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1812.502 Starstedt
Greiner centrifuge tubes 50ml 227261 GBO
Gene Pulser/MicroPulser Cuvettes, 0.2 cm gap, 50 165-2086 Bio-Rad
Petri dish round PS 3 VENTS H14.2 Φ55 391-0895 VWR International
Petri dish square with four vents polystyrene sterile by irradiation clear 120mm FB51788 Fisher Scientific
Moonlight Blue light filter 183 Lee Lighting

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References

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