Genomisk Transformasjon av Picoeukaryote

Biology
 

Summary

Denne artikkelen beskriver genetisk transformasjon av encellet marine alger

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

van Ooijen, G., Knox, K., Kis, K., Bouget, F. Y., Millar, A. J. Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri. J. Vis. Exp. (65), e4074, doi:10.3791/4074 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Vanlige problemer som hindrer rask fremgang i Plant Sciences inkluderer mobilnettet, vev og hele organismen kompleksitet, og særlig det høye genomisk redundans påvirker enkle genetikk i høyere planter. Romanen modell organisme Ostreococcus Tauri er den minste frittlevende eukaryote kjent for å date, og besitter en sterkt redusert genom størrelse og cellulær kompleksitet 1,2, manifestert ved tilstedeværelsen av bare én av de fleste organeller (mitokondrie, kloroplast, Golgi stabel) per celle, og et genom inneholder bare ~~~HEAD=NNS 8000 gener. Videre gir kombinasjonen av unicellularity og enkel kultur en plattform mottagelig for kjemisk biologi tilnærminger. Nylig har Ostreococcus blitt ansatt for å studere grunnleggende mekanismene bak circadian tidtaking 3-6. Resultater fra denne modellen organismen har påvirket ikke bare plante vitenskap, men også hos pattedyr biologi 7. Dette eksemplet viser hvordan rask eksperimentering i enEnkelt eukaryote fra den grønne linjen kan akselerere forskning i mer komplekse organismer ved å generere testbare hypoteser som bruker metoder teknisk gjennomførbare bare i denne bakgrunnen av redusert kompleksitet. Kjennskap til ett genom og muligheten til å endre gener er viktige verktøy i enhver modell arter. Genomisk 1, 8 Transcriptomic, og proteomikk 9 for denne arten er fritt tilgjengelig, mens de tidligere rapporterte metoder 6,10 til genetisk forandre Ostreococcus er kjent for å få laboratorier over hele verden.

I denne artikkelen, til de eksperimentelle metoder genetisk transformere denne romanen modell organisme med en overexpression konstruere ved hjelp av electroporation er beskrevet i detalj, samt metode for inkludering av transformerte celler i lav prosentandel agarose å tillate valg av transformerte linjer som stammer fra en enkelt forvandlet celle. Etter den vellykkede anvendelse av Ostreococcus til døgnrytmen forskning, kan økende interesse Ostreococcus forventes fra ulike forskningsområder innenfor og utenfor anlegget fag, deriblant bioteknologiske områder. Forskere fra et bredt spekter av biologiske og medisinske fag som arbeider på bevarte biokjemiske mekanismer kan vurdere å forfølge forskning i Ostreococcus, fri fra genomisk og organismebiologi kompleksiteten større modell arter.

Protocol

1. Utarbeidelse av algetoksiner Material

  1. Ostreococcus celler dyrkes i kunstige sjøvann (ASW). Sea salter (typisk ca 40 gram per liter) blir oppløst i avionisert vann til en salinitet på 30 ppt, målt med en saltholdighet meter. Berikelse medium 11,12, sporelement elementer og vitaminer er lagt inn som beskrevet i tabell 1-3. Mediene er da filter-steriliseres gjennom en 0,22 mikrometer filter.
  2. For vedlikehold, celler av Ostreococcus belastninger OTTH95 er sub-kulturperler aseptisk ved en fortynning på 1/100 i frisk ASW hver 7. dag og dyrket under konstant lys i en plantevekst inkubator utstyrt med Moonlight blå filter. Lysintensiteten bør være nær 20 mikromol m -2 s -1, og temperaturen holdes på 20 ° C. Celler ikke krever konstant agitasjon, men er rystet gang hver 2 til 3 dager for å unngå aggregering.
  3. For hver transformasjon, er 50 ml celler kreves ved en celle density på 20-30 x 10 6 -1 ml, som skal oppnås 5-7 dager etter sub-dyrking. Tilnærmet celle tetthet og axeny kan bestemmes ved hjelp av enten flowcytometri eller en haemocytometer på et minimum av x40 forstørrelse.

2. Electroporation

  1. Forbered DNA for transformasjon. For hver transformasjon, er 5 mikrogram av ren, lineære plasmid DNA som kreves ved en konsentrasjon på 1 mg / mL i sterilt avionisert vann. For å oppnå dette DNA, forfatterne anbefaler å bruke en Qiagen midi prep kit, men andre metoder kan fungere like godt. Fordøye sitt produkt med et enzym som kutter i ryggraden i vektor brukt, men ikke i transgene eller valg genet. Videre rense og konsentrere den resulterende lineære DNA av etanol nedbør, og resuspender produktet i riktig volum av høy kvalitet sterilt avionisert vann.
  2. Forbered Mikrosentrifugerør inneholder 5 mikrogram DNA for hver transformasjon. En control uten DNA er nødvendig for hver celle linje å bli forvandlet. Hold disse rørene på is, sammen med en 2 mm electroporation kyvette for hver transformasjon.
  3. Forbered 2,2 ml resuspensjon buffer per transformasjon. Løs Sorbitol til en 1 M løsning i DDH 2 O, legg 0,1% pluronic syre F68 og filter-sterilisere.
  4. Legg pluronic syre F68, til en endelig konsentrasjon på 0,1% til cellene, og pellet dem i 10 minutter ved 8000x g ved 10 ° C i 50 ml tube med konisk bunn. Umiddelbart resuspender cellene i 1 ml resuspensjon buffer ved pipettering opp og ned, og overføre til en microfuge tube. Spinn ned i 10 minutter ved 8000 xg ved 10 ° C, og jobbe raskt, gjenta dette vasketrinn igjen.
  5. Med et kutt tips, resuspender hver endelig pellet i 40 mL av resuspensjon buffer. Legg 40 mL av resuspendert cellene til alle rør av lineære DNA på is, bland forsiktig og overføre til electroporation kyvetten.
  6. Sett kyvetten i electroptale maskin. Endre innstillingene til 6 kV -1 cm, 600 Ω, og 25 μF. Electroporate cellene.
  7. Inkuber electoporated cellene i kyvettene ved romtemperatur i 10 minutter, og bruke denne tiden til å forberede vevskulturstudier kolbene. Merke dem og tilsett 30 ml av frisk ASW til hver. Ta 1 ml ut av hver kolbe og tilsett det til tilsvarende kyvetten. Inkuber i 2 minutter og fjern forsiktig ASW, nå inneholder Globule av celler og forsiktig og langsomt pipetter direkte inn i ASW i kulturen kolben.
  8. Celler vanligvis forblir i en Globule. Pass på å ikke riste eller forstyrre de aggregerte cellene i dette øyeblikk. La cellene å komme i inkubator i 1-2 timer, deretter resuspender ved å riste flaskene. På denne tiden, bør cellene resuspender fritt og ingen klumper skal være synlig. La kulturer å gjenopprette natten i kuvøse.

3. Inkludering av Celler på Plater i Semi-Solid Medium

    2 O i en flaske som inneholder en rørepinne. Hold smeltet ved 65-90 ° C i en større begerglass som inneholder vann på en oppvarming magnetrører. For hver transformasjon forberede 8 petriskåler (55 mm diameter) og 8 x 15 ml rør hver inneholder 9 ml av ASW pluss ønsket valg. Hvis du bruker Nourseothricin eller G418, bruk 2 mg / ml.
  1. Samle de transformerte cellene fra inkubatoren. Arbeid i et sterilt flowhood, tilsett 1 ml kokende LMP agarose til 9 ml i en av rørene. Lukk røret, og bland ved å snu. Deretter legger 0,5 ml fersk transformerte celler, raskt blande og helle inn på platen. Gjenta denne prosessen med de resterende 7 rørene og deretter gå videre til neste transformasjon kolben.
  2. La platene åpner i flyten hette for en time, for agarose å sette. Deretter lukker platene og overføre dem til store kvadratiske petriskåler, som vil holde 4 plater hver. Tett torget platene viddh Parafilm. Merk at platene ikke vil sette helt, og som et resultat, er det gel svært skjøre. Forsiktighet bør utvises for ikke å bryte den gelen ved håndtering av platene. Legg alle kvadratiske plater i kuvøse.

4. Valg av transformerte Colonies

  1. Kolonier bør vises etter 10 til 21 dager på transformasjon platene, men ikke på mock transformerte platene. Å plukke kolonier bruke en 200 mL pipette med cut-off tips. Bare velg frie kolonier og suge ut den grønne kolonien. Pass på å ikke inkludere noen celler fra nærliggende kolonier.
  2. Overfør cellene til 2 ml væske medium som inneholder valg, i en 24 brønner plate. Når du bruker Nourseothricin, bruker 1,75 mg / ml. Bland ved pipettering opp og ned. Velg 24-50 kolonier per transformasjon. Forsegle platene med Parafilm og overføring til inkubatoren.
  3. Etter en uke, overføre 100 mL av hver brønn til 2 ml frisk ASW med utvalget i en 24 brønner plate og vokse for en additional 7 dager. Gjenlevende cellelinjer kan brukes til videre studier. Stabil integrering i genomet og innsetting nummer bør analyseres ved hjelp av PCR og Southern Blot. Genomisk DNA kan fås til disse formålene med noen down-skalert standard metode for plante DNA-ekstraksjon.

5. Representative Resultater

Celler delt 1/100 nådde en tetthet på 25 millioner celler per milliliter etter å ha vokst i 7 dager. Electroporation av cellene med de riktige innstillingene resulterte i en tid-konstant mellom 10 og 14 millisekunder. Når cellene blir overført til medium i kultur flakonger, bør en Globule av celler danner. Når lett rystet etter en time, bør cellene lett resuspender. Inkludering av 1 ml forvandlet celler til 0,2% LMP agar bør resultere i en konsistent, men bare halvfast gel. Kolonier bør vises etter 10 til 21 dager. Når transformerer 5 mikrogram av lineære DNA ved hjelp av protokollen over, 50-100 kolonier pr transformasjonplate var typisk forventet versus ingen på den negative kontrollen platene. ~ 80% av kolonier plukket ble positivt valgt ut av antibiotikaresistens i flytende medium og ble brukt i senere studier.

Endelig konsentrasjon Lager løsning Volum for 1 liter
NANO 3 8,83 x 10 -4 M 75 g / L dH 2 O 1 mL
NH 4 Cl 3,63 x 10 -5 M 2,68 g / L dH 2 O 1 mL
β-glycerophosphate 1 x 10 -5 M 2,16 g / L dH 2 O 1 mL
H 2 SEO 3 1 x 10 -8 M 1,29 mg / L dH 2 O 1 mL
Tris-base (pH 7,2) 1 x 10 -3 M 121,1 g / L dH 2 O 1 mL
K sporelement løsning Tabell 2 1 mL
f / 2 vitamin løsning Tabell 3 0,5 mL

Tabell 1. Middels bestanddeler for vekst av O. 11 Tauri, 12. Fyll opp et totalt volum på 1 liter av kunstige sjøvann til en salinitet på 30 ppt, og legg komponentene ovenfor fra stamløsninger som angitt. Filter-sterilisere medium og bruk innen en uke. Beholdning av alle forbindelser unntatt vitamin løsningen kan samordnes for å legge til 6 ml av denne løsningen for hver liter medium.

Endelig konsentrasjon Lager løsning Beløp i 1 liter
Na 2 2 O 1 x 10 -4 M 41,6 g
FeCl 3 • 6H 2 O 1 x 10 -5 M 3,15 g
Na 2 Moo 4 • 2H 2 O 1 x 10 -8 M 6,3 g / L dH 2 O 1 mL
ZnSO 4 • 7H 2 O 1 x 10 -9 M 22,0 g / L dH 2 O 1 mL
CoCl 2 • 6H 2 O 1 x 10 -9 M 10,0 g / L dH 2 O 1 mL
MnCl 2 • 4H 2 O 1 x 10 -8 M 180,0 g / L dH 2 O 1 mL
CuSO 4 • 5H 2 O 1 x 10 -8 M 9,8 g / L dH 1 mL

Tabell 2. Sporelement løsning 11,12. Fyll opp til totalt en liter, i dH 2 O, og varme til å oppløse. Delmengde løsningen og fryse for lagring. Endelige konsentrasjoner angitt refererer til den endelige medium, ikke sporelement løsningen.

Endelig konsentrasjon Lager løsning Beløp i 1 liter
Vitamin B 12 1 x 10 -10 M 1 g / L dH 2 O 1 mL
Biotin 1 x 10 -9 M 0,1 g / L dH 2 O 10 ml
Tiamin • HCl 1 x 10 -7 M 200 mg

Tabell 3. f / 2vitamin løsning 11. Fyll opp til totalt en liter i dH 2 O, filter-sterilisere, alikvoter og fryse. Endelige konsentrasjoner angitt refererer til den endelige medium, ikke vitamin løsningen.

Figur 1
Figur 1. Grafisk oversikt over transformasjonen prosedyren. Skjematisk fremstilling av prosedyren for å genetisk forandre Ostreococcus Tauri av electroporation.

Figur 2
Figur 2. Kultur vekst. Cellene er sub-kulturperler aseptisk ved en fortynning på 1/100 i frisk ASW hver 7. dag og dyrket under konstant lys i en plantevekst inkubator utstyrt med Moonlight blå filter. Lysintensiteten bør være nær 20 mikromol m -2 s -1, og temperaturen holdes på 20 ° C Cells ikke krever konstant agitasjon, men er sHaken gang hver 2 til 3 dager for å unngå aggregering.

Figur 3
Figur 3. Colony formasjon på 0,2% LMP agarose. Transfer 4 plater til et stort torg petriskål, og tetning med Parafilm (øverst til venstre). Når kolonier har dannet, velger du bare gratis (ideelt Konisk formet) kolonier (øverst til høyre) og suge dem ut av platen med en P200 pipette. Det bør ikke være kolonier på den negative kontrollen (nederst til høyre).

Discussion

Cellular staten og kultur axeny er av avgjørende betydning for transformasjon prosedyren. Selv om cellene er vanligvis opprettholdt i sykluser på 12 timer lys, ble 12 timers mørke, transformasjon effektivitet i celler dyrket under disse forholdene viser seg å være utilstrekkelig. Under gjentatte pelletering / resuspensjon trinnene, skal cellene alltid resuspender lett. Hvis cellene samlet, eller en slim-lignende substans er til stede, er det bedre å starte prosedyren fra begynnelsen igjen. Vanligvis kan ~~~HEAD=NNS 50 kolonier kan forventes på hver transformasjon plate, kontra ingen på den negative kontrollen plate. Ved lav transformasjon effektivitet, bør dyrking forholdene endres for å sikre celler er i optimal tilstand. Variabler som påvirker transformasjon effektivitet inkluderer omgivelsestemperatur i laboratoriet (bør være nær 20 ° C) og håndtering hastighet (Procedure fra pelletering celler [2,3] til utvinning [2,7] skal ta ~ 1 time). Det er også viktig at alle løsninger enre laget fersk før hver transformasjon. For inkludering i plater, er konsentrasjonen av LMP agarose avgjørende. Ostreococcus cellene vil ikke vokse i høye konsentrasjoner agarose, og vil spre i lave konsentrasjoner.

Tre transformasjon vektorer for Ostreococcus har blitt publisert tidligere seks, og flere vektorer forventes å bli generert og publisert kort tid. Den eksisterende vektor Pot-Luc 6 tillater bruk av en promotor av valget i kombinasjon med en C-terminal ildflue luciferase tag tillate raskere transgen linjevalg pluss medgjørlig uttrykk mønstre, mens Potox vektoren 6 bærer sterke induserbar 13 promotor tatt fra Ostreococcus høy affinitet Fosfat Transporter (HAPT) genet for overuttrykte genet av interesse. Den Potox-Luc vektor kommer fra Potox, bærer en ekstra luciferase markør som kan brukes for indirekte valg av overuttrykk linjer Ostreococcus celler er svært motstandsdyktig mot mange antibiotika, og konsentrasjonene av forbindelser som er nødvendige for valg av transgene Ostreococcus celler er høyere enn for konvensjonelle modellen systemer (2 mg / ml).

Selv om prosessen synes ineffektive, utgjør det store antallet av celler og plasmid DNA som trengs for denne prosedyren ingen vesentlig hindring. En større begrensning er at hver generert linje som er resistent mot valgbar markør må analyseres individuelt for å sjekke at hele konstruksjonen er integrert i DNA. Vi har observert eksempler på at vellykket uttrykk for valgbar markør ikke svarer til innsetting av selve genet av interesse; dvs. delvise integrasjoner kan forekomme. Tydeligvis betyr tilfeldig innsetting i genomet også at det ikke er kontroll av innstikkstedet ved hjelp av denne metoden, og metoder bdessuten økt på homolog rekombinasjon er under utvikling. Men beskrev metoden her er, etter vår beste kunnskap, for tiden den eneste preget metode for å generere genmodifiserte Ostreococcus celler.

Som Ostreococcus Tauri har kun nylig blitt brukt som en eksperimentell modell organisme, er de fleste metoder som arbeider med disse cellene sannsynlig å utvikle seg og bli videreutviklet av den voksende forskningsmiljøet involvert. Denne protokollen er ment å hjelpe folk i gang arbeid med Ostreococcus, men på ingen måte påstår å beskrive alt som er å vite om genomisk transformasjon av denne microalga. Forfatterne har tillit til at leserne vil kunne tilpasse denne protokollen til sine egne behov som små forskjeller i kuvøser (lysnivåer eller kvalitet) og andre parametre vil eksistere og sannsynligvis må optimaliseres i hver enkelt laboratorium for å oppnå sunne kulturer trengs for denne protokoll. Etter å mestre teknikkene som beskrives her,vektorer kan være konstruert for å generere selvlysende, fluoriserende, eller andre merkede fusion linjer under kontroll av en rekke promotors. Denne spennende romanen eksperimentelle plattformen vil være nyttig å studere hvordan kompliserte biokjemiske problemer løses i en eukaryote av redusert kompleksitet, der farmakologiske tilnærminger er svært lettet tre.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

SynthSys et Senter for Integrative Systems Biology finansiert av BBSRC og EPSRC prisen D019621. EU FP6 Network of Excellence "Marine Genomics" tilskudd til FYB har finansiert utviklingen av genetiske transformasjon metoder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Medium constituents
Instant Ocean Marine Salt from amazon.co.uk or rocketaquatics.co.uk
NaNO3 S5506-250G Sigma
NH4Cl A9434-500G Sigma
Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate G9422-100G Sigma
H2SeO3 84920-250G Sigma
Ultra pure tris 15504-020 Invitrogen
Na2EDTA∙2H2O BPE120-500G Fisher Scientific
FeCl3∙6H2O 157740 Sigma
Na2MoO4∙2H2O 31439-100G-R Sigma
ZnSO4∙7H2O Z0251 Sigma
CoCl2∙6H2O 31277 Sigma
MnCl2∙4H2O 203734-5G Sigma
CuSO4∙5H2O C8027 Sigma
Vitamin B12 (cyanocobalamin) V2876 Sigma
Biotin 47868 Sigma
Thiamine ∙ HCl T4625 Sigma
Ampicillin A9518-25G Sigma
Neomycin N6386 Sigma
Kanamycin K4000 Sigma
Consumables for culturing
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1810.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1813.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1812.502 Starstedt
TPP Bottle top filters, 1L, complete 99950T Helena Bioscience
TPP Bottle top filters, 500ml, 99500T Helena Bioscience
TPP Bottle top filters, 250ml, 99250T Helena Bioscience
TPP Bottle top filters, 150ml, 99150T Helena Bioscience
Salinity Meter for Marine Aquarium DSG-10 Daeyoon
Chemicals for transformation
D-Sorbitol S6021-1KG Sigma
Pluronic F-68 solution P5556-100ML Sigma
ClonNat 51000 Werner
Low melting point agarose 16520-050 Invitrogen
Consumables for transformation
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1810.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1813.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1812.502 Starstedt
Greiner centrifuge tubes 50ml 227261 GBO
Gene Pulser/MicroPulser Cuvettes, 0.2 cm gap, 50 165-2086 Bio-Rad
Petri dish round PS 3 VENTS H14.2 Φ55 391-0895 VWR International
Petri dish square with four vents polystyrene sterile by irradiation clear 120mm FB51788 Fisher Scientific
Moonlight Blue light filter 183 Lee Lighting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Derelle, E. Genome analysis of the smallest free-living eukaryote Ostreococcus tauri unveils many unique features. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11647-11652 (2006).
  2. Henderson, G. P., Gan, L., Jensen, G. J. 3-D ultrastructure of O. tauri: electron cryotomography of an entire eukaryotic cell. PLoS One. 2, e749 (2007).
  3. O'Neill, J. S. Circadian rhythms persist without transcription in a eukaryote. Nature. 469, 554-558 (2011).
  4. van Ooijen, G., Dixon, L. E., Troein, C., Millar, A. J. Proteasome function is required for biological timing throughout the twenty-four hour cycle. Curr. Biol. 21, 869-875 (2011).
  5. Troein, C. Multiple light inputs to a simple clock circuit allow complex biological rhythms. Plant. J. 66, 375-385 (2011).
  6. Corellou, F. Clocks in the green lineage: comparative functional analysis of the circadian architecture of the picoeukaryote ostreococcus. Plant Cell. 21, 3436-3449 (2009).
  7. O'Neill, J. S., Reddy, A. B. Circadian clocks in human red blood cells. Nature. 469, 498-503 (2011).
  8. Monnier, A. Orchestrated transcription of biological processes in the marine picoeukaryote Ostreococcus exposed to light/dark cycles. B.M.C. Genomics. 11, 192 (2010).
  9. Le Bihan, T. Shotgun proteomic analysis of the unicellular alga Ostreococcus tauri. J. Proteomics. 74, 2060-2070 (2011).
  10. Expression of polypeptides from the nuclear genome of Ostreococcus sp. US application patent. Corellou, F., Bouget, F. -Y. 201001174050 (2010).
  11. Guillard, R. R. L., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Can. J. Microbiol. 8, 229-239 (1962).
  12. Keller, M. D., Selvin, R. C., Claus, W., Guillard, R. R. L. Media for the culture of oceanic ultraphytoplankton. J. Phycol. 23, 633-638 (1987).
  13. Djouani-Tari, elB. A phosphate-regulated promoter for fine-tuned and reversible overexpression in Ostreococcus: Application to circadian clock functional analysis. PLoS One. 6, e28471 (2011).
  14. Moulager, M. Integration of light signals by the retinoblastoma pathway in the control of S phase entry in the picophytoplanktonic cell Ostreococcus. PLoS. Genet. 6, e1000957 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics