Picoeukaryote genomik Dönüşüm

Biology
 

Summary

Bu makalede, tek hücreli deniz alg genetik dönüşümü anlatılmaktadır

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

van Ooijen, G., Knox, K., Kis, K., Bouget, F. Y., Millar, A. J. Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri. J. Vis. Exp. (65), e4074, doi:10.3791/4074 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bitki Bilimleri hızlı ilerleme engelleyen ortak sorunları hücresel, doku ve tüm organizmanın karmaşıklığı ve yüksek bitkiler basit genetik etkileyen genomik fazlalık özellikle yüksek düzeyde bulunmaktadır. Yeni model organizma Ostreococcus tauri bugüne kadar bilinen en küçük serbest yaşayan ökaryot ve başına en organellerin sadece biri (mitokondri, kloroplast, golgi yığını) varlığı ile kendini gösteren büyük oranda azaltılmış genom büyüklüğü ve hücresel karmaşıklık 1,2, sahip Hücre ve sadece ~ 8.000 gen içeren bir genomu. Dahası, unicellularity ve kolay bir kültür kombinasyonu kimyasal biyolojisi yaklaşımlara müsait bir platform sağlar. Son zamanlarda, Ostreococcus başarıyla sirkadiyen Timekeeping 3-6 altında yatan temel mekanizmaları incelemek için kullanılmıştır. Bu model organizma sonuçları memeli biyoloji 7 bitki bilimi sadece etkiledi, ama var. Bu örnek, nasıl hızlı bir deney vurgulamaktadıryeşil soydan basit ökaryot yalnızca sınırlı karmaşıklığı bu arka planda teknik olarak uygulanabilir yöntemlerle sınanabilir hipotezler üretme, daha kompleks organizmalarda araştırma hızlandırabilir. Bir genom ve genler değiştirmek olanağı Bilgi herhangi bir model türler için temel araçlardır. Genetik Ostreococcus dönüştürmek için daha önce bildirilen yöntemler 6,10 dünyada çok az laboratuar bilinmektedir ise Genomik 1, Transkriptomik 8, ve bu türler için Proteomik 9 bilgiler, özgürce kullanılabilir.

Bu makale, deney yöntemleri genetik elektroporasyon yoluyla yapı ayrıntılı olarak belirtildiği gibi dönüştürülmüştür hatları seçimi, bir kaynaklanan izin verecek şekilde düşük oranda agaroz in transforme hücreler dahil edilmesi metodu olan bir aşırı ekspresyonu ile Bu yeni model organizma dönüştürmeye tek hücre dönüştürdü. Ostreoco başarılı uygulama sonrasındasirkadiyen araştırma ccus, Ostreococcus artan bir ilgi biyoteknolojik alanlarda dahil olmak üzere bitki bilimleri, içinde ve dışında çeşitli araştırma alanları beklenebilir. Korunmuş biyokimyasal yollar üzerinde çalışmak biyoloji ve tıp bilimleri, geniş bir alanda araştırmacılar büyük bir model türlerinin genomik ve organizma karmaşıklığı ücretsiz Ostreococcus içinde takip araştırma, düşünebilirsiniz.

Protocol

1. Alg Malzeme Hazırlanması

  1. Ostreococcus hücrelerin yapay deniz suyu (ABY) kültürlenmiştir. Deniz tuzları (litre başına tipik olarak yaklaşık 40 gram) 30 bir tuz için deiyonize su içinde çözülür, ppt gibi bir tuz sayacı kullanılarak ölçüldü. 1-3 Tablolarda tarif edildiği gibi Zenginleştirme orta 11,12, eser elementler metal ve vitaminler eklenir. Ortam 0.22 um bir filtreden daha sonra filtre ile sterilize edilmiş olup.
  2. Bakım için Ostreococcus gerginlik OTTH95 hücreleri taze ASW her 7 günde 1/100 dilusyondaki aseptik alt-kültür ve Ayışığı Mavi filtre takılmış bir bitki büyüme inkübatörde sabit ışık altında yetiştirilen. Işık yoğunluğu yaklaşık 20 mmol m -2 s -1 olmalıdır ve sıcaklık 20 ° C'de muhafaza edilir Hücreler sürekli ajitasyon gerekmez, ancak her 2 ila 3 gün agregasyonunu önlemek için bir kez çalkalanır.
  3. Her bir dönüşüm için, hücreler 50 ml de bir hücre gerekmektediralt-kültür takiben 5-7 gün elde edilmelidir 20-30 x 10 6 ml -1, bir nsity. Yaklaşık hücre yoğunluğu ve axeny x40 büyütme en az akış sitometrisi ya da bir ya haemocytometer kullanılarak belirlenebilir.

2. Elektroporasyon

  1. Dönüşümü için DNA hazırlamak. Her bir dönüşüm için, saf, linearised plazmid DNA 5 ug steril deiyonize su içinde 1 mg / ml arasında derişimde gereklidir. Diğer yöntemler işe eşit derecede iyi olabilir ama bu DNA elde etmek için, yazarlar, Qiagen midi hazırlık kiti kullanmanızı öneririz. Bir kullanılan vektörün omurgasında kesen bir enzimi, ancak transgen ya da seçim geni olan ürünün sindirilmesi. Daha da saflaştırmak ve etanol çökeltme ile sonuçta elde edilen DNA doğrusal konsantre ve yüksek kaliteli bir steril deiyonize su uygun hacimde yeniden süspanse ürünü.
  2. Her bir dönüşüm için 5 ug DNA içeren tüpler mikrosantrifüj hazırlayın. Bir controHer bir hücre dizisi transforme edilmesi için bir DNA ile l gereklidir. Her bir dönüşüm için bir küvet 2 mm elektroporasyon ile birlikte, buz üzerinde bu tüplerin tutmak.
  3. Dönüşüm başına tabanda tamponu 2.2 ml hazırlayın. GKD 2 O içinde 1 M çözüm Sorbitol eritilir,% 0.1 Pluronic asit F68 ve filtre-sterilize ekleyin.
  4. Konik alt ile bir 50 ml nihai bir tüp içinde hücreleri% 0.1 'lik konsantrasyonu, 10 ve at 8000X g'de 10 dakika boyunca granül bunların ° C ila Pluronic F68 asit, ekleyin. Hemen yukarı veya aşağı doğru pipet ile tarafından yeniden süspanse tampon 1 ml içinde tekrar süspansiyon hücreleri, ve bir mikrofüj tüpe transfer. 10 ° C'de 8000 xg'de 10 dakika aşağı doğru döndürün ve hızlı şekilde çalışma, bir kez daha bu yıkama adımı tekrarlayın.
  5. Bir kesim ucu ile yeniden süspanse tampon 40 ul her son pelletini. Buz üzerinde linearised DNA'nın her tüpüne süspanse hücreler 40 ul ekleyin, hafifçe karıştırın ve elektroporasyon küvetine transfer.
  6. Electrop de küvet koyunnutuk makinesi. 6 kV cm -1, 600 Ω ve 25 uF için ayarlarını değiştirin. Hücreleri Electroporate.
  7. 10 dakika için oda sıcaklığında küvet içinde electoporated hücreleri inkübe ve doku kültür şişeleri hazırlamak için olduğu zaman kullanılır. Onları etiketlemek ve her taze ASW 30 ml ekleyin. Her balona 1 ml çıkarın ve yavaşça ilgili küvet ekleyin. 2 dakika inkübe ve yavaşça ASW kaldırmak, şimdi yavaşça hücrelerin damlası içeren ve yavaş yavaş kültür şişelerinde ASW doğrudan Pipeti.
  8. Hücreler genellikle bir damlası kalır. Bu anda toplu hücreler sallamayın veya rahatsız dikkat edin. Hücreleri 1-2 saat inkübatörde kurtarmak için izin ver, sonra şişeleri sallayarak tekrar süspansiyon. Bu zamanda, hücre serbestçe tekrar süspansiyon olmalıdır ve hiçbir topaklar görülmelidir. Inkübatörde gecede kurtarmak için kültürleri bırakın.

3. Yarı-katı Ortamda Tabaklar Hücreler dahil edilmesi

    2 O% 2.1 düşük erime noktası agaroz çözeltisi otoklavlama. Bir ısıtma altmda manyetik bir karıştırıcı su içeren bir cam kapta daha 65-90 ° C sıcaklıkta erimiş tutmak. Her dönüşüm için 9 ASW ml artı gerekli seçimi içeren 8 Petri (55 mm çap) ve 8 x 15 ml tüpler her hazırlamak. Nourseothricin veya G418 kullanıyorsanız, 2 mg / ml kullanın.
  1. Kuluçka gelen dönüştürülmüş hücreler toplanır. Steril bir flowhood çalışan, tüplerin birinde 9 ml kaynar LMP agaroz 1 ml ilave edilir. Tüp kapatılır ve alt üst edilerek karıştırılır. Sonra, taze transforme hücreler 0.5 ml eklemek hızlı karıştırın ve plaka içine dökün. Kalan 7 tüpleri ile bu işlemi yineleyin ve ardından sonraki dönüşüm şişesi geçin.
  2. Agaroz ayarlamak için tabak, bir saat boyunca akış kaputu açık bırakın. Sonra tabak kapatın ve 4 plakaları her tutacak büyük kare Petri, aktarabilirsiniz. Kare plakalar zekâ Sealh parafilm. Plakalar tamamen ayarlanır unutmayın, ve sonuç olarak, jel çok hassastır. Bakım tabak tutarken jel kırmamaya dikkat edilmelidir. Inkübatör tüm kare tabak yerleştirin.

4. Dönüştürülmüş Kolonileri Seçimi

  1. Koloniler dönüşüm plakaları 10 ila 21 gün sonra, ancak davalarını dönüştürdü plakalar üzerinde görünmelidir. Koloniler kesme ipuçları ile 200 ul pipet kullanmak toparlamak için. Sadece ücretsiz koloniler seçin ve yeşil koloni berbat. Komşu kolonilerden herhangi bir hücre dahil etmemeye dikkat edin.
  2. Bir 24 kuyu plaka, seçimi ihtiva eden sıvı bir ortam, 2 ml kadar hücreleri transfer edin. Nourseothricin kullanıldığı zaman, 1.75 mg / ml kullanabilir. Aşağı pipetleme tarafından karıştırın. Dönüşüm başına 24-50 koloniler seçin. Parafilm ve inkübatör için transfer yüzeyleri.
  3. Bir hafta sonra, 24 kuyu plaka seçimi ile 2 ml taze ASW her iyi 100 ul aktarmak ve bir additiona için büyümekl 7 gün. Hayatta kalan hücre çizgileri başka çalışmalar için kullanılabilir. Genomu ve ekleme numarasına Kararlı entegrasyon PCR ve Southern Blot kullanılarak analiz edilmelidir. Genomik DNA bitki DNA ekstraksiyonu için herhangi bir yere ölçekli standart metot kullanılarak bu amaçlar için elde edilebilir.

5.. Temsilcisi Sonuçlar

Hücreler 1/100 7 gün boyunca gelişen sonra, mililitrede 25 milyon hücrelik bir yoğunlukta ulaşmıştır bölünür. Ayarları uygun olan hücrelerin elektroporasyon bir zaman sabiti 10 ila 14 milisaniye ile sonuçlanmıştır. Hücrelerinin kültür şişeleri içinde orta aktarıldığında, hücrelerin bir damlası oluşturması gerekir. Hafif bir saat sonra çalkalandı zaman, hücrelerin kolaylıkla tekrar süspansiyon gerekir. % 0.2 LMP agar içine 1 ml transforme hücreler dahil edilmesi tutarlı ama sadece yarı katı jel neden. Kolonileri 10 ile 21 gün sonra görünmelidir. dönüşüm başına yukarıda protokolünü kullanarak linearised DNA 5 mikrogram dönüştüren, 50-100 kolonilerplaka genellikle negatif kontrol plakalar üzerinde hiçbir karşılık, bekleniyordu. ~ Seçilmiş kolonilerin% 80 pozitif sıvı ortam içinde antibiyotik direnci ile seçilmiştir ve müteakip çalışmalarda kullanılan edildi.

Nihai konsantrasyon Stok çözelti 1 litre için Hacmi
NaNO 3 8.83 x 10 -4 M 75 g / L dH 2 O 1 mL
NH4CI 3.63 x 10 -5 M 2.68 g / L dH 2 O 1 mL
β-gliserofosfat 1 x 10 -5 M 2.16 g / L dH 2 O 1 mL
H 2 SeO 3 1 x 10 -8 M 1.29 mg / L dH 2 O 1 mL
Tris-bazlı (pH 7.2) 1 x 10 -3 M 121.1 g / L dH 2 O 1 mL
K eser metal çözüm Tablo 2 1 mL
f / 2 vitamini çözüm Tablo 3 0,5 mL

Tablo 1. O. büyüme için Orta bileşenlerin tauri 11, 12. 30 ppt tuzluluk bir yapay deniz suyu 1 litre toplam hacmi Makyaj ve belirtildiği gibi stok solüsyonlar yukarıda bileşenlerini ekleyin. Bir hafta içinde orta ve kullanım Filter-sterilize edin. Vitamin çözeltisi dışında bütün bileşiklerin stokları orta her bir litre için bu çözelti 6 ml eklemek için havuzlanmış edilebilir.

Nihai konsantrasyon Stok çözelti 1 litre için Tutarı
Na 2 2 O 1 x 10 -4 M 41.6 g
FeCl 3 • 6H 2 O 1 x 10 -5 M 3.15 g
Na 2 Moo 4 • 2H 2 O 1 x 10 -8 M 6.3 g / L dH 2 O 1 mL
ZnSO 4 • 7H 2 O 1 x 10 -9 M 22.0 g / L dH 2 O 1 mL
CoCl 2 • 6H 2 O 1 x 10 -9 M 10.0 g / L dH 2 O 1 mL
MnCl 2 • 4H 2 O 1 x 10 -8 M 180.0 g / L dH 2 O 1 mL
CuSO 4 • 5H 2 O 1 x 10 -8 M 9.8 g / L dH 1 mL

Tablo 2. Metal çözüm 11,12 çiziniz. Bir dH 2 O 1 litre toplam, ve çözülmekte ısı kadar olun. Depolama için tablet çözümü ve dondurma. Final konsantrasyonları son ortamı değil, eser metal çözümü için verilmiştir.

Nihai konsantrasyon Stok çözelti 1 litre için Tutarı
Vitamin B 12 1 x 10 -10 M 1 g / L dH 2 O 1 mL
Biotin 1 x 10 -9 M 0.1 g / L dH 2 O 10 mL
Tiamin • HCl 1 x 10 -7 M 200 mg

Tablo 3. f / 2Vitamin çözümü 11. dH 2 O, filtre sterilize, tablet ve dondurucuda 1 litre toplam Makyaj. Nihai konsantrasyonlar nihai orta değil, vitamin çözeltisi için verilmiştir.

Şekil 1
Şekil 1.. Dönüşüm işlemi grafiksel bakış. Genetik elektroporasyonla Ostreococcus tauri dönüştürme işlemi şematik gösterimi.

Şekil 2
Şekil 2. Kültür büyüme. Hücreler taze ASW 1/100 dilüsyon her 7 günde aseptik alt-kültür ve Ayışığı Mavi filtre takılmış bir bitki büyüme inkübatörde sabit ışık altında yetiştirilen. Işık yoğunluğu yaklaşık 20 mmol m -2 s -1 ° C Hücreler sürekli ajitasyon gerekmez 20 tutulur, ama s, gerekenagregasyonunu önlemek için her 2 ila 3 günde bir Haken.

Şekil 3
Şekil 3. % 0.2 LMP agaroz koloni oluşumu. Büyük bir kare Petri Transfer 4 plaka ve parafilm (sol üst) ile mühür. Koloniler oluşturdular zaman, sadece ücretsiz (ideal konik biçimli) koloniler (sağ üstte) seçin ve bir P200 pipetle plaka onları emmek. Negatif kontrol (sağ alt) üzerinde koloniler olmamalıdır.

Discussion

Hücresel devlet ve kültür axeny dönüşüm prosedürü için büyük önem taşır. Hücreleri, genellikle ışık 12 saat çevrimi içinde muhafaza edilmesine rağmen, 12 saat karanlık, bu şartlar altında yetiştirilen hücrelerinde dönüşümünün verim yetersiz olduğu bulunmuştur. Tekrarlanan peletleme / tabanda adımları sırasında hücreler her zaman kolaylıkla tekrar süspansiyon gerekir. Hücreleri agrega veya mukus benzeri bir madde varsa, tekrar baştan prosedürü başlatmak için daha iyidir. Tipik olarak, ~ 50 koloniler negatif kontrol plaka üzerinde hiç karşı, her dönüşüm plaka beklenebilir. Düşük dönüşümü verim durumda, kültürleme koşulları hücreleri optimum halindedir sağlamak üzere değiştirilebilir olmalıdır. Dönüşüm verimliliği etkileyen değişkenler ortam laboratuarında sıcaklıkta (yaklaşık 20 ° C olmalı) ve işleme hızı (hücre [2,3] kurtarma [2,7] peletleme gelen Prosedürü ~ 1 saat sürer) içerir. Aynı zamanda önemli olduğu bütün solüsyonlar,yeniden her dönüşüm öncesi taze yaptı. Plakalar dahil olmak için LMP agaroz konsantrasyonu Ostreococcus hücreleri yüksek agaroz konsantrasyonlarda büyümek olmaz. Çok önemlidir ve düşük konsantrasyonlarda karışacaktır.

Ostreococcus için üç dönüşüm vektörleri daha önce 6 yayınlanmış olan ve daha vektörler oluşturulan ve kısa zamanda yayınlanacaktır bekleniyor. Potox vektör 6 Ostreococcus alınan güçlü uyarılabilir 13 promotor taşıyan ise mevcut vektör Pot-Luc 6, hızlı transgenik hat seçimini artı uysal ekspresyonu sağlayan bir C-terminal ateşböceği lusiferaz etiketi ile birlikte bir seçim promotor kullanılmasına izin verir ilgi genin ekspresyonu için yüksek afinite Fosfat Taşıyıcı (HAPT) geni. Potox-Luc vektör aşırı hatları dolaylı seçimi için kullanılabilecek ek bir lusiferaz işareti taşıyan, Potox türemiştir Ostreococcus hücreleri antibiyotikler dayanımı ve transjenik Ostreococcus hücrelerin seçilmesi için gerekli olan bileşiklerin konsantrasyonları konvansiyonel sistemlerin modeli (2 mg / ml) daha yüksektir.

Süreci verimsiz görünür rağmen, hücreler ve bu işlem için gerekli plazmid DNA sayıda anlamlı bir engel teşkil etmektedir. Daha geniş bir sınırlama seçilebilir işaretleyici dayanıklı üretilen her satırı tüm yapı DNA entegre olduğunu kontrol etmek için ayrı ayrı analiz edilmesi gerekiyor. Biz seçilebilir marker başarılı ifadesi ilgi gerçek geninin ekleme uymadı hangi örnekler gözlemledim, yani kısmi entegrasyonlar oluşabilir. Açıkça, genom içine rastgele yerleştirilmesi de bu yöntemle ekleme sitenin hiçbir kontrolü olmadığı anlamına gelir, ve yöntemleri bhomolog rekombinasyon üzerine ased halen geliştirilmektedir. Ancak, yöntem, en iyi bilgi için, burada genetiği değiştirilmiş Ostreococcus hücreleri oluşturmak için şu anda sadece karakterize yöntemi açıklanmıştır.

Ostreococcus tauri ancak son zamanlarda bir deneysel model organizma olarak kullanılan olduğu gibi, bu hücrelerin çalışma yöntemleri çoğu gelişmeye ve ilgili artan araştırma topluluğu tarafından rafine edilmesi muhtemeldir. Bu protokol insanların Ostreococcus ile çalışma başlatmak yardımcı olmak için tasarlanmıştır, ama hiçbir şekilde bu mikroalgi genomik dönüşümü hakkında bilmek olduğunu tüm tanımlamak için iddia edilir. Okuyucuları, küçük kuluçka farklılıklar (ışık seviyesi ve kalitesi) ve diğer parametreler var olacaktır olarak kendi ihtiyaçlarına göre bu protokol uyum ve muhtemelen bunun için gerekli sağlıklı kültürleri elde etmek için her bireyin laboratuvarda optimize edilmiş olması mümkün olacak yazarlar güven protokolü. Mastering sonra teknikleri, burada açıklananvektörler promotörleri bir dizi kontrolü altında ışıldayan, floresan veya diğer tagged füzyon hatları oluşturmak için inşa edilebilir. Bu heyecan verici yeni deney platformu karmaşık biyokimyasal sorunlar farmakolojik yaklaşımlar oldukça kolaylaştırdı 3 edildiği azaltılmış karmaşıklığı, bir ökaryot çözülüyor, nasıl çalışmak faydalı olacaktır.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

BBSRC ve EPSRC ödül D019621 tarafından finanse Bütünleştirici Sistem Biyolojisi için Merkezi SynthSys. FYB için Mükemmellik "Deniz Genomics" hibe AB 6. ÇP Ağ genetik transformasyon yöntemlerinin geliştirilmesi finanse etmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Medium constituents
Instant Ocean Marine Salt from amazon.co.uk or rocketaquatics.co.uk
NaNO3 S5506-250G Sigma
NH4Cl A9434-500G Sigma
Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate G9422-100G Sigma
H2SeO3 84920-250G Sigma
Ultra pure tris 15504-020 Invitrogen
Na2EDTA∙2H2O BPE120-500G Fisher Scientific
FeCl3∙6H2O 157740 Sigma
Na2MoO4∙2H2O 31439-100G-R Sigma
ZnSO4∙7H2O Z0251 Sigma
CoCl2∙6H2O 31277 Sigma
MnCl2∙4H2O 203734-5G Sigma
CuSO4∙5H2O C8027 Sigma
Vitamin B12 (cyanocobalamin) V2876 Sigma
Biotin 47868 Sigma
Thiamine ∙ HCl T4625 Sigma
Ampicillin A9518-25G Sigma
Neomycin N6386 Sigma
Kanamycin K4000 Sigma
Consumables for culturing
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1810.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1813.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1812.502 Starstedt
TPP Bottle top filters, 1L, complete 99950T Helena Bioscience
TPP Bottle top filters, 500ml, 99500T Helena Bioscience
TPP Bottle top filters, 250ml, 99250T Helena Bioscience
TPP Bottle top filters, 150ml, 99150T Helena Bioscience
Salinity Meter for Marine Aquarium DSG-10 Daeyoon
Chemicals for transformation
D-Sorbitol S6021-1KG Sigma
Pluronic F-68 solution P5556-100ML Sigma
ClonNat 51000 Werner
Low melting point agarose 16520-050 Invitrogen
Consumables for transformation
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1810.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1813.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1812.502 Starstedt
Greiner centrifuge tubes 50ml 227261 GBO
Gene Pulser/MicroPulser Cuvettes, 0.2 cm gap, 50 165-2086 Bio-Rad
Petri dish round PS 3 VENTS H14.2 Φ55 391-0895 VWR International
Petri dish square with four vents polystyrene sterile by irradiation clear 120mm FB51788 Fisher Scientific
Moonlight Blue light filter 183 Lee Lighting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Derelle, E. Genome analysis of the smallest free-living eukaryote Ostreococcus tauri unveils many unique features. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11647-11652 (2006).
  2. Henderson, G. P., Gan, L., Jensen, G. J. 3-D ultrastructure of O. tauri: electron cryotomography of an entire eukaryotic cell. PLoS One. 2, e749 (2007).
  3. O'Neill, J. S. Circadian rhythms persist without transcription in a eukaryote. Nature. 469, 554-558 (2011).
  4. van Ooijen, G., Dixon, L. E., Troein, C., Millar, A. J. Proteasome function is required for biological timing throughout the twenty-four hour cycle. Curr. Biol. 21, 869-875 (2011).
  5. Troein, C. Multiple light inputs to a simple clock circuit allow complex biological rhythms. Plant. J. 66, 375-385 (2011).
  6. Corellou, F. Clocks in the green lineage: comparative functional analysis of the circadian architecture of the picoeukaryote ostreococcus. Plant Cell. 21, 3436-3449 (2009).
  7. O'Neill, J. S., Reddy, A. B. Circadian clocks in human red blood cells. Nature. 469, 498-503 (2011).
  8. Monnier, A. Orchestrated transcription of biological processes in the marine picoeukaryote Ostreococcus exposed to light/dark cycles. B.M.C. Genomics. 11, 192 (2010).
  9. Le Bihan, T. Shotgun proteomic analysis of the unicellular alga Ostreococcus tauri. J. Proteomics. 74, 2060-2070 (2011).
  10. Expression of polypeptides from the nuclear genome of Ostreococcus sp. US application patent. Corellou, F., Bouget, F. -Y. 201001174050 (2010).
  11. Guillard, R. R. L., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Can. J. Microbiol. 8, 229-239 (1962).
  12. Keller, M. D., Selvin, R. C., Claus, W., Guillard, R. R. L. Media for the culture of oceanic ultraphytoplankton. J. Phycol. 23, 633-638 (1987).
  13. Djouani-Tari, elB. A phosphate-regulated promoter for fine-tuned and reversible overexpression in Ostreococcus: Application to circadian clock functional analysis. PLoS One. 6, e28471 (2011).
  14. Moulager, M. Integration of light signals by the retinoblastoma pathway in the control of S phase entry in the picophytoplanktonic cell Ostreococcus. PLoS. Genet. 6, e1000957 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics