大人のラットの特定の脳領域の興奮毒性病変に対する定位手術

Neuroscience

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Summary

定位座標を使用して、興奮性毒を注入することにより、特定の脳領域の対象とアブレーション(s)は記載されています。この手法はまた、ラット脳内に他の化学物質の注入に適応することができます。

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Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat. J. Vis. Exp. (65), e4079, doi:10.3791/4079 (2012).

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Abstract

げっ歯類及びヒトを含む哺乳動物、の多くの行動の関数は、離散的な脳の領域によって主に媒介される。動作や他の実験成果のための様々な脳領域の肥えた関数の一般的な方法は、関数の局所アブレーションを実装することです。ヒトでは、ローカライズされた脳病変を有する患者集団は、多くの場合、損傷部位の基本的な機能を明らかにすることを期待して、赤字のために研究を行っている。げっ歯類で、一つは実験的に特定の脳領域の病変を誘発することができる。

病変は、いくつかの方法で達成することができます。電解病変は、局部的な損傷を引き起こす可能性がありますが、種々の細胞型と同様に病変部位の近くに起こる他の脳領域からの横断繊維を損傷します。細胞型特異的プロモーターを用いた遺伝学的手法は、サイト固有のターゲットを有効にすることができます誘導。これらの手法は、ターゲットの脳領域に応じて複雑で、常に実用的ではありません。 Excitot定位手術を用いた有酸素病変は対照的に、地元のグリア細胞に損傷を与えたり、繊維を通過することなく、興奮性ニューロンをlesioningの中で最も信頼性の高い実用的な方法の一つである。

ここでは、興奮性毒、基底扁桃体複合体にN-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA)、定位注入するためのプロトコルを提示します。解剖学的指標を用いて、我々はターゲットの脳領域の位置を決定し、ちょうどターゲット上記の場所に注射針を下げるために定位座標を適用します。その後、近くのニューロンの興奮毒性死、その結果、脳に我々の興奮性毒を注入する。選択した我々の実験対象はラットですが、同じ方法は、機器や座標の適切な調整を、他の哺乳動物に適用することができます。

このメソッドは、基底扁桃1-6、他の扁桃核6、7、海馬8、耳鼻咽喉科など、脳の領域の様々に使用することができますorhinal皮質9と前頭前皮質10。また、そのようなウイルスベクター1、11のような生物学的化合物を注入するために使用することができます。基本的な定位技術はまた、目的の化合物より長期の暴露を可能にする、より恒久的な浸透圧ポンプの注入に適応することができます。

Protocol

麻酔および鎮痛:30分麻酔の前には、鎮痛のために0.05 mg / kgを皮下ブプレノルフィンとラットを注入します。 30から40 mg / kgを腹腔内ペントバルビタールナトリウムで麻酔を開始します。この時点で、また(2 mg / kgを皮下投与)、さらに鎮痛薬として呼吸不全(0.4 mg / kg体重、皮下)とメロキシカムを防ぐためにアトロピンを注入します。 5分後、ラットはまだ携帯電話やつま先のピンチに応答する場合は、ラットが痛みに反応するまで、5 mg / kg体重(腹腔内)にペントバルビタールナトリウムのその後の用量を与える。最初の切開を行う前に、局所麻酔のための切開部位にリドカイン(5 mg / kgで、皮内)注射する。最初の注射後6〜8時間、鎮痛のために0.05 mg / kgを皮下ブプレノルフィンとラットを注入します。必要に応じて、これは通常は必要ありませんがブプレノルフィンは、6〜8時間ごと、その後注入することができます。

麻酔cのその他のフォームを注意することが重要です。興奮毒性病変の妨げになります。ケタミンは、げっ歯類の麻酔の一般的に使用される形式ですが、それはNMDA受容体拮抗薬であるため、たとえば、それは、NMDAで誘発される病変を妨げる可能性があります。病変のサイズを減らすことはありません誘導麻酔の方法を選択することが重要です。ガス麻酔が必要な場合は、ここで説明されたものを含め、ほとんどの定位装置は、ガスマスクアダプタを収容することができます。

注:資料は以下の特定の試薬 ​​や機器の表で詳しく説明されています。

1。ポンプとStereotaxの準備

  1. 滅菌水で10μlのハミルトンシリンジを記入し、6シリンジポンプ、プログラマブルのキャディーにそれをマウントします。ポンプのクランプホルダーにシリンジのプランジャーの端を固定します。
  2. プレフィル針と1 mlのシリンジを用いて滅菌水でPE20チューブをガス滅菌。ケアされて、ハミルトンシリンジへのチューブの開放端をスライドさせチューブ内の気泡を避けるために、FUL。
  3. バレルスタイルの電極マニピュレータを用いた定位装置のアームへのチューブの30ga、フラットカット、1インチの注入針の端をクランプします。クランプと溝バレルの間に注入針を挿入します。チューブを平坦化し、流体の流れを制限することを避けるために、その中に金属針を含むチューブの部分上にクランプを固定します。
  4. > 5μL/ minにポンプ速度を調整し、ポンプの電源をオンにします。水のビーズは、注入針の先端に表示されます。漏れがないことを確認するチューブの長さとそのジョイントをチェックしてください。
  5. 滅菌綿棒でビーズに水を拭き取ると撤回するポンプを設定します。 2μlの気泡を取り消すことができます。バブルの上部には、チューブに表示されます。
  6. 滅菌0.1M PBSでNMDAの20 mg / mlの溶液中での注入針の先端を浸しと4-5μlを撤回することができる。気泡は、滅菌水およびNMDA溶液との間表示されるはず先端インチそれは、NMDAは強力な神経毒であり、注意が、この溶液の調製と処理に使用されるべきであることに注意する必要があります。手袋および目の保護はすべての回でお勧めします。

2。定位装置でラットをマウントします。

  1. 図1は、定位装置の基本部分を示しています。耳に目のラインからネズミの頭を剃った後に、ラットの体が培地に設定された加温パッド上に置いて、一口バーの上にラットの前歯をロードします。舌が下顎で、一口バーの下にハングアップする必要があります。可能であれば、温度フィードバック加熱パッドが好ましいであろう。直腸温度を監視することにも理想的でしょう。
  2. 親指と人​​差し指でラットの首を持って、右耳のバーを右に水平外耳道を移動します。それは固体の場所で休んでいるようなバーが感じるとすれば、はるかに頭の中にシンクしないように。安定した頭部の右側を押し、左耳をスライドさせラットの左横の外耳道にバ​​ーがあります。それは固体の場所で休んでているように感じるべきである。耳介は対称になりますと耳のバーに平らになるように表示されます。上耳介のフレアは、耳バーの不適切な配置を示しています。頭部は首の圧力に反応して揺れないようにしてください。
  3. 鼻のバーを下にネジ止めします。穏やかである。鼻の骨は繊細で、鼻のバーがタイトである必要はありません。ラットが進む前に、まだ麻酔であることを確認します。

3。手術のためのラットを準備する

  1. 滅菌綿棒を使用して、静かに乾燥させると破片からそれらを保護するために、ラットの目の各々に獣医眼科潤滑軟膏の少量を置きます。
  2. 同心円状に剃った領域のエッジに計画された切開部位から、2%クロルヘキシジン溶液を用いてラットの頭皮を拭く70%エタノールで三回続いた。より効果的な消毒が必要な場合はクロルヘキシジンスクラブを使用することもできます。10%ポビドンヨード液で拭いて終了します。準備された頭皮は無菌であり、唯一の滅菌材料で触れなければならない。
  3. さらにステップのドン滅菌手袋には、次の準備手術部位を扱いますので。
  4. 開窓術は、手術部位を公開するように滅菌ドレープを配置します。

4。外科ウィンドウの作成

  1. #10手術用メスの刃を使用して、頭皮の長手方向の中心線に沿って切開(長さ約2cm)を作る。切開は、目のラインより後方に開始する必要があります。非利き手の親指と人差し指で、切開の方向にテンション垂直で頭皮を保持します。
  2. 滅菌した綿のヒントを使用して手術部位の端に頭蓋骨の表面を覆う筋膜を引き出します。それが表示できるように頭蓋骨をクリアするためにいくつかの力がかかります。
  3. 手術のウィンドウを作成するために4つの湾曲した、滅菌hemostatsを使用しています。 EAのクランプ筋膜(NOT皮膚)その後CHの切開の前部と後部の側面の側面と、それによってオープン切開を引っ張って、完全に頭蓋骨を露出し、動物と一緒にクランプを置く。

5。スカルを平準化し、パイロットホールを作成する

  1. ブレグマ、 図2に示すように頭蓋骨の3つの主要なプレートは、会う前のポイントを見つけます。針の先端がちょうどブレグマで頭蓋骨に触れるように点滴の針を移動します。背腹軸の座標に注意してください。 図3は、Stoelting定位デバイス上の座標を読み取る方法を示しています。 (注)この時点で、手袋は、もはや無菌でありません。また、直接無菌手術部位に触れるべきではありません。注意:非無菌定位装置に触れた後、外科医は、もはや無菌ではないと手術部位や手術部位に触れる機器の部品に触れないようにしてください。
  2. depicteとしてラムダ、頭蓋骨の3つの主要なプレートが満たす事後ポイントを見つけます。図2のd。少し点滴の針を上げ、ラムダにまっすぐに移動します。それだけでラムダで頭蓋骨に触れるまで針を下ろします。背腹軸の座標を読み取ります。頭蓋骨レベルであれば、ブレグマの読み値の0.1 mm以内となります。それがさらにオフこれ以上であれば、(邪魔にならない)針を上に移動し、いずれかの頭の端が再測定して高すぎる、となるに応じて、一口バープラットフォームを上げたり下げ、鼻のバーを緩めます。
  3. ブレグマを介して注入針を移動し、前後と内側·外側の座標を記録します。針は、脳アトラス12に従って興味のある脳領域の座標に基づいて移動する必要がありますどこに計算します。 BLAの場合は、前後の座標から2.8ミリメートルを減算し、どちらを左または右をターゲットにするかどうかに応じて内側·外側の座標から/に5.1ミリメートルを追加または減算します。計算された位置に注入針を移動します。
  4. 旧姓を振るそれが配置された場所を追跡して、接続された無菌の歯科用ドリルビットとドレメルモト·ツールを使用して、その場所に直径の穴約2mmのドリルに注意しながら、邪魔にならないDLE。ドリルが頭蓋骨を突き破るときのように慎重にドリル、それはおそらく硬膜と下に脳組織に損傷を与え、プルダウンする傾向があります。それを拡大するための穴を元通れば。
  5. 滅菌綿棒で血を吸収します。

6。神経毒の注入

  1. の位置に針バックスイングします。それは脳の表面に触れるまで針を下ろします。背腹軸の座標を記録します。これは、硬膜のレベルです。興味のある脳の領域に到達するために適切な値を減算します。基底外側扁桃体については、6.7ミリメートルを減算します。
  2. 徐々に計算されたレベルに注入針を下ろします。その後も頭蓋骨の上に、それをバックアップ上げる。ないtに注意しながら、注入針の先端の詰まりを取るためにハミルトンシリンジのクリーニングワイヤーを使用して、非滅菌手袋を注入針に接触する線の端をイタイ。
  3. >5μl/分でポンプを実行し、点滴の針から出てくる液体のビーズを参照していることを確認してください。されていない場合は、ワイヤーで詰まりを取る、もう一度やり直してください。
  4. 徐々に希望の腹側/背側のレベルに点滴の針を下ろします。
  5. 0.1μL/ minの注入ポンプの速度を設定し、注入を開始します。 2分間注入する。
  6. 注入が開始された後、黒のマーカーでチューブ内の空気の泡の両端をマークします。両端が移動しない場合は、針が詰まっています。注入を停止し、ワイヤーで詰まりを取る、針を上げ、再び下げ針、高流量で流れを確認し、もう一度試してください。
  7. 注入が完了したら、ポンプを停止し、針の先端から離れて拡散するNMDAための5分待ちます。
  8. 針0.5ミリメートルを上げ、1分間再び注入する。ニードル先端から離れて拡散するNMDA 2.5分待ちます。この余分な注入彼LPSは、BLAのすべての注入で覆われていることを確認してください。これは他の脳領域が必要であるかどうかは、実験的に決定しなければなりません。
  9. 徐々に脳から針を抜き上げると邪魔に定位腕を振る。

7。切開を閉じる

  1. ドンは、新しい滅菌手袋切開を閉じます。
  2. 滅菌した綿のヒントを頭蓋骨上に余分な血を拭うと、筋膜からクランプを外します。
  3. ロンドンの鉗子を使用して、一緒に切開の両側を押してください。皮膚の内側のエッジが満たしている必要があり、皮膚の外側のエッジは、切開にカールすることを許可すべきではありません。切開閉じたキーを押しながら、しっかりと突起部を閉じるために、創傷クリップを適用します。切開の長さに沿って一緒に皮膚やステープルをプッシュし続けています。これは通常3-5創傷クリップを取ります。
  4. すべての創傷クリップを配置した後、それらが安全であることを確認し、再びステープルを挟まないように鉗子を使用しています。より安全なトン彼クリップ切開が治癒される前に、可能性は低く、ラットでは、それらを引き出します。
  5. 綿棒10パーセントポビドンヨード溶液によるステープル切開とモビリティ(誘導30から45分という閉鎖麻酔、総手術時間が経過した後、通常1〜2時間)が復元されるまで、ホームケージとモニタにラットを返します。この時点では、ラットコロニー室に返されることがあります。一週間後、イソフルラン麻酔下のステープルリムーバーツールを使用してステープルを削除します。
  6. 次のラットで使用する前に、すべての楽器の先端表面を殺菌するホットビーズ滅菌器を使用しています。楽器は、もはや15秒以上ビーズに浸漬されるべきか、彼らが扱うには余りにも熱くなることがあります。他の動物に使用する前に楽器が完全に冷却されるべきである。

8。回復

  1. それはラットが病変次の日に発作活性を示される可能性があります。このような食料消費やGROとして脳の領域に応じて、破損、その他の動作oming影響を受けることがあります。それは、動物は、彼らがリカバリ時に正常な状態であることを保証するために日常的に監視することが重要です。このような流動食、高カロリーの食品、または追加の鎮痛などの支持療法が必要なことがあります。麻酔による死亡率は5%未満、通常は以下のラットの低い割合で発生します。他の原因による死亡率(感染、出血)は非常にまれである。麻酔の回復後の苦痛の兆候は、将来の研究から除外するために発生しますが、極めて稀である可能性があります。それが期待されるべきであるとして、 図4は、手術後最初の数日間の間に体重減少を示しています。体重は1週間以内に回復する必要があります。

9。代表的な結果

一週間以上のNMDA注入後、病変はクレ紫色対比と明視野顕微鏡を用いて可視化することができます。脳は0.1M PBSとfrozの30%スクロース中で平衡化し、氷冷4%パラホルムアルデヒドで灌流されるべきEN。彼らはその後1:6〜1時12分のシリーズで、30〜60μmでスライスし、標準的なクレシルバイオレットで対比を受ける前に、ゼラチンコートスライドガラスへ取り付ける必要があります。病変は"ハゲスポット"または病変後に細胞死に起因する染色減少クレシルバイオレットの領域に対応する必要があります。 図5AおよびB BLAとCEAの代表的な病変を示しています。この画像は、高解像度スキャン(1200 dpi)のフラットベッドスキャナを使用して得られた。病変を可視化するためには、見当違いの病変が存在することができるようにターゲット領域を周囲の組織の多くによってセクションのシリーズを対比染色するのに役立ちます。

図1
図1。定位セットアップ。この図は、ラベルに関連する部分を持つラットの定位を示しています。

図2
図2。ラットSKUにブレグマとラムダでしょう。この図は、ブレグマとラムダの位置を示しています。すべての座標はブレグマを基準にして測定されています。ラムダは、頭蓋骨が水平になっていることを確認するために使用されます。

図3
図3。定位座標を読み込んでいます。この図面は、標準的な定位読みを示しています。小数点の左側の桁を取得するには、右側のマーカーを使用しています。ラベルの数字は、十の位(= 10、2 = 20すなわち、1)に対応しています。ラベルの数字の間にハッシュマークは、単一の単位(1-9)に対応しています。ゼロの行は、stereotaxが設定されているものを整数で示します。ここで、ゼロの行は読み取りが10と11の間であることを示す、10と11のマ​​ーカーの間にあります。小数点の右側にある番号を確認するには、左側にマーカーを使用しています。左のハッシュマークは1単位の差を表すそれぞれのラベルが付いていないハッシュで、0から10までの番号が付けられていますその隣のもの。右側にあるハッシュマークで最高のアップ左ライン上のハッシュマークのいずれかは、座標の読みの最初の小数点以下の桁数を示しています。ここで、番号右側のハッシュマーク(#)で最高の最大9行に左に対応するのハッシュマークは、小数点以下の桁数は9ですので。最後の読書は10.9 mmである。

図4
図4。手術後の体重の変化はこのグラフは、定位手術を受けたラット(n = 17)の平均(±SEM)の重量を示していますか(n = 6)の手術を持っていませんでした。 0日目は、手術の日です。手術後、ラットの体重は手術後2〜3日で減少し、一日5から6の周りに増加した。

図5
図5。興奮毒性病変の例)この画像は"ハゲと30μmの冠状スライス上クレシルバイオレットの対比を示しています。基底外側扁桃体のNMDA病変からスポット "。白い矢印は病変の概要を説明します。それはない病変を持っていない脳スライスの反対側と比較することができます。中心核扁桃体のB)同様の病変。

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Discussion

ここで紹介する定位方法は、NMDAの注入を介して、特定の脳領域の興奮毒性病変を可能にします。基本的な定位の方法は、サイト固有の方法で薬理学的および生物学的な種々の薬剤を注入するために適応させることができます。また、脳アトラス12の彼らの定位座標で定義されている脳の領域の様々なターゲットに適合させることができます。マウスなど他の種への適応は、より小さい動物のために構築された類似の装置で行うことができます。現在の手続きは3カ月古い成体ラット用に最適化されていますが、高齢者を介して少年から年齢のさまざまな目的で使用することができます。標準脳アトラスでは表現できないことがあり、若い動物を扱う場合には、色とりどりの染料を注入探索手術は経験的に適切な針の配置を決定することができます。

定位手術、ガイガーらを使用して、カニューレの長期的な注入を必要とする研究者13 pの適切な切開の閉鎖とアフターケアの指示の代替プロトコルを感じています。小さな脳の領域を標的とが望まれている場合は、しかし、それは現在のプロトコルは、定位装置のヘッドの配置とレベリングのためのより正確な方法を提供していることに留意すべきである。現在のプロトコルはまた、BLAとして横方向の構造をターゲットとした場合、しばしば必要な広い手術のウィンドウを可能にする方法をクランプ切開を提供しています。

手術後、体重減少は、動物を制御するために比較して正常と期待されています。 図4は、同じコホートからunmanipulatedコントロールに対し、手術を受けた成熟雄ラットの体重の変化を示しています。ラットは手術後最初の2-3日間は体重減少を示し、その後5-6日後に再度重量を得るために始めることが予想される。より長期の体重減少は感染症やその他の問題を示す可能性があります。

時折、ラットは、その傷クリップを削除します。切開hの場合癒さとして、これは問題を提示していません。切開が治癒したと開いていない場合は、創傷クリップが別のクリップ、またはイソフルラン麻酔下で行うことができますどちらも縫合、のどちらかを交換する必要があります。傷が環境に対して開かれていた場合は、次の5日間、飲料水中の抗生物質(80から96ミリグラムトリメトプリムサルファ/ kg /日、240ミリグラム/ 5 mlの水)を含むことも感染を防ぐことをお勧めかもしれません。

おそらく、このプロトコルの最も困難な側面は耳バーの配置です。即時の犠牲に続いて色素注入による実験的な手術は耳のバーの配置と選択した定位座標の両方の精度を確認することをお勧めします。対象とする脳の領域は、正中線にある場合、我々は、正中線に大きな血管が直接正中アプローチを防ぐことができ、脳の両側から斜めアプローチを使用することをお勧めします。

可能な限り同様に行われても、定位シュールgeryはまだ重い鎮痛剤や麻酔薬への曝露、組織の損傷と免疫応答を必要とする。これらすべての要因は、手術の時に特に密接な実験結果に影響を及ぼす可能性があります。手術の副作用は、実験手順を開始する前に、十分な回復時間(少なくとも1週間)を可能にすることで最小限に抑えることができます。標的遺伝子ノックアウトなどの代替アプローチは、マウスでは可能かもしれませんが、はるかに複雑な定位手術以外にすることができます。

要約すると、記載されている方法は、通過する繊維を傷つけることなく脳の領域の局所的病変を可能にします。それは、多数の目的のために適応し、高い信頼性と検証可能であることができます。

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Disclosures

利害の衝突が宣言されません。

Acknowledgments

この作品は、yaは博士号を取得する前のフェローシップ(EDK)、NARSAD若手研究者賞(DK)とNIMHブレインズ賞(R01MH087495)(DK)をCIRMサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N-Methyl-D-aspartic Acid 98% Fisher Scientific AC32919-0500
Dual Lab Standard Stereotaxic w/45 deg. Ear Bars Stoelting 51653 Alternative vendor: Kopf *note of caution: assure compatibility of stereotaxic accessories if purchasing from multiple vendors
10μl SYR SPECIAL (*/*/*) Hamilton 701SN
Dremel Moto-Tool Stoelting 58600 Alternative vendor: Kopf
Carbide burs, handpiece HP, size 2 Schein Dental 2284578
St–lting 6 Syringe Programmable Pump Stoelting 53140 Alternative vendor: Kopf
Stainless Steel 316 Hypodermic Regular Wall Tubing 30 Gauge .0123" OD x .00625" ID x .003" Wall (infusion needle) Small Parts HTXX-30R-06-05
Intramedic PE 20 tubing (infusion tubing) VWR 63019-025
Reflex Clips, 9mm, non-sterile Kent Scientific Corp. INS500346 Alternative vendor: Fine Science Tools
Reflex Clip Applier for 9mm clips Kent Scientific Corp. 12031-09 Alternative vendor: Fine Science Tools
Curved Hartman hemostat Fine Science Tools 13003-10
London forceps Fine Sceince Tools 11080-02
2% chlorhexidine solution Allivet 30159 Alternative vendor: PetSolutions
10% povidone iodine solution CVS SKU #739575
Hot bead sterilizer Harvard Apparatus 610183

Table 1. Table of specific reagents and equipment.

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References

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