Functional Assessment of Darmmotilität und Darmwand Entzündung in Nagetiere: Analysen in einem standardisierten Modell der intestinalen Manipulation

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Postoperativen Ileus (POI) ist eine Komplikation der Bauchchirurgie führt zu einer erhöhten Morbidität und einen längeren Krankenhausaufenthalt. Da prophylaktische oder therapeutische Strategien fehlen verstärkte Forschung notwendig ist. Deshalb haben wir eine standardisierte und machbar Mausmodell, um die Pathophysiologie von POI zu untersuchen und mögliche therapeutische Optionen zu studieren.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Vilz, T. O., Overhaus, M., Stoffels, B., Websky, M. v., Kalff, J. C., Wehner, S. Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation. J. Vis. Exp. (67), e4086, doi:10.3791/4086 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Entzündung des Magen-Darm-Trakt ist eine häufige Ursache für eine Vielzahl von Krankheiten des Menschen. Tierforschung Modelle sind kritisch untersucht die komplexen zellulären und molekularen der intestinalen Pathologie. Obwohl der Tunica mucosa ist oft das Organ von Interesse in vielen entzündlichen Erkrankungen, aktuelle Arbeiten gezeigt, dass die muscularis externa (ME) ist auch ein sehr immunkompetenten Organ, das ein dichtes Netz von Resident Immunozyten birgt. 1,2 Diese Arbeiten wurden im Rahmen des standardisierten durchgeführt Modell der intestinalen Manipulation (IM), die zur Entzündung des Darms Wand führt, hauptsächlich zum ME begrenzt. Klinisch Entzündung führt zu verlängerten intestinale Motilitätsstörungen, wie postoperativer Ileus (POI), die eine häufige und unvermeidbare Komplikation nach abdominale Chirurgie ist bekannt. 3 Die Entzündung wird durch Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren, wie IL-6 oder IL-4 1β oder hemmende Neurotransmitter dadurch wie nitric-Oxid (NO). 5 Anschließend extravasieren enorme Anzahl von Immunzellen in das ME, dominiert von neutrophilen Granulozyten (PMN) und Monozyten und schließlich halten POI. 2 tagelangen, führt dies Darmlähmung zu einem erhöhten Risiko einer Aspiration, bakterielle Translokation und infektiöse Komplikationen bis zur Sepsis und Multiorganversagen und verursacht eine hohe wirtschaftliche Belastung. 6

In diesem Manuskript demonstrieren wir die standardisierten Modell von IM-und in vivo Beurteilung der Magen-Darm-Transit (GIT) und Darmpassage. Weiterhin zeigen wir, ein Verfahren zur Trennung des ME von der Tunica mucosa durch immunologische Analyse, die von entscheidender Bedeutung, um zwischen den Entzündungsreaktionen in diesen beiden stark immunaktives Darmwand Abteile zu unterscheiden gefolgt. Alle Analysen sind leicht übertragbar auf andere Forschungs-Modelle, die gastrointestinale Funktion.

Protocol

Ein. Tiere

Männliche C57Bl6 / J-Mäusen mit einem mittleren Gewicht von 25 g wurden von Harlan Winkelmann (Borchen, Deutschland) erhalten. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Bundesgesetz über den Schutz von Tieren durchgeführt. Die Grundsätze der Labor animal care folgten. Die Tiere wurden auf einer 12-Stunden Licht / Dunkel-Zyklus gehalten und mit handelsüblichen Nagetierfutter und Leitungswasser ad libitum. Die Tiere sollten mindestens 7 Tage nach der Ankunft in Ihrem Tier Anlage vor Experimenten untergebracht werden. Beachten Sie, dass alle Experimente leicht an Ratten oder andere Arten angepasst werden und mit leichten Modifikationen in großen Tiermodellen.

2. Operative Verfahren

  1. Anästhesie induziert wird und mit Isofluran (Abbott, Wiesbaden, Deutschland) in Sauerstoff aufrechterhalten wird. Nach Beginn der Anästhesie statt Tiere in Rückenlage und fix Extremitäten mit Klebeband (Leukosilk, Beiersdorf, Hamburg, Deutschland). Nach der Rasur und chirurgischen Desinfektion der Bauchwand Bauchschnitt ein Medianwert ist auf einer Länge von 2 Zentimetern durchgeführt. Geben Sie die Bauchhöhle über einen Schnitt entlang der Linea alba. Legen Sie zwei sterile Retraktoren zu halten das Abdomen offen. Sorgfältig eventerate den Dünndarm nach links und legen Sie es auf einem nassen Wattebausch.
  2. Evakuierung der gesamten Dünndarms luminalen Inhalte mit zwei feuchten und sterilen Watteträger (MaiMed, Neunkirchen, Deutschland) durch gleichzeitiges Walzen der Applikator aus dem Pylorus zum Blinddarm. VORSICHT: Vermeiden Sie Blutungen des Dünndarms Wand oder Läsionen der Darm Schiffe. Setzen Sie den Darm wieder in der peritonealen Höhle ohne Verdrehen Ischämie oder mechanische Behinderung zu verhindern und schließen Sie den Bauchschnitt mit einem Zwei-Schicht kontinuierliche 5/0 Polyamid nicht resorbierbares Nahtmaterial (Ethicon, Norderstedt, Deutschland).

3. Postoperative Pflege

  1. Nach dem Eingriff platzieren das Tier unter einer Wärmelampe, observing, bis es aus der Narkose erholt. Legen Sie die Maus wieder in seinem Käfig und den Zugang zu Wasser und Nahrung. Aufgrund der Eigenschaft von Opioiden zur Peristaltik beeinflussen, führen wir perioperative Analgesie mit NSAIDs (z. B. Metamizol) in Trinkwasser.

4. Funktionelle Studien 24 Stunden nach IM

  1. Magen-Darm-Transit (GIT)
    1. Betäuben Mäusen leicht mit Isofluran in Sauerstoff 22,5 Stunden nach IM. Sorgfältig überstreckt den Kopf der Maus und ziehen Sie die Zunge mit einer stumpfen Pinzette. Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit mindestens 100 ul Fluorescein-markiertem Dextran (FITC-Dextran, 70.000 MW, Sigma Aldrich, Taufkirchen, Deutschland), verbinden Sie es mit einem arteriellen Katheter (Vygon, Ecouen, Frankreich) und sorgfältig den Katheter ein Magensonde in den Magen.
    2. Kurz injizieren 100 ul FITC-Dextran und ziehen Sie den Katheter. Lassen Sie das Tier wach und warten 90 min. Während dieser Zeit Mäuse haben Zugang zu Nahrung oder Wasser. </ Li>
    3. Bereiten fünfzehn 2 ml Spinnhülsen und kennzeichnen sie nacheinander.
    4. Einschläfern Mäusen 90 min nach der Magensonde und entfernen Sie den gesamten Magen-Darm-Trakt vom Magen bis zum Rektum. Setzen Sie den Darm auf einen Polystyrol-Pad und vermeiden Stretching. CAVE: Es ist wichtig, den Darm entfernen sanft zu vermeiden Verschiebung der Flüssigkeit FITC-Dextran in den nahe gelegenen Segment. Für den Beginn könnte es hilfreich, um Clips am Anfang und am Ende eines jeden Segments zu verwenden.
    5. Messen volle Länge des Dünndarms und in voller Länge des Dickdarms. Teilen Sie den Dünndarm in 10 gleich große Segmente durch Pinning es auf die Polystyrol-Pad mit Kanülen. Teilen Sie den Doppelpunkt in 3 Segmente. Sie haben 15 Segmente (Magen # 1), zehn gleich große kleine Darmabschnitte (# 2-11), Blinddarm (# 12) und drei 3 gleich große Kolon Segmente (# 13-15) vorbereitet.
    6. Transekt den Darm an den markierten Stellen, greifen sie mit einer Pinzette und spülen Sie diese einmal mit 1,0 ml KHB in die zuvor vorbereiteten KHB containing 2,0 ml Röhrchen und Vortex kräftig für 20 Sekunden. Der Magen und Blinddarm direkt und platziert geschnitten in die vorbereiteten Röhrchen. Füllen Sie diese Röhrchen mit 1,0 ml KHB, wodurch Spülen Spuren von luminalen Inhalte aus der Schere in die Rohre.
    7. Zentrifugieren der Sonden bei 12.000 xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur in einer Tischzentrifuge. Während der Zentrifugation vorzubereiten weitere 15 durchnummeriert 1,5 ml Röhrchen.
    8. Übertragen Sie die klaren Überstände in die neue 1,5 ml-Tube und dunkel lagern bei 4 ° C bis zur Analyse (nächster Schritt). Die Sonden können über mehrere Tage bei 4 ° C ohne wesentlichen Verlust von FITC-Signal gespeichert werden. Für eine längere Lagerung hinzuzufügen 0,09% Natrium-Azid oder Shop bei <-18 ° C.
    9. Je 100 ul Duolen der Überstände auf einem schwarzen 96-Well-Platte (Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland). Pipette zwei 100 ul Proben von KHB als leer.
    10. Lesen Sie die Platte in einem Fluoreszenz-Reader (Safire, Tecan, Crailsheim, Deutschland) und Quantifizierung der fluorescence bei 494 nm (Absorption) / 521 nm (Emission) Wellenlänge. Subtrahieren leere Werte von Proben.
    11. Berechnen den geometrischen Mittelpunkt (GC) von FITC-Dextran Verteilung, die eigentlich der Schwerpunkt für die Verteilung des Markers, die durch die folgende Formel: GC = Σ (% der gesamten Fluoreszenzsignal pro Segment Segmentnummer *) / 100

    Anmerkung: Durch Multiplizieren Prozentsatz der Fluoreszenz jedes Segment mit seiner Segmentnummer ein gewichteter Mittelwert der Verteilung der Marker innerhalb des Darms wird beurteilt. Dieser Punkt wird sowohl durch die Verteilung und Entfernung von Marker Paar beeinflusst, sondern übernimmt keine spezifische zugrundeliegenden Verteilung. 7 Der berechnete Wert GC oft in Kombination mit einem Graph, der die Verteilung von FITC-Dextran über den Gastrointestinaltrakt (1A) dargestellt.

  2. Colonic Transit
    1. Mäuse sollten schwach narkotisiert mit isoflurane 2% Sauerstoff. ACHTUNG: Stellen Sie sicher, dass das Tier weckt innerhalb von 40 sek.
    2. Sorgfältig prüfen Kolon Durchgängigkeit durch Einfügen einer Fistel-Sonde (Metallstange, 2 mm Durchmesser) durch den Anus in den Darm.
    3. Mit der Fistel-Sonde voranzutreiben eine 2 mm Glaskugel 3 cm in den Dickdarm und ziehen Sie die Sonde sofort. Platzieren Sie die Maus in einem durchsichtigen Käfig und Messen der Zeit nach der Fistel-Sonde wurde aus dem Darm gezogen. Halten Sie ein Auge auf die Maus und stoppen Sie die Zeit direkt nach der Glaskugel wurde ausgeschieden.

5. Histochemische Analyse von isolierten ME Proben

  1. Midjejunal Segmente aus dem Darm geschnitten und in kaltem KHB in einem Sylgard gefüllte Schale.
  2. Mesenterium in die Schale mit 0,2 mm Insekten Nadeln (Fine Science Tools, Heidelberg, Deutschland) merken.
  3. Schneiden Sie das Segment entlang der mesenterialen Grenze und strecken, um ~ 120% seiner Länge und Breite. Schließen Sie die Fixierung mit InsektenStifte auf gegenüberliegenden Seite der Mesenterium. Spülen Sie die Sylgard Gericht sorgfältig mit frischem eiskaltem KHB, wodurch Spülen aller luminalen Inhalte.
    ME können jetzt mechanisch von der Tunica mucosa ab dem Mesenterium getrennt. Während der Vorbereitung zu ersetzen frisch, gekühlt KHB mehrmals.
  4. Abgetrennten Tunica mucosa kann Schock in flüssigem Stickstoff zur weiteren Analyse eingefroren werden oder verworfen werden.
  5. Befestigen Sie den isolierten ME ganze Berg mit 100% Ethanol für 10 min bei Raumtemperatur.
    Waschen Sie die ganze Berg dreimal mit gekühltem KHB. Hinweis: andere Fixative (dh 4% Formaldehyd, Essigsäure, Aceton) können auch nach der Prüfung ihrer Vereinbarkeit mit dem anschließenden Analyse verwendet werden.
  6. Die ME ganzen Halterungen sind bereit für weitere histochemische oder immunhistochemische Färbung:
  1. Histochemistry: Myeloperoxidase (MPO)-Färbung
    Infiltrierten PMNs kann durch die folgende MPO Färbeprotokoll untersucht werden.
    1. Lösen Sie 10 mg Hanker Yates Reagenz (Polyscience Europa, Eppelheim, Deutschland) in 10 ml KHB und 100 ul von 3% H 2 O 2. Bereiten Sie die Lösung kurz vor Gebrauch frisch und nicht wiederverwenden.
    2. Inkubieren ganze Halterungen für 10 min bei Raumtemperatur.
    3. Spülen Proben ausgiebig mit kaltem KHB und Inkubation für 10 min.
    4. Montieren Proben in wässrigen Eindeckmedium (Aquatek, Merck, Darmstadt, Deutschland) Nach dem Trocknen für 2 Stunden zu analysieren Dias unter einem Lichtmikroskop.
    5. Count Anzahl von Zellen in 5 zufällig ausgewählte Felder und berechnen, wie MPO-positiven Zellen / mm 2.
  2. Immunhistochemische Färbung:
    Entsprechend dem histochemischen MPO-Färbung, kann immunhistochemische Färbungen der ganzen Halterungen durchgeführt werden. Prinzipiell kann Ihren etablierten Protokollen immunhistochemische Färbung von Zellkulturen oder Gewebeschnitten leicht zu einer whole mount Färbung angepasst werden. Die Optimierung des Verfahrens für spezifische antiKörper wird dringend empfohlen.
    1. Cut Proben in 5 x 5 mm Stücke und Färbungen bei 2,0 ml Rundkolben Zentrifugenröhrchen in ~ 150 ul - 200 ul Antikörper-Lösung.
    2. Fixierung und blockierende Prozedur (dh 3% BSA in PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur) kann in der "Sylgard Schale" durchgeführt werden.
    3. Waschschritten in PBS oder andere Puffer können in 12-Well-Platten durchgeführt.
    4. Übertragen Sie die. Proben vorsichtig mit einem scharfen Pinzette zwischen Färbung Rohre und Waschen der Platten.
    5. Nach dem abschließenden Waschvorgang Mount Proben in Anti-Fading-Eindeckmedium mit Deckgläsern und analysieren mit einem Fluoreszenzmikroskop.

6. Organ Culture of ME

  1. Der gesamte Dünndarm 24 Stunden nach IM reseziert und in kalten KHB enthaltend 200 U / ml Penicillin G und 100 ug / ml Streptomycin (KHB + P / S).
  2. Schneiden Sie den Darm in 3 cm Länge und Pin jedes Segment auf eine Sylgard mit glass Gericht.
  3. Entfernen Sie die Mesenterium mit feinen Scheren und schlüpfen im Darm auf einer Stricknadel.
  4. Gently einschneiden die mich mit einem scharfen Zangen und befreien Sie ihn von der Submukosa mit einem feuchten Watteträger. Die Tunica mucosa bleibt auf der Stricknadel und kann zur weiteren Untersuchung Snap eingefroren sein. Die ME wird in kaltem KHB gesammelten + P / S.
  5. Schneiden Sie die isolierten ME Streifen in kleine Stücke von 2 - 4 mm Länge und inkubieren sie in eiskaltes KHB + P / S für eine halbe Stunde und spülen die Probe mehrmals.
  6. Übertragen etwa 50-60 mg ME (ME mindestens die Hälfte eines Dünndarms) in einem sterilen 24-Well-Platte mit 500 ul Dulbecco s modifiziertem Eagle-Medium (DMEM).
  7. Bei 37 ° C und 5% CO 2 für weitere 24 Stunden.
  8. Überprüfen Sie die Zellkulturen für bakterielle oder Pilzbefall unter dem Mikroskop.
  9. Sammle Überstand, Spin-down für 5 min bei 1.000 rcf und Schnellfrostmedium in flüssigem Stickstoff. Inzwischen trockentupfen die muscle Gewebe auf einer sauberen Gewebes für 30 sec und Gewicht.
  10. Überstände können für die anschließende Analyse der freigesetzten Zytokine (IL-6) durch ELISA oder anderen Metaboliten (dh Nitrit) in dem Überstand werden durch folgende Anweisungen verwendet herstellt.
  11. Normalisieren gemessenen Konzentrationen pro Gewicht ME Gewebe.

7. Repräsentative Ergebnisse

  1. Funktionelle Studien
    Der wichtigste Parameter, um die Schwere des POI zu bewerten, ist die Prüfung des GIT in vivo. 1A zeigt eine typische Verteilung von FITC-Dextran entlang des Magen-Darm-Trakt in unbehandelten Kontrollen und intestinal manipulierten Mäusen 24 Stunden nach der Operation. "Sham betrieben" Tiere zeigten eine normale GIT mit einer berechneten geometrischen Mittelpunkt (GC) im Caecum, während IM führte zu einer signifikanten Verzögerung des GIT im proximalen Jejunum (1B)
    Kolonmotilität wurde separat auf durch Messung der Kugel-Ausscheidung Zeit o konzentriertfa 2 mm Glaskugel. Sham betrieben Mäuse zeigen eine Ausscheidung Zeit von 48 - 200 sec, während IM führte zu einer längeren Zeit zwischen Ausscheidung von 470 bis 775 sec (Abbildung 1C).
  2. Morphologische Studien
    Um die entzündliche beschreiben innerhalb der ME mehrere Phänotypen von Leukozyten verlängern könnte unter Verwendung Histochemie oder Immunhistochemie werden. In 2A + B eine geringe Anwesenheit von PMNs in "sham betrieben" Tieren beobachtet wurde (39 ± 7 Zellen / mm 2). IM des Dünndarms führte zu einem starken PMN-Infiltration (660 ± 86 Zellen / mm 2) im Vergleich mit Sham behandelten Tieren
  3. ME Organ Culture
    Viele Entzündungsmediatoren aus Zellen freigesetzt sind schwierig in Gewebelysaten detektieren. Organkulturen ermöglichen Detektion der freigesetzten Mediatoren im Kulturüberstand. Ein Vertreter Vermittler im POI NEIN ist, was als wichtige hemmende Neurotransmitter im Magen-Darm-Trakt. 5
    NO konnte nicht in ME Orgel Kultur erkannt werdentur Überstände der nicht operierten Kontrolltieren (5 ± 6 pM / 24 h / mg Gewebe). In Sham (Laparotomie) Mäusen basale NO-Spiegel von 53 ± 36 pM / 24 h / mg Gewebe wurden beobachtet. ME Kulturen intestinal manipuliert (geerntet 24 Stunden nach der Operation) Mäuse produzieren deutlich mehr NO (2254 ± 853 pM / 24 h / mg Gewebe) während 24 Stunden ME Organkultur (Abbildung 3).

Abbildung 1
Abbildung 1. Effekt von IM auf GIT (A + B) und Kolontransitzeit (C) wurde als das GIT Prozent der nicht absorbierbaren Fluorescein-markiertes Dextran in 15 Segmente gastrointestinalen-Magen (Sto), Dünndarm (SI 1-9 gemessenen ), Blinddarm (KEK) und Dickdarm (Co) -90 min nach der oralen Einnahme. Darmpassage wurde als die Zeit vom Herausziehen der Fistel-Sonde bis Ausscheidung eines 2 mm Glasperlen gemessen. (A) Gastrointestinal Verteilung von Fluoresceinisothiocyanat-dextran nach Sham-Operation oder IM. In scheinoperierten Tieren meisten der Markierer im Caecum oder dem proximalen Kolon verglichen mit proximalen Jejunum Lage im manipulierten Tieren. Gestrichelten Linien zeigen berechnete GC. (B) Die Berechnung der GC zeigte eine verlängerte gastrointestinale Transitzeit nach IM. (C) Colonic Laufzeit zeigten eine signifikante Verzögerung in IM Mäusen verglichen mit sham operierten Tieren. GC für die 15 Darmabschnitten sind als Mittelwert (n = 5) dargestellt. Colonic Laufzeiten angezeigt wurden meine mit allen einzelnen Werten (n = 6). *** = P <0,001, Student-t-Test.

Abbildung 2
Abbildung 2. Nachweis von MPO positiven Zellen innerhalb Dünndarms ME. (A) ME ganze Halterungen wurden mit Hanker Yates Reagenz zum Nachweis von MPO positiven PMN 24 Stunden nach Laparotomie (Sham) oder IM Verfahren angefärbt. (B) Quantifizierung der MPO positive Zelle innerhalb 5 zufällig ausgewählte Felder pro Maus. n = 6 animals pro Gruppe. *** = P <0,001, Student-t-Test.

Abbildung 3
Abbildung 3. NO-Produktion in Kulturüberständen von ME. Muscle Proben aus operierten Kontrollen, betrieben Schein und IM Mäuse wurden 24 Stunden nach der Operation entnommen und kultiviert für 24 Stunden. Unbehandelte Mäuse zeigten nur eine sehr geringe basale Produktion von NO. Nach Laparotomie NO Befreiung ohne Messung signifikante Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und Sham behandelten Tieren erhöht. 24 Stunden nach IM NO-Produktion ist drastisch im Vergleich zu unbehandelten oder Sham behandelten Tieren erhöht. n = 5 Tiere pro Gruppe. *** = P <0,001, 1 ANOVA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Eine vergleichende Studie zur Analyse unterschiedlicher IM (Dünndarm Eventration für 10 min gegenüber vorsichtig Inspektion des Dünndarms mit zwei Watteträger gegenüber IM mit der Evakuierung des Dünndarms Inhalte in den Blinddarm) zeigten eine Korrelation zwischen dem Ausmaß der chirurgischen Manipulation und POI. Im Vergleich mit den anderen Gruppen IM zeigte die höchste Menge an Leukozyten im ME (PNMS, Makrophagen und Mastzellen), die sich in langen und schweren POI. 8.

Bei der Festlegung des Modells der IM sind einheitliche Bedienung und Stärke des Darms Manipulation kritische Schritte. Durch Berühren des Mesenterium während dieses Vorgangs muss unbedingt vermieden werden, um Blutungen zu verhindern. Unzureichende Festigkeit während IM wird in einem Mangel an Dünndarms Distension führen. IM Technik und Kraft variiert zwischen verschiedenen Chirurgen führt zu einer signifikanten Veränderung der POI Auftreten. Das gleiche Betreiber sollte alle Tiere in einem Experiment zu manipulieren.

Analyse GIT und Darmpassage in vivo ist kritisch und muss sorgfältig durchgeführt werden. Jedes Tier sollte während des Verfahrens in abgedunkelten Käfigen und in einem stillen Raum untergebracht werden. Die Tiere sollten mindestens 7 Tage nach der Ankunft in der Tierhaltung zu adept für die Umwelt (Nahrung, Wasser, Zimmer, hell dunkel Zyklen, immunologischen Bedingungen) untergebracht werden. Die Messung der beiden, GIT und Darmpassage, ermöglicht ein auch zwischen Darmentzündungen und Lähmung in behandelten und nicht-behandelten Bereichen zu unterscheiden. 9 weitere anspruchsvolle Verfahren der in-vivo-Motilität Aufnahmen wach Nagetieren wurde von Königsrainer et al. 10 mit Dehnungsmessstreifen Wandler auf Magen, Jejunum und Colon platziert. Der große Vorteil dieser Methode ist, dass Motilitätsstörungen unabhängig und kontinuierlich können in verschiedenen Teilen des Magen-Darm-Trakt im gleichen Tier an aufeinanderfolgenden Tagen geprüft. Jedoch die Produktion von strain-Aufnehmer und die notwendige Operation zu implantieren sie sind aufwendig im Vergleich zur GIT.

In POI, wird die Verbreitung von Darmlähmung wie Magen-Darm-Bereich Wirkung bekannt. 11 Eine frühere Arbeit unserer Gruppe zeigt durch die Verwendung der vorliegenden Verfahren, dass Immunzellen aus intestinal manipuliert Dünndarm zum Dickdarm unmanipulierten verbreiten. 12

Der chirurgische Eingriff sollte in keinem Tod oder schwere Komplikation (wie Blutung oder Peritonitis) führen. Messung von GIT und PMN Infiltrate in ME ganzen Halterungen zeigt, dass IM eine sehr reproduzierbare und machbar Modell POI in Nagetieren induzieren.

Fixation und Myeloperoxidase Färbung muss unmittelbar nach Organentnahme durchgeführt werden. Eine längere Lagerung der Proben in wässrigen Puffer führt zu Elution von Myeloperoxidase aus dem Gewebe.

Messung von Stickoxid ist ein Beispiel meMittler Entlassung aus Organkulturen: Nach wie vor Darm-Manipulation dargestellt führte zu einer Hochregulation von iNOS in Makrophagen der ME führt zu einer übermäßigen Befreiung von NO-und Darm-Motilitätsstörungen 5 Durch die Messung der Konzentration von NO im Überstand von kultivierten ME eine Aussage über die. entzündlichen Ausmaß oder die Wirksamkeit von Therapeutika möglich. Mehrere andere Moleküle (Il-6, TNF-alpha etc) kann leicht in den Überständen des gezüchteten Gewebes werden durch klassische ELISA-oder Multiplex-Ansätze wie Luminex Multiplex Immunoassay 13 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) untersucht.

Zusammenfassend ist ein zuverlässiger und IM wertvolles Modell induzierenden Darmentzündung und anschließende Motilitätsstörungen. Der einfache mechanische Trennung von ME und Tunica mucosa ermöglicht es Forschern, zwischen der Wirkung in beiden Darmwand Fächer, die von großem Interesse ist, da der Darm ME wurde gezeigt, dass ein sehr immunologisch aktiven Gewebes zu unterscheiden. In vivo Analyse GIT und Kolontransitzeit hat als Goldstandard bei der Detektion und Quantifizierung von intestinalen Motilitätsstörungen entwickelt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der Deutschen Forschungsgemeinschaft (KA1270/3-1/2) und BONFOR (O-112,0040) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethilon 5/0 Ethicon 1666H
Cotton applicators MaiMed 71010
arterial catheter Vygon 115-798
96 well plate (black) Greiner Bio One 655096
glass ball (2 mm diameter) Worf available on request
Insect pins Fine Science Tools 26000-25
Hanker Yates Reagent Polyscience 560694
Aquatek Merck HC109850
DMEM Lonza BE12-604 F
FITC-dextran (MW 70000) Sigma Aldrich 46945-500MG-F

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wehner, S., Behrendt, F. F., Lyutenski, B. N., Lysson, M., Bauer, A. J., Hirner, A., Kalff, J. C. Inhibition of macrophage function prevents intestinal inflammation and postoperative ileus in rodents. Gut. 56, 176-185 (2007).
  2. Kalff, J. C., Schwarz, N. T., Walgenbach, K. J., Schraut, W. H., Bauer, A. J. Leukocytes of the intestinal muscularis: their phenotype and isolation. J. Leukoc. Biol. 63, 683-691 (1998).
  3. Kehlet, H. Postoperative ileus. Gut. 47, Suppl 4. iv85-iv86 (2000).
  4. Wehner, S., Schwarz, N. T., Hundsdoerfer, R., Hierholzer, C., Tweardy, D. J., Billiar, T. R., Bauer, A. J., Kalff, J. C. Induction of IL-6 within the rodent intestinal muscularis after intestinal surgical stress. Surgery. 137, 436-446 (2005).
  5. Kalff, J. C., Schraut, W. H., Billiar, T. R., Simmons, R. L., Bauer, A. J. Role of inducible nitric oxide synthase in postoperative intestinal smooth muscle dysfunction in rodents. Gastroenterology. 118, 316-327 (2000).
  6. Iyer, S., Saunders, W. B., Stemkowski, S. Economic burden of postoperative ileus associated with colectomy in the United States. J. Manag. Care Pharm. 15, 485-494 (2009).
  7. Miller, M. S., Galligan, J. J., Burks, T. F. Accurate measurement of intestinal transit in the rat. J. Pharmacol. Methods. 6, 211-217 (1981).
  8. Kalff, J. C., Schraut, W. H., Simmons, R. L., Bauer, A. J. Surgical manipulation of the gut elicits an intestinal muscularis inflammatory response resulting in postsurgical ileus. Ann. Surg. 228, 652-663 (1998).
  9. Wehner, S., Straesser, S., Vilz, T. O., Pantelis, D., Sielecki, T., de lC, V., Hirner, A., Kalff, J. C. Inhibition of p38 mitogen-activated protein kinase pathway as prophylaxis of postoperative ileus in mice. Gastroenterology. 136, 619-629 (2009).
  10. Konigsrainer, I., Turck, M. H., Eisner, F., Meile, T., Hoffmann, J., Kuper, M., Zieker, D., Glatzle, J. The Gut is not only the Target but a Source of Inflammatory Mediators Inhibiting Gastrointestinal Motility During Sepsis. Cell Physiol. Biochem. 28, 753-760 (2011).
  11. Schwarz, N. T., Kalff, J. C., Turler, A., Speidel, N., Grandis, J. R., Billiar, T. R., Bauer, A. J. Selective jejunal manipulation causes postoperative pan-enteric inflammation and dysmotility. Gastroenterology. 26, 159-169 (2004).
  12. Engel, D. R., Koscielny, A., Wehner, S., Maurer, J., Schiwon, M., Franken, L., Schumak, B., Limmer, A., Sparwasser, T., Hirner, A. T helper type 1 memory cells disseminate postoperative ileus over the entire intestinal tract. Nat. Med. (2010).
  13. Stoffels, B., Schmidt, J., Nakao, A., Nazir, A., Chanthaphavong, R. S., Bauer, A. J. Role of interleukin 10 in murine postoperative ileus. Gut. 58, 648-660 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics