PDZ-의존 CFTR의 Macromolecular 신호 단지의 체외 분석

Biology

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Summary

낭성 섬유증의 transmembrane의 전도성 조정기 (CFTR), 상피 염화물 채널, 각종 단백질과 상호 작용하고 중요한 세포 과정을 조절하는 것으로보고되었습니다; 그들 가운데 CFTR PDZ 모티프-매개 상호 작용이 잘 문서화되었습니다. 이 프로토콜은 우리가 복잡한 신호 PDZ-의존 CFTR의 macromolecular를 조립하기 위해 개발된 방법을 설명합니다

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Wu, Y., Wang, S., Li, C. In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes. J. Vis. Exp. (66), e4091, doi:10.3791/4091 (2012).

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Abstract

낭성 섬유증의 transmembrane의 전도성 조정기 (CFTR), 주로 상피 세포의 꼭대기의 세포막에있는 염화물 채널, 1-3 transepithelial 유체 항상성에 중요한 역할을 담당하고 있습니다. 낭성 섬유증 (CF) 4 분비 설사 5 : CFTR은 두 가지 주요 질병에 연루되었습니다. CF에서 CFTR 망할 CIA 채널의 합성 또는 기능적 활동이 줄어 듭니다. 이 질환은 미국에서 2500 Caucasians 년 6 약 1에 영향을 미칩니다. 과도한 CFTR 활동도 캠프의 용기 7의 cGMP 생산을 자극 독소 유발 분비 설사 (예 : 콜레라 독소와 열 안정 E. 대장균의 enterotoxin에 의한)의 경우에 연루되었습니다.

증거를 수집하는 것은 CFTR 및 전송기, 이온 채널, 수용체, kinases, phosphatases, 신호 등 다른 단백질의 증가, 간의 물리적 및 기능적 상호 작용의 존재를 제안ING 분자, 그리고 cytoskeletal 요소 및 CFTR와 바인딩 단백질 간의 이러한 상호 작용은 비판적으로 시험 관내 및 생체내 또한 8-19에서 CFTR-매개 transepithelial 이온 전달을 조절에 관여하는 표시되었습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 방법에 초점을 그 단백질 바인딩 모티브를 가지고 CFTR 카르 복실 말단 꼬리 사이의 상호 작용 연구 지원과 [모티프의 PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ)로 언급] 특정 바인딩 모듈을 포함하는 비계 단백질의 그룹 PDZ 도메인로 지칭. 지금까지 여러 가지 PDZ 비계 단백질 같은 NHERF1 등 다양한 동질성, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-연관된 리간드), Shank2으로 CFTR의 카르 복실 말단 꼬리에 바인딩하고, 20-27를 파악하는 것으로보고되었습니다. PDZ 비계 단백질에 의해 인식되는 CFTR 사이 PDZ의 모티브는 C 말단 (즉, 인간의 CFTR에있는 1477-DTRL-1480) 20에서 마지막 네 아미노산이다. 흥미롭게도,CFTR은 동질성에게 22 변화와 함께이라도 NHERFs 및 PDZK1 모두 하나 이상의 PDZ 도메인을 바인딩할 수 있습니다. CFTR 구속력와 관련해서이 multivalency는 PDZ 비계 단백질은 세포 16-18에서 선택 / 특정하고 효율적인 신호를위한 복합 신호 CFTR의 macromolecular 형성을 촉진있다는 것을 암시, 기능성 중요한 것으로 표시되었습니다.

여러 생화학 assays는 공부를하기 위해 개발되었습니다 CFTR - 참여 등 공동 immunoprecipitation, 풀다운 분석, 페어 많다는 구속력을 분석, colorimetric 한쌍이 많다는 구속력을 분석하고, macromolecular 복잡한 어셈블리 분석 16-19,28,29 같은 단백질 상호 작용, . 여기 단백질 단백질이나 CFTR 16-19,28,29 관련된 도메인 도메인 상호 작용을 연구하기위한 실험실에 의해 광범위하게 사용되는 체외에서 복잡한 PDZ 모티브 종속적인 CFTR 함유 macromolecular 조립의 세부 절차에 초점.

Protocol

1. 박테리아의 재조합 태그 퓨전 단백질의 표현과 정제

  1. CFTR, LPA 2, MRP2, MRP4, β 2 AR, 그리고 NHERFs (전체 길이 또는 PDZ1 또는 PDZ2 도메인을위한 C-꼬리 (C-말단에 PDZ 모티프를 포함하는 마지막 50-100 아미노산)의 정의 영역을 확대 ) PCR 방식에 의한.
  2. GST-융합 단백질에 대한 pGEX4T-1 벡터 (예 : GST-NHERFs, GST-MRP4 중부 표준시와 같은), MBP-융합 단백질에 대한 pMAL-C2 벡터 (예 : MBP-β 2 아칸소 주 중부 표준시, MBP-CFTR 중부 표준시 등에 PCR 제품을 복제 ), 그리고 그의-S-융합 단백질 (예 : 그의-S-CFTR 중부 표준시로서 그의-S-PDZK1)에 대한 pET30.
  3. 단백 분해 효소 - 결함 E.로 변환 대장균 변형 (BL21-DE3) 가능한 재조합 단백질 저하를 최소화합니다.
  4. 적절한 항생제 (예 암피실린 또는 kanamycin 등)가 포함된 Luria-Bertani 매체 (산도 7.0)에서 37 ° C에서 하룻밤 문화를 성장. 1시 10분에서 하룻밤 문화를 희석 37에서 다른 2 시인데위한 성장 ° C. 에0.5-1 M M은 30 ° C.에 다음 4 H 위해 IPTG로 duce 8000에서 원심 분리하여 펠렛은 전지 × g로 10 분 4시 ° C.
  5. (50 M M 트리스-HCL, 산도 8.0, 1m M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 M M PMSF, 그리고 10 %의 자당)가 라이 소 자임 (1 밀리그램 / ML), 0.2 % 트리톤 X-100, 및 프로 테아제를 포함하는 자당 버퍼에 전지를 Lyse 에페. 세포 펠렛 문화 1 패에서 발생하는 20 ML을 사용합니다.
  6. 4 ° C.에서 30 분 로터리 흔드는에 섞어서
  7. 4 ° C.에 30 분 동안 20,000 × g에서 던가 맑은 뜨는 수집합니다.
  8. 맑은 뜨는로 다음과 같은 수지 / 아가로 오스 구슬 (자당 버퍼의 50 % 슬러리) 1 ML 추가
    • GST 융합 단백질을위한 글루타티온 아가로 오스 비즈.
    • 그의-S 융합 단백질에 대한 탈론 구슬.
    • MBP 융합 단백질에 대한 아밀로오스 수지.
  9. 4 4 H를위한 믹스 ° 회전 흔드는에서 C #.
  10. 2 마일을위한 믹싱, 1X PBS (15 ML)에 resuspending하여 구슬을 씻는다N, 800 회전 × G를 2 분, 그리고 폐기 뜨는 위해. 여섯 번에 대해이 단계를 반복합니다.
  11. 각각의 용리 완충액 (구슬 1 ML 당 2 ML의 용출 버퍼)를 사용하여 구슬에서 단백질을 Elute.
    • GST 융합 단백질에 대한 용출 버퍼 : 25 M M 트리스-HCL (산도 8.0), 140 M M NaCl, 20 M M은 글루타티온 감소.
    • 그의 융합 단백질에 대한 용출 버퍼 : 20 M M 트리스-HCL (산도 8.0), 500 M M NaCl, 200 M M 이미다졸.
    • MBP 융합 단백질에 대한 용출 버퍼 : 20 M M 트리스-HCL (산도 8.0), 200 M M NaCl, 1 M M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 M M DTT, 10 M M 말토오스.
  12. 4에서 1X PBS의 2 패에 대한 eluted 단백질 Dialyze ° C (가능한 단백질 저하를 피하기 위해). PBS 네 번위한 매 4 H를 변경합니다. -80에서 작은 aliquots로 Centricon 필터 (10,000 MW의 컷오프, Millipore)와 저장소를 사용하여 단백질을 집중 ° C.
  13. Det브래드 포드 방법에 의한 단백질 농도 어민. SDS-PAGE가 표준으로 BSA를 사용하여 단백질 품질을 평가합니다. 단백질의 무결성이 만족되지 않으면 이러한 겔 여과 또는 이온 교환 등의 보조 정화 절차가 사용될 수 있습니다. (예, 우리는 더욱 GST-융합 단백질을 정화하기 위해 G-75 세파 로스 칼럼을 사용했습니다).

2. 세포 배양 및 세포 Lysate 준비

  1. 문화 아기 햄스터 신장 (BHK) 세포가 그 안정적으로 이상 - 특급 CFTR-wt 및 CFTR-his10 또는 BHK 세포 그 transiently 이상 - 특급 국기-LPA 2 wt 또는 국기-LPA 2 ΔSTL 및 Madin-다비 송곳니 신장 (MDCK 이글의 최소 필수 배지에서 안정적으로 오버 명시 MRP2 (MEM)가 5 % CO 2와 37 10% 소태아 혈청 및 페니실린 / 폴리스티렌 flasks의 스트렙토 마이신 ° C를 포함하는) 세포.
  2. 문화 인간의 배아 신장 293 (HEK293) 세포를 안정적으로 그 이상 - 특급 CFTR-wt과 Dulbecco에서 CFTR-his10'5 % CO 2와 37 ° C에서 10% 태아 소 혈청 및 페니실린 / 폴리스티렌 flasks의 스트렙토 마이신과 보완의 수정된 이글 배지 (DMEM).
  3. 사용; - (0.2 % 트리톤-X-100 1m M phenylmethylsulphonyl 플루오르, 1 μg / ML aprotinin, 1 μg / ML 류펩틴, 1 μg / ML의 pepstatin를 포함하는 프로 테아제 저해제의 혼합으로 보충 PBS)가 용해 완충액으로 세포를 Lyse 각각 60 mm 배양 접시, 각각 100 mm 배양 접시 1,000 μL 용해 완충액 500 μL 용해 완충액.
  4. 세포 ° C 및 4에서 15 분 동안 16,000에서 원심 분리하여 불용성 물질 × g를 제거 ° C. 4에서 20 분 동안 lysates 락앤롤 브래드 포드 분석에 의한 단백질 농도를 확인합니다.

3. CFTR 함유 Macromolecular 단지의 체외 어셈블리에서 (CFTR-PDZK1-MRP4)

  1. 용해 완충액 200 μL (PBS - 0.2 % 트리톤 X-100 + 프로 테아제 억제제)로, 20 μg 정화 GST-MRP4-C 터미널을 추가50 AA (CT50) 융합 단백질.
  2. 그의-S-PDZK1 융합 단백질을 정제의 다양한 양의 (0-40 μg)를 추가합니다.
  3. 22 1-2 용 ° C ~ H의 회전 믹서에 두 단백질을 섞는다.
  4. 단백질 혼합물에 20 μL 글루타티온 비즈 (50 % 슬러리)를 추가하고, 다른 한 H 위해 믹스로 진행합니다. 이 단계는 한쌍이 많다는 바인딩로 언급됩니다.
  5. 이 기간 동안 HEK293 세포 lysates을 준비 그 위의 2 단계에서 설명한대로 overexpress 국기-CFTR (wt)).
  6. 용해 완충액으로 두 번 복잡한 씻으십시오. 각 세차를위한 1 분 동안 800 × g에서 던가 조심스럽게 각 세척 후에 뜨는을 기음. 아래쪽에 비즈를 빨아하지주의하시기 바랍니다.
  7. 구슬로 위에 준비된 HEK293 세포 lysates을 추가하고 부드럽게 3 시에 (또는 야간)에 대해 4 ° C에 섞는다.
  8. 비즈에게 단계 3.6)에 설명된대로 용해 완충액으로 광범위하게 세 번 씻는다.
  9. 30 μL 샘플 버퍼 (5 ​​×)를 사용하여 단백질을 Elute : 0.6 M 트리스-HCL (산도 6.8), 50 % 글리세롤, 2퍼센트 SDS, 그리고 0.1 % 푸른 bromophenol; 함유 5% β-메르 캅 토 에탄올.
  10. 5000에 10-15 분, 그리고 스핀에 대한 ° C의 물 목욕 × g 30 s에 대한이 구슬을 침전하는 37에 품어.
  11. 4-15% 젤로 모든 eluate을로드합니다.
  12. 30-40 분 정도 SDS-PAGE를 실행합니다.
  13. 1.5 시간 동안 PVDF 막에 단백질 밴드를 전송합니다.
  14. 5% 아닌 지방 우유가 포함된 TBS-십대 초반의 멤브레인를 차단하십시오.
  15. 4에 일차 항체 (예 : 안티 CFTR IgG, R1104 등) 멤브레인 ° C, 하룻밤을 품어.
  16. 5 분, 여섯 번 TBS-십대 초반으로 막 씻으십시오.
  17. 24 ° C.에 45 분 동안 이차 항체 (예 : 염소 항 마우스 HRP-복합 2 차 항체 등) 멤브레인을 품어
  18. 5 분, 여섯 번 TBS-십대 초반으로 막 씻으십시오.
  19. ECL 통해 단백질 밴드를 시각화.
  20. 대표 데이터는 그림 1에 표시됩니다.
jove_title "> 4. 대표 결과

체외에서 조립되었다 CFTR 함유 macromolecular 신호 단지의 예제는 그림 1에 표시됩니다. macromolecular 복합은 MRP4 C-단자 50 아미노산 (MRP4-CT50), PDZK1, 그리고 장편 CFTR (그림 1, 아래) 사이에 형성되었다. 복잡한 형성은 중간 단백질, PDZK1 (그림 1, 하단) 18의 양의 증가와 함께 복용 - dependently 증가했다.

그림 1
그림 1. macromolecular 복합 분석의 회화 표현 (위). macromolecular 복합는 복용량에 의존 방식으로 (아래) 18 세 단백질 (GST-MRP4-CT50, 그의-S-PDZK1, 그리고 깃발 CFTRwt)와 체외에서 검출되었다.

2 AR (ref. 14) CFTR-NHERF2-LPA 2 (ref. 15) CFTR-PDZ 단백질-MRP 2 (ref. 17) CFTR-PDZK1-MRP4 (ref. 16)
동질 구슬 아밀로오스 수지 S-단백질 아가로 오스 아밀로오스 수지 글루타티온 아가로 오스
단백질-1을 정화 MBP-β 2 아칸소 주 중부 표준시 그의-S-CFTR 중부 표준시 MBP-CFTR 중부 표준시 GST-MRP4 중부 표준시
단백질-2 투석을 GST-NHERF1 GST-NHERF2 GST-PDZ 단백질 그의-S-PDZK1
(또는 세포 lysates) 단백질-3 투석을 CFTR-wt 또는 CFTR-his10 (BHK 또는 HEK 세포 lysates) 플래그-LPA 2 wt 또는 국기-LPA 2-ΔSTL (BHK 세포 lysates) MRP2 (MDCK 세포 lysates) 국기-CFTR-wt 또는 CFTR-his10 (또는 세포 lysates)을 정화
항독소 안티 CFTR IgG 안티 - 플래그 HRP 안티 MRP2 IgG 안티 - 플래그 HRP

체외에서 조립된 다양한 CFTR 함유 macromolecular 컴플렉스의 표 1. 요약.

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Discussion

이 프로토콜에서 우리는 이전에 보고된 16-19,29,30의 체외은 조립 및 정화 단백질 (혹은 단백질 조각) 및 / 또는 세포 lysates를 사용 macromolecular 신호 복잡한을 포함 CFTR의 검출을위한 방법을 보여주었다. 준비 과정에서 최상의 결과들에게 다음과 같은 중요한 사항을 달성하기 위해서는 특별한주의가 필요합니다 :

  • 그것은 용출 버퍼의 산도가 단계 1)에서 설명한 GST-융합 단백질을 정화시 감소 글루타티온를 삽입한 후 8.0로 조정하는 것이 중요합니다. 산도를 감소 글루타티온의 추가 이후에 3.0만큼 낮은 될 수 있습니다. 산도가 용출되기 전에 조정되지 않을 경우 용출의 효율성이 크게 줄어 듭니다.
  • 단백질이 구슬에서 eluted되면, 그들은 바로 dialyzed해야하며 그렇지 않으면 정화 단백질 용액 나올 수도 있습니다. 단백질 투석 바로 용출 과정 이후에 할 수없는 경우 단백질을 elute과 일 그들을 떠나지 말아요E 아가로 오스 / 구슬.
  • 그것은 강력하게 CFTR 집계는 일반적인 문제이기 때문에 서양은 모래 바닥에 대비 CFTR 함유 macromolecular 복잡한 샘플을 끓여야하지 권장합니다. 겔에로드하기 전에 대신 샘플은 10-15 분 동안 37 ° C로 가열한다.
  • 낮은 친화도 상호 작용과 단백질 복잡한 경우, immunoblot는 신호를 증가시키기 SuperSignal 웨스트 펨​​토 (또는 피코) 최대 감도 기판 (피어스)를 사용하는 시각이 될 수 있습니다.

여기서 보여준 기술은 화학적으로 CFTR 함유 차 단백질 복잡한을 정의하기위한 편리하고 재현성 분석을 제공합니다. 표 1에 명시된 바와 같이 체외 CFTR의 macromolecular 컴플렉스로를 조립하기위한 여러 가지 방법이 있습니다.

  • 설득력있는 결과를 얻기 위해, 하나는 두 가지, 즉 I)에서 복잡한 조립하려고합니다 CFTR - PDZ 비계 단백질 (들) - 세 번째 단백질, II) 세번째 단백질 - PDZ 비계 단백질 (들) - CFTR.
  • PDZ macromolecular 복잡한 형성 모티브 - 의존성을 증명하기 위해, CFTR-his10 (CFTR-his10는 C-말단 꼬리에서 10 그분의 잔류물을 포함하고,이 단백질은 내부 PDZ의 모티브를 가지고 NHERFs 29 바인딩할 수 없습니다), 그들과 단백질 뿐만 아니라 macromolecular 복잡한 분석에 병렬로 사용할 수있는 PDZ의 모티브가 변이된 또는 (등 등의 β 2 AR-L413A 등; LPA 2 - ΔSTL) 삭제되었습니다.
  • 대신에 또한 많은 다른 구성 요소를 포함하는 셀의 전체 lysates를 사용 중에 하나가 (예 : MRP4-PDZK1-CFTR의 조립에서와 같이) 단계 3.7에서 정화 단백질 (3 단백질 등)를 사용할 수 있습니다, 우리는 또한 정화를 사용 국기-CFTR, 심판 18).. 전체 조립 시스템에 포함된 불과 3 정제된 단백질이 있기 때문에 이것은 전적으로 트라이 단백질 복합 뛰어난 결과를 제공합니다.

그러나, CFTR의 macromolecular 복합 감지 체외에서 purifi를 사용하여overexpress CFTR 또는 상호 작용하는 단백질 macromolecular 신호 복잡한은 세포에 해당 endogenously 표현이 상호 작용하는 단백질에 존재하는지 여부를 나타내는하지 않는 에드 단백질 (혹은 단백질 조각) 또는 세포의 lysates. 이 문제를 해결하기 위해 공동 immunoprecipitation 같은기도 상피 세포와 같은 세포를 16 내생 CFTR의 단지를 평가하고 상피 세포에게 17,18를 약탈하려고 수행할 수 있습니다. 또한, 질량 분광법 분석 및 2 차원 겔 전기 영동 29 CFTR에 대한 알 수없는 바인딩 파트너를 식별하기 위해 수행할 수 있습니다. 그러나 이러한 기술을 설명하는이 프로토콜의 범위를 벗어납니다.

또한, 생체내에서 단백질 상호 작용의 subcellular 지방화는 또한 분자 상호 작용에 영향을 미칠 수 있습니다. 그들은 드되었습니다 불구하고 예를 들어, MRP4은 CFTR이 혀끝의 세포막에 주로 현지되는 반면, 혀끝의 및 basolateral 모두 세포막로 표현되도록 ​​표시되었습니다PDZ 비계 단백질 PDZK1 18을 통해 서로 물리적 및 기능적으로 상호 작용하도록 monstrated. 또한, 재조합 단백질의 overexpression는 현재 프로토콜에서 사용되는 것처럼 그들의 subcellular 지방화에 영향을 미칠 수 있으며 따라서 별도로 발생하지 않을 것이 상호 작용을 가능하게합니다. 데이터를 해석하고 결과를 바탕 때 이러한 가능성 또한 고려되어야한다.

현재 프로토콜 PDZ 종속적인 CFTR 함유 macromolecular의 단지를 구성하고 절차에 초점을 맞추고 있지만,이 프로토콜은 또한 비 CFTR 관련된 여러 단백질 단지 (PDZ 종속 또는 독립 중) 조립에 잠재적인 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 최근이 macromolecular 조립 분석을 사용하여, 우리는 케모카인 수용체 CXCR2 물리적으로 neutrophils의 NHERF1를 통해 자사의 하류 효과기 PLCβ이 중재와 단백질 콤플렉스를 형성하고이 CXCR2 macromolecular 복합이 기능이 있는지 증명복잡한 (외인성 CXCR2 펩타이드를 사용하는 경유) 크게 감쇠 호중구 기능에게 31 방해 등 관련성.

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Disclosures

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

Acknowledgments

우리의 작품은 미국 심장 협회 (대동 동남 제휴) 초급 - 보조금의 0765185B, 엘사 미 Pardee 재단 연구 기금, 그리고 웨인 주립 대학교 교내 시동 펀드, 심장 혈관 연구소 이시스 전략 어워드에서 교부금에 의해 지원되었습니다. 체외 CFTR의 macromolecular 복합 어셈블리에서이 방법은 원래 박사는 AP 통신 Naren (테네시 보건 과학 센터의 대학)에 의해 개척되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pGEX4T-1 vector GE Healthcare 28-9545-49 formerly Amersham Biosciences
pMAL-C2 vector New England BioLabs
pET30 vector EMD Chemicals 69077-3 formerly Novagen
Glutathione agarose beads BD Biosciences 554780
Amylose resin New England BioLabs E8021S
Talon beads Clontech 635501
reduced glutathione BD Biosciences 554782
imidazole Fisher BP305-50
maltose Fisher BP684-500
S-protein agarose EMD Chemicals 69704-3 formerly Novagen
Anti-Flag HRP Sigma A8592
Anti-CFTR IgG Custom-made R1104 mAb recognizing CFTR epitope at a.a. 722-734
Anti-MRP2 IgG Chemicon International MAB4148 Now a part of Millipore

Table 2. Specific reagents and equipment.

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References

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