Author Produced

Расширение эмбриональных и взрослых нервных стволовых клеток путем * These authors contributed equally

Neuroscience
 

Summary

Контроль за расширение соматических стволовых клеток является основным фактором, препятствующим их изучения и использования в терапии. Здесь мы опишем систему управления временно нейронных стволовых клеток расширения во время развития и зрелости, которые могут быть использованы для увеличения числа нейронов генерируются в мозге мыши.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection. J. Vis. Exp. (68), e4093, doi:10.3791/4093 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Предварительное замечание

Операция должна быть выполнена полностью подготовленных следователей по согласованию с местными органами власти для животных. Все меры предосторожности должны быть приняты, чтобы минимизировать боль и стресс причиненного животным, включая глубокий наркоз, администрация послеоперационного обезболивания, а для операции длительностью более 10 мин, применение глаз смазкой, чтобы предотвратить обезвоживание роговицы и слепоту. Наркозом мышей должен постоянно теплая при 37 ° С до полного выздоровления, и каждый хирургический инструмент и решения должны быть стерильными. Хотя использование биологических капот не является строго необходимым, оператор должен принять все разумные меры, чтобы свести к минимуму возможность заражения животного во время операции, надев халат, маску и перчатки. Кроме того, каждый шаг в области сбора и использования вирусов должны быть разрешены и должны быть выполнены в S2 районы в соответствии с нормативными правовыми актами местных органов власти.Наконец, тщательное обеззараживание всех инструментов и поверхностей, которые могли быть в контакте с вирусами должны быть выполнены в соответствии с утвержденными центр дезинфекции практики (на ВИЧ, вытирая с 70% Et-OH и / или автоклавирования).

Часть 1: Расширение эмбриональные НСК

1. Кроме электропорации внутриутробно

  1. После клонирования трансгенов (т.е. cdk4/cyclinD1) в ПКМ-EGFP (Clontech) или pDSV-mRFPnls векторов 16, очистить плазмид использованием EndoFree комплект и ресуспендируют в стерильном PBS до концентрации 3-5 мкг / мкл. Вскоре перед операцией, смешать плазмид с 0,05% FastGreen в PBS в конечной отношение ок. 4:04:01 и центрифугируют смесь в течение 2 мин при 16000 мкг, чтобы удалить все осадки.
  2. Загрузите ДНК смесь в ранее вытащил из боросиликатного стеклянный капилляр. Тяговая параметров с помощью P-97 пипетки съемника являются: тяга: 200; Vel: 140; время: 140. Тепло дает рампы теста и зависит от спецификацииБР много капилляров используется. Установите капиллярную на сопло PicoPump, что находится недалеко от внутриутробного электропорации платформу (рис. 1а), а при стереомикроскопа, согнуть ее кончик и ник он в точке перегиба.
  3. Стерилизовать всех хирургии инструменты в сухом стерилизаторе стеклянная бусина и глубоко обезболить беременных мышей на 12-15 день беременности использовании изофлурана испарителя. Поместите животных в положении лежа на спине на отопление установлен на уровне платформы 37 ° C и держать под постоянным изофлуран администрации через носовой конус.
  4. Бритье кожи живота, дезинфекции Betaisodona несколько раз, в конце концов вытирая между ними с 70% этанола, и придать бупренорфин (разводят в PBS) подкожно в дозе 0,1 мг / кг концентрация в качестве преимущественного анальгетик. Использование тонких ножниц, сделать 2 см продольный разрез кожи и, соответственно, базового мышечной стенки для доступа в брюшную полость. Внесите в брюшной полости около. 2ИЭГ мл раствора (D-PBS, содержащий 100 ЕД / мл пера / стрептококковая), предварительно нагретой при 37 ° C и поддерживать решения на нагревательный блок.
  5. Крышка мыши стерильной Drap содержащих трещины, из которых матки будет удалена. Уберите разрез использованием вольфрамового втягивающим, определить матки и вытащить его держа его пинцетом между соседними эмбрионов (рис. 1б; слева) и, наконец, отдать ее на стерильную Drap. Во время всей операции, промыть матки с IUE решение для увлажнения органов и полости тела и предотвращает обезвоживание животных.
  6. Ручка матки тщательно держа ее между большим и указательным и превратить одного эмбриона до его голова видна и ориентирован на оператора. Определение конечного мозга полушарий и ввести одну из них из спинно-боковой стороны. Выпуск 1-2 мкл раствора ДНК помощью педали из PicoPump пока желудочка очерчена FastGreen (рис. 1б; справа).
  7. (рис. 1С) и доставить 6 импульсов 30 В в течение 50 мс с 950 мс интервал между импульсами использованием электропоратора генерации квадратный электрических полях работают с помощью педали. Избегайте размещения электродов близка к плаценте, так как это может вызвать кровотечение и повреждение эмбриона.
  8. Когда все эмбрионы вводят и электропорации, поместить в матку обратно в брюшную полость и закрыть мышечной стенки с шовный строку ушивание каждые 3-4 мм. Узлы должны быть плотно к мышце, но не слишком туго, чтобы немного отек тканей. Наконец, закройте вышележащих кожи с помощью металлических зажимов. Лечить кожу Betaisodona, удалите мышь от изофлуран маску и передать его в корпус клетке, когда окончательно проснулся. Следить за восстановление мыши, пока опорно-двигательного поведение является нормальным.

2. Обработка образцовPLE

  1. Один или несколько дней после электропорации, пожертвовать мыши, сбор эмбрионов и определить те правильно электропорации с помощью флуоресцентного стереомикроскопа (рис. 1D). Препарировать мозг на ледяной PBS, и закрепить их на ночь в 4% PFA (параформальдегида в фосфатный буфер рН 7,4). В конце концов, BrdU может быть введен до жертвы по разным парадигмам, чтобы исследовать кинетику клеточного цикла и пролиферации клеток 3.
  2. Мозги затем обрабатываются для резки и иммунной для нескольких маркеров радиальной глии, базальные предшественников и нейроны (Pax6, Nestin, Tbr2, Tbr1, Tuj1 и т.д.), чтобы оценить эффект функционального трансгенов на целевые НБК и их потомства, которые определены по выражению совместно электропорации гена-репортера.

Рисунок 1
Рисунок 1.В электропорации внутриутробно. (А) Схематическое представление в платформу электропорации внутриутробно. (B) чертежи с указанием расположения беременной мыши во время операции (справа) и инъекции ДНК / FastGreen смеси (синий) в полушария конечного мозга эмбриона мыши (слева). (C) схема, показывающая расположение электродов в контакте с маточной стенки с анода (+) рядом с местом инъекции (синий). Стрелки указывают на миграцию ДНК к аноду. (D) Изображение эмбриона мыши через 24 часа после электропорации с плазмидами GFP в эмбриональный день 13. Пунктирная линия разграничивает конечного мозга полушария. Схема в редактировался Calegari и соавт., 2004 17.

Часть 2: Расширение взрослых НСК

1. Производство ВИЧ-вирусных частиц, полученных

  1. День 1: плита 5 х 10 6 клеток 293Т на 10 смБлюдо с 8 мл D-MEM, содержащей 10% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки и 100 ЕД / мл ручка / стрептококковой (культуральная среда). Использование 15 блюд для одного вирусного препарата и культуры в течение ночи при 37 ° C, 5% CO 2.
  2. День 2: для каждого блюда, развести в 1 мл простого D-MEM 5 мкг каждого из 3 плазмиды, кодирующие я) VSVG (везикулярного стоматита типа вируса G) белок оболочки, II) кляп / Pol (группа специфический антиген / полимераза) и III) полицистронный построить выражающих функциональную и репортер трансгенов (т.е. cdk4/cyclinD1/GFP), ранее клонированы в ВИЧ на основе вектора переноса (p6NST90) 9. Смешайте этот раствор по 1 мл D-MEM, содержащую 45 мкл полиэтиленимин, которые были предварительно растворенного в PBS в концентрации 1 мг / мл маточного раствора и инкубировать в течение 15-30 мин при комнатной температуре. В то же время, извлеките носитель из клеток и добавляют 4 мл на чашку свежего D-MEM, содержащей 15% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки и 100 ЕД / мл ручка / стрептококк. Добавить 2 мл смеси трансфекции и культуры в течение ночи.
  3. День 3: добавить 120 мкл 500 мМ Na-бутират за блюдо для повышения экспрессии трансгенов, аккуратно перемешать и культуры в течение 6-8 часов, после чего заменить трансфекции среду с 5 мл питательной среды.
  4. День 4: собирают супернатант (около 70 мл общего объема), проходит через фильтр 0,22 мкм и передачи в 2 polyallomer пробирок (35 х 89 мм). Ультрацентрифуга на 110000 х г в течение 90 мин при 4 ° С с использованием качели ротора. Удалите супернатант, добавить 6 мл PBS в каждую пробирку и инкубируют на льду в течение 1 часа. Ресуспендируют гранул и передать его в одном polyallomer центрифужные пробирки (14 х 95 мм). Ультрацентрифуга на 110000 х г в течение 90 мин при 4 ° С с использованием качели ротора. Удалите супернатант, ресуспендируют осадок в 50 мкл PBS, составит 5 мкл аликвоты и хранят при температуре -80 ° C. Титр вируса будет находиться в диапазоне 10 8 -10 9 КОЕ / мл. (Примечание: вирусы очень чувствительны к температуре и хранения, AVOID повторного замораживания, держать в сухом льду во время транспортировки и скоро оттепель перед использованием.)

2. Стереотаксическая инъекций

  1. Anesthetize 6-10 недель мыши с изофлурана и поместить животное в положении лежа на стереотаксической рамы (рис. 2A) с помощью уха баров и неба поддержке должным образом зафиксировать голову. Животное теплым на грелку установлен на уровне 37 ° С и при постоянном изофлуран администрации.
  2. Вводят подкожно по 100 мкл рабочего раствора бупренорфина в качестве преимущественного обезболивающее, бритье полоса кожи на голове мыши, и desinfect, как описано в 1.4. Использование скальпеля, сделать ок. 1,5 см длиной продольный разрез на коже головы подвергая черепа на уровне сагиттального шва. Уберите кожи и осторожно очистите поверхность кости стерильным ватным тампоном.
  3. Half-заполнит стеклянный капилляр (спецификации 1.2) с парафиновой нефти и смонтировать его на насос-форсунка вставкикапиллярная до второго кольца (рис. 2В). Перемещение капиллярной держатель на оси х, у и г до кончика капилляра расположен на брегмы, совместно точке между сагиттальной и боковые швы (рис. 2) (будет определяться с помощью стереомикроскопа), и повторного набора х, у, г значения на 0.
  4. Переместить капилляра ± 1,6 мм в медио-поперечной оси (х) и -1,9 мм в передне-задней оси (у) и отметьте кости с помощью хирургического маркером. Сделайте отверстие ок. Диаметром 0,5 мм на черепе с помощью электрической бурильщика обращая внимание, чтобы не повредить мозг.
  5. Положить 5 мкл капли вирусной суспензии (1 аликвоты) на куске парафильмом размещены на ухо баров и погрузиться наконечник капилляра в капле. Сосать ок. 3,5 мкл вирусной суспензии использованием nanoliter инжектор установлен на уровне 55 л / сек. Выполнение этого шага быстро, как капли будут испаряться.
  6. Перемещение капиллярной на сайт оинъекций F и переместите его вниз, пока кончик не коснется поверхности мягкой мозговой оболочки. Сброс спинно-вентральной оси значений (г) до 0. На данный момент, проникают в ткани с капиллярной за -1,9 мм и отпустите 1,5 мкл вирусной суспензии в размере 4 NL / сек. Подождите 2-3 минуты, чтобы свести к минимуму обратного вирусного корыта подвески капиллярной дорожке, а затем убрать капилляров. Вторая инъекция может быть выполнена в controlateral полушарии.
  7. Шва кожи, вылечить, и позволяют животному, чтобы оправиться от наркоза, как описано выше для внутриутробно электропорации (1,8).

Рисунок 2
Рисунок 2. Стереотаксическая вирусные инъекции. (А и B) Схематическое изображение компонентов, необходимых для выполнения стереотаксической инъекции (А) и разобрали капиллярной держатель показывает вставки окpillary до второго кольца (B). (C) Изображение мыши голову иммобилизованных на слух баров и неба поддержку с кожей разрезать, чтобы разоблачить черепа (слева). Увеличение пунктирную рамку (справа) показывает, боковые и сагиттального швов, брегмы, и в месте инъекции (круг).

3. Обработка образца

  1. Один-три недели после заражения, заливать мыши с ок. 100 мл 4% PFA, препарировать мозг и пост-это исправить в течение ночи в 4% PFA. В конце концов, BrdU и / или тамоксифен может быть введен до жертвы по разным парадигмам, чтобы исследовать кинетику клеточного цикла и, чтобы остановить выражение вирусных трансгенов в окружении сайтов loxP, соответственно, 9.
  2. Мозг может быть обработан для иммунной использовании нескольких маркеров стволовых и предшественники клеток и нейронов (например, Sox2, GFAP, Nestin, Tbr2, doublecortin и т.д.).

Representative Results

  1. В целом, в электропорации внутриутробно дает 60-80% электропорации эмбрионов отображения сильное выражение гена-репортера в широком площадь боковой коры (рис. 3А). Флуоресцентные белки могут быть легко обнаружены на всей эмбрионов крепление, как только 3-6 часа после операции с сигналом продолжительностью более одной недели. В рамках целевой области, около 30-50% клеток обычно выражают трансген (ы) с долей клеток совместно выразить двумя (или более) совместно электропорации трансгенов бытия как правило, выше 90% (рис. 3В, левое) 6,8 , 15. В то время как минимальный уровень апоптоза (около 2.0-2.5%) можно было наблюдать примерно через 2 часа после электропорации, это значение будет вернуться в физиологическом уровнях (около 0.5-1.0%) после 6 часов (FC, неопубликованные данные). Доля эмбрионов или беременных мышей смерти в результате операции, как правило, незначительна (<5%). Co-электропорации с cdk4/cyclinD1 в этих условиях, затем 48 часов развития вызывает увеличение расширения нейронных предшественников на 30% (рис. 3В, справа, и C) 15.

Рисунок 3
Рисунок 3. Расширение нейронных предшественников по cdk4/cyclinD1 гиперэкспрессия. (A) флуоресценции картина разреза боковой коры эмбрионов мышей через 24 часа после электропорации с GFP и RFP плазмид в эмбриональный день 13. (B) Флуоресцентные фотографии, как и в течение 48 часов после совместного электропорации с cdk4/GFP и cyclinD1/RFP плазмид и иммунного для базисной маркер предшественников Tbr2. Флуоресцентные журналистов с DAPI counterstainig (слева) и Tbr2 (справа) показаны. Линии указывает на апикальной поверхности вентрикулярной зоне (VZ, белые линии) и границы субвентрикулярной зону (СВЗ, желтые пунктирные линии). Обратите внимание на повышенный Тхиckness из SVZ в электропорации часть коры (белые стрелки) за счет увеличения выработки и расширение базального предшественников после того, как избыточная экспрессия cdk4/cyclinD1. (C) Количественный эффект показан на B. Bars = SD, р <0,05, п = 3. Гистограмма в C взята из Lange и соавт., 2009 15.

  1. После вирусной стереотаксической инъекции, ок. 80% оперированных мыши обнаруживают сильную экспрессию трансгенов на протяжении всего зубчатой ​​извилины. Учредительный выражения GFP может быть легко обнаружена на 40 мкм разделы, как только через 4 дня после операции. Наряду ростральной к хвостовой оси зубчатой ​​извилине, около 10-30% клеток (эквивалент в общей сложности ок. 10,000-30,000 клеток) обычно выражают трансген (ы) (рис. 4а) 9. Доля мышей умирают из-за операции незначительна (<5%). Три недели сверхэкспрессия cdk4/cyclinD1 в этих условиях вызывает увеличение НСК более чем на два-складки (рис. 4, б) при уменьшении нейрогенеза на 70% (рис. 4С) 9.

Рисунок 4
Рисунок 4. Воздействие вирусной инфекции. (A) 3D реконструкции 7 флуоресценции фотографии взяты из толщиной 40 мкм серийный корональные разделы (сбор 1 раз в 6) по ростральной к хвостовой оси гиппокампа. GFP + инфицированных клеток (зеленый) и DAPI окрашивание ядер (синий) в зубчатой ​​извилине показаны (сверху). Яркие фотографии области корональных разделы, соответствующие показанным на (в центре) и 3D-представление (нижней) части целого полушария с гиппокампе выделены зеленым цветом псевдоцвете (с изменениями от Allen мозга Атлас; www.brain-map.org ) . Белые стрелки указывают в месте инъекции. Боковой (L), ростральной (R), и дорSAL (D) оси (х, у, г стереотаксических координат) указаны (справа). (B и C) Доля нестин + NSC (B) и DCX + новорожденных нейронов (C) в популяции GFP + инфицированных клеток через 3 недели после стереотаксической инъекции GFP (белый) или cdk4/cyclinD1/GFP (черный) вирусов. Бары = SD, р <0,005; п = 3. Графики в B и C взяты из Artegiani и соавт., 2011.

Discussion

Важным шагом для электропорации в внутриутробно является качество и чистоту ДНК, так как его направленности миграции во время родов электрического поля зависит от его заряда. Протоколы для очистки ДНК, которые не включают в себя удаление дополнительных заряженных молекул, таких как эндотоксины, может привести к маскировке природной ДНК отрицательных зарядов приводит к доставке бедных. Очевидно, касаясь стен матки с электродами как можно ближе к области, чтобы быть нацелены улучшить электропорации эффективности. Не менее важным является качество используемых электродов, так как это является основой для предоставления оптимального электрического поля. Микро-царапины не видно на глаз и / или органических остатков, таких как следы сыворотки, липидов и т. д., неизбежно накапливаются с течением времени приводит к потере электродами своих свойств. Старые и / или грязные electropes являются наиболее вероятной причиной резкого падения электропорации эффективность и, таким образом, должно быть тeplaced, как только это заметили. В то время как относительно простые, в электропорации внутриутробно обычно требуется несколько недель тренировок, чтобы достичь удовлетворительного и воспроизводимые результаты. Этот метод очень универсален, поскольку она может быть применена практически к любому органов и тканей развивающегося эмбриона. Конечно, содержащий органов полости, таких как головной мозг, особенно легко на цель и обеспечить высокую долю трансфицированных клеток из-за легкости потребителей инъекционных относительно большой объем ДНК.

Общей проблемой столкнулись в создании стереотаксической вирусных инъекций иметь несколько зараженных клеток и / или целевой нежелательных местах. Первая проблема в основном связана с введением низким титром вируса. 293T клетки с меньшим числом проходов в культуре растут быстрее и привести к повышению титров вируса. Использование клеток старше ок. 20 проходов не рекомендуется и средства трансфекции с менее чем 80% эффективности не обеспечит хорошеевирусной производства. Ресуспендирование вирусных гранул также имеет важное значение, вирусной суспензии должен появиться однородной и вирусных сгустки, которые могут закупоривать капиллярной следует избегать. Вирусы очень чувствительны к перепадам температуры и длительного хранения. По этим причинам, аликвоты должны быть постоянно хранится при температуре -80 ° C и не может быть замораживать. Даже в этих условиях, снижение инфекционной можно было наблюдать через 6-12 месяцев хранения. В учебной фазы, мы рекомендуем проверить титр вируса каждого вирусного препарата и сделать это еще раз после длительного хранения. Наличие инфицированных клеток в нежелательных областях мозга может зависеть от оптимального позиционирования мыши голову на стереотаксической рамы, которая требует некоторой практики. Кроме того, очень важно, чтобы не повредить поверхность мозга, открывая отверстие в черепе, потому что в противном случае он не будет возможно сбросить от 0 правильно, на поверхности мягкой мозговой оболочки, в результате неточного инъекций. Координатыпри условии, что мы в этом протоколе говорится C57/BL6 6-10 недель женщин, и мы предлагаем их оптимизации для различных деформаций / возрасту / полу. Приобретение этой техники может потребовать больше времени, чем внутриутробно электропорации в связи с чем дольше фазы, необходимой для подготовки вирусов и анализа образцов. Мы настоятельно рекомендуем вирусов используются только после операции мыши и стереотаксической инъекции стали надежным и воспроизводимым. Первым шагом к достижению этой цели является инъекционные клеточной ДНК проникающих красителей, таких как Hoechst 33342, в эвтаназии мыши и анализировать мозг немедленно.

В внутриутробно электропорации и стереотаксической инъекции вирусных два мощных систем остро и тканей специально манипулировать экспрессии генов в ЦНС млекопитающих во время развития и зрелости. Несмотря на свою ограниченность в таргетингом только на субпопуляции клеток, эти системы обеспечивают беспрецедентную скорость и простота по сравнению с более традиционными методами, яN частности трудоемкая и отнимает много времени поколение трансгенных мышей. Однако, несмотря на это сходство, некоторые различия существуют между этими двумя методами, которые стоит упомянуть. Во-первых, в связи с нападкам на различные типы клеток, в электропорации внутриутробно первоначально приводит к трансфекции стволовых клеток собственного (также называемые радиальные глии), потому что только эти клетки разграничения желудочка, где ДНК вводят. В результате деления клеток, плазмиды будет впоследствии унаследовала от целевых, материнские клетки стволовые своих предшественников и / или нервных клеток дочь, ведущих к перераспределению трансфицированных клеток по всему коры как функция времени. В противоположность этому, использование лентивирусов ВИЧ-инфекции во взрослом мозге приводит к одновременному заражения других типов клеток, включая стволовые клетки, предшественники, нейроны, а также глиальные клетки зрелой. Следует отметить, что в связи с использованием лентивирусов ВИЧ, в отличие от наиболее часто используемых ретровирусов является тот факт,лентивирусов, что интеграция будет происходить независимо от митотического состояния клеток, что позволяет адресности и взрослых, спокойных стволовых клеток.

Во-вторых, еще одно важное различие между электропорации и вирусные инфекции является то, что преходящее, эписомные выражении достигается за счет бывших в отличие от необратимой интеграции ДНК в геном инфицированной клетки достигается последнего. В результате последовательных клеточных делений, разведение электропорации плазмиды, и деградация внематочной cyclinD1 белка, будет вытекать в каждом клеточном цикле. Таким образом, расширение НСК во время эмбрионального развития был показан лишь в течение примерно двух дней 15 в то время как мозг взрослого человека этот эффект оказался длится в течение нескольких месяцев (неопубликованные результаты).

В-третьих, поскольку я) cdk4/cyclinD1 имеет более сильный эффект на клетки с большей G1 и б) совершенные нейронных предшественников во время разработки имеют более клеточного циклачем стволовые клетки, в то время как противоположное справедливо во взрослом возрасте, наши две манипуляции были найдены, чтобы вызвать расширение, в первую очередь, нейронных предшественников во время разработки и стволовых клеток во взрослом возрасте. В любом случае рост нейронов была достигнута обоими методами.

В-четвертых, вирусные инъекции могут быть легко выполнены, надежно и воспроизводимо, в различных регионах мозга взрослого человека, просто изменив стереотаксических координат. В отличие от точного нацеливания некоторых регионах центральной нервной системы, такие как ствол головного мозга, гиппокампа, или спинного мозга, в в электропорации внутриутробно может быть более трудно достичь воспроизводимо. Кроме того, в то время как стереотаксической инъекции могут быть выполнены на мышах любого возраста, оптимальной производительности в электропорации внутриутробно ограничен примерно от E11 до E16. Этапы до E11 потребуется либо использование микроскопа ультразвукового обратного рассеяния 18,19 или целый культ эмбрионаЮр системы 17,20.

В последнее время возрастает интерес к фундаментальной биологии клетки соматические стволовые клетки был повышен, потому что их исследования и манипуляции, как считается фундаментальным к разработке новой клеточной восстановительной терапии. В частности, для сверхэкспрессии cdk4/cyclinD1, наш протокол предоставляет средства для transitorily увеличить расширение НСК в естественных условиях (рис. 3В и С и 4В и C), с тем чтобы увеличить число нейронов генерируется во взрослом мозге. Мы считаем, что эти манипуляции могут иметь важное значение в ряде различных контекстов, чтобы лучше понять роль НБК в развитии мозга, развитие и гомеостаза, а также их вклад в когнитивные функции или восстановление нейронной дегенерации или травмы.

Disclosures

BA и ФК подали заявку на патент описывающий условные расширение клеток взрослого соматические стволовые cdk4/cyclinD1 вирусы (EP 10160288,6).

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Центром по регенеративной терапии, медицинский факультет ТУ Дрездена, и DFG совместных научно-исследовательский центр SFB655 (подпроект A20). BA была поддержана общение DIGS-BB программы, Дрезден. Мы благодарим доктора. Норико Osumi, Tadashi Nomura, Дитер Chichung Ли, и Рави Jagasia за ценные советы при создании внутриутробно электропорации и стереотаксической вирусные инъекции.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Endofree maxi plasmid kit Qiagen 12362
FastGreen Sigma F7258
P-97 Flaming/Brown pipette puller Sutter Instruments
Borosilicate capillaries with filament Sutter Instruments BF120-69-10
Table top laboratory animal anesthesia system VetEquip 901806
Isofluran Baxter HDG9623
Germinator 500 glass bead sterilizer SouthPointe Surgical GRM5-1460
Iris forceps WPI 15917
Betaisodona solution Mundipharma 1931491
Pico Pump WPI PV820
ECM 830 square wave electroporator Harvard Apparatus 450052
Round tweezer electrodes NEPAGENE CUY650P1
Suture material Ethicon V493H
Reflex clip applier for wound closure WPI 500345
Temgesic injection solution Essex Pharma AG
DMEM w/Glutamax-I Invitrogen 31966021
Fetal Bovin Serum Invitrogen 1027016
Penicillin/Streptomicin Gibco 15140
Tissue culture dish Falcon 353003
Polyethylenimine 250 ml Sigma-Aldrich 40872-7
n-Butyric acid, sodium salt Sigma B 5887
Tube, thinwall, polyallomer Beckman 326823 / 331374
Model 900 small animal stereotaxic instrument Kopf Instruments
OPMI pico microscope Zeiss
SYS-Micro4 controller and Nanoliter2000 injector WPI B203MC4
Glass replacement 3.5 nanoliter WPI 4878
SR drill general application Foredam K2272
Antibody Supplier Catalog # Dilution
Doublecortin Santacruz SC8066 1:100
GFAP Chemicon MAB3404 1:500
Nestin BD Biosciences 556309 1:1000
S100β Abcam Ab868 1:1000
Sox2 Millipore AB-5603 1:500
Tbr2 Abcam Ab23345 1:400
Table of antibodies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
  2. Lindvall, O., Kokaia, Z. Stem cells for the treatment of neurological disorders. Nature. 441, 1094-1096 (2006).
  3. Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 5, 332-342 (2010).
  4. Lange, C., Calegari, F. Cdks and cyclins link G(1) length and differentiation of embryonic, neural and hematopoietic stem cells. Cell Cycle. 9, 1893-1900 (2010).
  5. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
  6. Inoue, T., Krumlauf, R. An impulse to the brain--using in vivo electroporation. Nat. Neurosci. 4, 1156-1158 (2001).
  7. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 10, 865-872 (2001).
  8. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb. Cortex. Suppl 19 Supp. 120-125 (2009).
  9. Artegiani, B., Lindemann, D., Calegari, F. Overexpression of cdk4 and cyclinD1 triggers greater expansion of neural stem cells in the adult mouse. J. Exp. Med. 208, 937-948 (2011).
  10. Dixit, R., Lu, F., Cantrup, R., Gruenig, N., Langevin, L. M., Kurrasch, D. M. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
  11. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
  12. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
  13. Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors. J. Vis. Exp. (45), e2140 (2010).
  14. Lepousez, G., Alonso, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. M. Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation. J. Vis. Exp. (58), e3380 (2011).
  15. Lange, C., Huttner, W. B., Calegari, F. Cdk4/cyclinD1 overexpression in neural stem cells shortens G1, delays neurogenesis, and promotes the generation and expansion of basal progenitors. Cell Stem Cell. 5, 320-331 (2009).
  16. De Pietri Tonelli, D. Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid. Biotechniques. 41, 727-732 (2006).
  17. Calegari, F., Marzesco, A. M., Kittler, R., Buchholz, F., Huttner, W. B. Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture. Differentiation. 72, 92-102 (2004).
  18. Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
  19. Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5. J. Vis. Exp. (45), e2047 (2010).
  20. Osumi, N., Inoue, T. G. ene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics