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Ampliamento della embrionali e cellule staminali neurali adulte per * These authors contributed equally

Neuroscience
 

Summary

Controllare l'espansione delle cellule staminali somatiche è un freno notevole loro studio e l'uso in terapia. Qui si descrive un sistema per controllare temporalmente neurale espansione delle cellule staminali durante lo sviluppo e adulta, che può essere utilizzato per aumentare il numero di neuroni generati nel cervello di topo.

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Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection. J. Vis. Exp. (68), e4093, doi:10.3791/4093 (2012).

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Abstract

Cellule staminali somatiche possono dividersi per generare cellule staminali aggiuntivi (espansione) o tipi di cellule più differenziate (differenziazione), che è fondamentale per la formazione dei tessuti durante lo sviluppo embrionale e l'omeostasi dei tessuti durante l'età adulta 1. Attualmente, grandi sforzi sono investiti verso controllando il commutatore di cellule staminali somatiche dall'espansione alla differenziazione perché questo è pensato per essere fondamentale per lo sviluppo di nuove strategie per 1,2 medicina rigenerativa. Tuttavia, una sfida importante nello studio e l'uso di cellule staminali somatiche è che la loro espansione è dimostrato molto difficile da controllare.

Qui si descrive un sistema che permette il controllo della neurali staminali / progenitrici cellule (complessivamente indicati come NSC) espansione nel topo embrionale o corteccia dell'ippocampo adulto manipolando l'espressione del complesso cdk4/cyclinD1, un regolatore della fase G1 del ciclo delle cellule somatiche e cellule staminali differentiation 3,4. In particolare, due differenti approcci sono descritti con cui il complesso cdk4/cyclinD1 è iperespresso in NSC in vivo. Dal primo approccio, la sovraespressione di regolatori del ciclo delle cellule viene ottenuta iniettando plasmidi codificanti per cdk4/cyclinD1 nel lume del telencefalo topo seguita da elettroporazione in utero consegnate al NSC della corticale laterale, quindi, innescando espressione episomale del transgeni 5-8. Con il secondo approccio, altamente concentrati HIV-derivati ​​virus sono stereotaxically iniettati nel giro dentato dell'ippocampo topo adulto, quindi, innescando espressione costitutiva di regolatori ciclo cellulare dopo l'integrazione del costrutto virale nel genoma delle cellule infette 9. Entrambi gli approcci, i cui principi di base sono stati già descritti da altri protocolli video 10-14, sono stati qui ottimizzato per i) ridurre i danni ai tessuti, ii) porzioni di destinazione a livello di cervello regio molto specificons, iii) ottenere un numero elevato di cellule manipolate all'interno di ogni regione, e iv) attivare elevati livelli di espressione dei transgeni all'interno di ogni cella. Sovraespressione transiente dei transgeni utilizzando i due approcci è ottenuto mediante diverse cioè da diluizione naturale dei plasmidi elettroporate causa di divisione cellulare o tamoxifene somministrazione in Cre-esprimendo NSC infettato da virus che trasportano cdk4/cyclinD1 fiancheggiati da siti loxP, rispettivamente 9,15 .

Questi metodi forniscono una piattaforma molto potente per manipolare acutamente e tessuto-specifico l'espressione di un gene nel cervello di topo. In particolare, manipolando l'espressione del complesso cdk4/cyclinD1, il nostro sistema consente il controllo temporale di espansione NSC e la loro differenziazione interruttore, quindi, in ultima analisi, aumentando il numero di neuroni generati nel cervello dei mammiferi. Il nostro approccio può essere di fondamentale importanza per la ricerca di base e l'utilizzo di cellule staminali somatiche per la terapiadel sistema nervoso centrale dei mammiferi, fornendo una migliore comprensione di i) staminali contributo alla formazione di tessuto cellulare durante lo sviluppo, ii) l'omeostasi dei tessuti durante l'età adulta, iii) il ruolo della neurogenesi adulta delle funzioni cognitive, e forse, iv) un migliore utilizzo staminali somatiche cellule in modelli di malattie neurodegenerative.

Protocol

Nota preliminare

La chirurgia deve essere eseguita da investigatori pienamente addestrati, previa autorizzazione da parte delle autorità locali per il benessere degli animali. Tutte le precauzioni devono essere adottate per ridurre al minimo il dolore e lo stress inflitto agli animali tra cui anestesia profonda, la somministrazione di analgesia postoperatoria e, per operazioni di durata superiore a 10 minuti, l'applicazione di un lubrificante occhio per prevenire la disidratazione della cornea e cecità. Topi anestetizzati deve essere mantenuto costantemente caldo a 37 ° C fino a completa guarigione e ogni strumento chirurgico e la soluzione deve essere sterile. Sebbene l'uso di una cappa biologica non è strettamente necessario, l'operatore deve prendere tutte le precauzioni ragionevoli per ridurre al minimo la possibilità di infettare l'animale durante l'operazione indossando un camice da laboratorio, maschera e guanti. Allo stesso modo, ogni passo riguardante la generazione e l'utilizzo di virus deve essere autorizzato e deve avvenire in zone S2 secondo le disposizioni delle autorità locali.Infine, una decontaminazione completa di tutti gli strumenti e le superfici che potrebbero essere stati a contatto con i virus devono essere eseguite in conformità alle pratiche approvati per gli impianti di disinfezione (per l'HIV pulendo con il 70% Et-OH e / o autoclave).

Parte 1: Ampliamento della NSC embrionali

1. Elettroporazione in utero

  1. Dopo la clonazione (cioè i transgeni cdk4/cyclinD1) in PCM-EGFP (Clontech) o pDSV-mRFPnls vettori 16, purificare i plasmidi EndoFree usando kit e risospendere in PBS sterile a una concentrazione di 3-5 mg / mL. Poco prima dell'intervento chirurgico, miscelare i plasmidi con 0,05% in PBS FastGreen un rapporto finale di ca. 04:04:01 e centrifugare la miscela per 2 minuti a 16.000 xg per rimuovere tutti precipitati.
  2. Caricare la miscela DNA in un bicchiere precedentemente tirato borosilicato capillare. Tirare i parametri con un P-97 estrattore pipetta sono: tiro: 200; vel: 140, tempo: 140. Calore è dato da un test rampa e dipende dalla specsacco ific dei capillari in uso. Montare il capillare sul beccuccio del PicoPump che è vicino alla piattaforma di elettroporazione in utero (Figura 1A) e, sotto uno stereomicroscopio, piegare la punta e nick in corrispondenza del punto di flesso.
  3. Sterilizzare tutti gli strumenti di chirurgia in uno sterilizzatore a secco perle di vetro e profondamente anestetizzare un topo in stato di gravidanza al giorno 12-15 di gestazione con un vaporizzatore isoflurano. Posizionare l'animale in posizione supina su una piattaforma di riscaldamento a 37 ° C e mantenere sotto costante somministrazione isoflurano attraverso un cono.
  4. Rasatura la pelle dell'addome, disinfettare con tempi più Betaisodona, eventualmente pulire tra con etanolo 70%, e iniettare buprenorfina (diluito in PBS) per via sottocutanea a 0,1 mg / kg concentrazione preventiva analgesico. Usando forbici sottili, effettuare un taglio longitudinale 2 centimetri della pelle e, successivamente, della parete muscolare sottostante per accedere alla cavità peritoneale. Dispensare in ca cavità peritoneale. 2ml di soluzione IUE (D-PBS contenente 100 U / ml di pen / strep) preriscaldato a 37 ° C e mantenere la soluzione su una piastra riscaldante.
  5. Coprire il mouse con drap sterile contenente una fessura dalla quale cervice verrà rimosso. Ritrarre l'incisione con un divaricatore di tungsteno, identificare l'utero ed estrarlo tenendolo con una pinza tra embrioni adiacenti (Figura 1B, a sinistra) e infine si sdraiò sul drap sterile. Durante l'intera operazione, risciacquare l'utero con soluzione IUE per idratare la cavità organo e corpo e prevenire la disidratazione dell'animale.
  6. Maneggiare con cura l'utero tenendolo tra il pollice e l'indice e ruotare un embrione fino alla sua testa è visibile e orientata verso l'operatore. Identificare gli emisferi telencefalici e iniettare uno di loro dal dorso-laterale. Rilasciare 1-2 microlitri della soluzione di DNA usando il pedale di un PicoPump finché il ventricolo viene delineato da FastGreen (Figura 1B, destra).
  7. (Figura 1C) e fornire 6 impulsi di 30 V per 50 ms con intervallo di 950 ms tra ogni impulso utilizzando un elettroporatore generare campi elettrici di forma quadrata azionato attraverso un interruttore a pedale. Evitare di posizionare gli elettrodi vicino alla placenta in quanto ciò potrebbe causare emorragie e danni l'embrione.
  8. Quando tutti gli embrioni vengono iniettati e elettroporate, posizionare l'utero indietro nella cavità addominale e chiudere le pareti muscolari con un filo di sutura sutura ogni 3-4 mm. I nodi deve essere aderente al muscolo, ma non troppo stretto per consentire un po 'di gonfiore dei tessuti. Infine, chiudere la pelle sovrastante con clip metalliche. Disinfettare la pelle con Betaisodona, togliere il mouse dalla maschera isoflurano e trasformare in una gabbia di alloggiamento quando è completamente sveglio. Monitorare il recupero del mouse fino comportamento locomotorio è normale.

2. Elaborazione del samPLE

  1. Uno o più giorni dopo l'elettroporazione, sacrificare il mouse, raccogliere gli embrioni e di individuare quelli correttamente elettroporate utilizzando uno stereomicroscopio a fluorescenza (Figura 1D). Staccare il cervello su ghiaccio-freddo PBS, e fissare per una notte in 4% PFA (paraformaldeide in tampone fosfato pH 7,4). Alla fine, BrdU può essere somministrato prima del sacrificio secondo paradigmi diversi per indagare cinetica del ciclo cellulare e la proliferazione cellulare 3.
  2. I cervelli vengono poi elaborati per il sezionamento e immunostaining per i marcatori diversi glia radiale, progenitori basali e neuroni (Pax6, Nestin, tbr2, Tbr1, Tuj1 ecc) per valutare l'effetto dei transgeni funzionali su mirato NSC e la loro progenie che sono identificato l'espressione del co-elettroporata gene reporter.

Figura 1
Figura 1.In elettroporazione utero. (A) Rappresentazione schematica di una piattaforma di elettroporazione in utero. (B) disegni che illustrano il posizionamento del mouse incinta durante l'intervento chirurgico (a destra) e l'iniezione del DNA / FastGreen miscela (blu) nell'emisfero telencephalic di un embrione di topo (a sinistra). (C) Schema che mostra il posizionamento degli elettrodi a contatto con le pareti uterine con l'anodo (+) adiacente al sito di iniezione (blu). Le frecce indicano la migrazione del DNA verso l'anodo. (D) Foto di un mouse embrione 24 ore dopo l'elettroporazione con plasmidi GFP al giorno embrionale 13. La linea tratteggiata delimita l'emisfero telencephalic. Schema in A modificato da Calegari et al., 2004 17.

Parte 2: Ampliamento della Adult NSC

1. Produzione di HIV-derivati ​​particelle virali

  1. Giorno 1: piastra 5 x 10 6 cellule 293T su un cm 10piatto con 8 ml di D-MEM contenente il 10% del calore di siero fetale bovino inattivato e 100 U / ml di pen / strep (terreno di coltura). Utilizzare 15 piatti per una preparazione virale e cultura overnight a 37 ° C, 5% di CO 2.
  2. Giorno 2: per ogni piatto, diluire in 1 ml di pianura D-MEM 5 mg di ciascuno dei 3 plasmidi codifica per i) VSVG (tipo virus della stomatite vescicolare G) proteina dell'involucro, ii) gag / pol (antigene specifico gruppo / polimerasi) e iii) un costrutto policistronico esprimere i transgeni funzionali e reporter (cioè cdk4/cyclinD1/GFP) precedentemente clonati in un vettore di HIV-based trasferimento (p6NST90) 9. Mescolare questa soluzione con 1 ml di D-MEM contenente 45 microlitri di polietilenimmina che è stato preventivamente sciolto in PBS a 1 mg / ml di soluzione concentrata, ed incubare per 15-30 min a temperatura ambiente. Nel frattempo, rimuovere il supporto dalle cellule e aggiungere 4 ml per piastra di fresco D-MEM contenente il 15% del calore di siero fetale bovino inattivato e 100 U / ml di pen / strep. Aggiungere il 2 ml di miscela di trasfezione e pernottamento cultura.
  3. Giorno 3: aggiungere 120 ml di 500 mM Na-butirrato a piatto per migliorare l'espressione dei transgeni, mescolare delicatamente e cultura per 6-8 ore dopo che sostituiscono il mezzo trasfezione con 5 ml di terreno di coltura.
  4. 4 ° giorno: Raccogliere i surnatanti (ca. 70 ml totale), passare attraverso un filtro 0,22 micron e il trasferimento in provette per centrifuga polyallomer 2 (35 x 89 mm). Ultracentrifuga a 110.000 xg per 90 min a 4 ° C utilizzando un rotore swing. Eliminare il supernatante, aggiungere 6 ml di PBS in ogni provetta e incubare in ghiaccio per 1 ora. Risospendere il pellet e trasferirlo in una provetta da centrifuga polyallomer (14 x 95 mm). Ultracentrifuga a 110.000 xg per 90 min a 4 ° C utilizzando un rotore swing. Eliminare il surnatante, risospendere il pellet in 50 ml di PBS, fare 5 pl aliquote e conservare a -80 ° C. Titolo virale sarà nell'intervallo di 10 8 -10 9 cfu / ml. (Nota: i virus sono molto sensibili alla temperatura e stoccaggio, AVOid ri-congelamento, tenere in ghiaccio secco durante il trasporto e scongelare poco prima dell'uso.)

2. Iniezione stereotassica

  1. Anestetizzare un topo 6-10 settimane con isoflurano e posizionare l'animale in posizione prona su un telaio stereotassico (Figura 2A) utilizzando le barre orecchio e il palato supporto per fissare correttamente la testa. L'animale viene mantenuto caldo su un rilievo di riscaldamento a 37 ° C e sotto costante somministrazione isoflurano.
  2. Iniettare per via sottocutanea 100 pl di soluzione di buprenorfina lavorare come preventivo analgesico, barba una striscia di pelle sulla testa del mouse e disinfettare come descritto in 1.4. Usando un bisturi, fare un ca. 1,5 cm di lunghezza incisione longitudinale sulla pelle testa esporre il cranio a livello della sutura sagittale. Ritrarre la pelle e pulire delicatamente la superficie ossea, con un batuffolo di cotone sterile.
  3. Riempire a metà un capillare di vetro (specifiche 1.2) con olio di paraffina e montarlo sulla pompa iniettore inserimentoil capillare fino al secondo anello (Figura 2B). Spostare il supporto capillare sull'asse x, yez finché la punta del capillare è posizionato sul bregma, il punto di congiunzione tra le suture sagittale e laterale (Figura 2C) (da definire con l'ausilio di uno stereomicroscopio), e re-set x, y, z ed i valori a 0.
  4. Spostare il capillare da ± 1,6 mm in asse medio-laterale (x) e -1,9 mm nel asse anteriore-posteriore (y) e contrassegnare l'osso con una penna marcatore chirurgico. Praticare un foro di ca. 0,5 mm di diametro sul cranio con un trapano elettrico facendo attenzione a non danneggiare il cervello.
  5. Mettere a goccia 5 ml di sospensione virale (1 aliquota) su un pezzo di parafilm posizionato sulle barre orecchio ed immergere la punta del capillare nella gocciolina. Succhiare ca. 3,5 ml di sospensione virale utilizza un iniettore nanolitri fissato a 55 nl / sec. Eseguire questo passaggio rapidamente la goccia evapora.
  6. Spostare il capillare al sito of iniezione e spostarlo verso il basso fino a quando la punta tocca la superficie piale. Resettare il dorso-ventrale valore asse (z) a 0. A questo punto, penetrano il tessuto con il capillare per -1,9 mm e rilasciare 1,5 ml di sospensione virale ad una velocità di 4 nl / sec. Attendere per 2-3 minuti per minimizzare il riflusso di sospensione virale attraverso la pista capillare e quindi ritrarre il capillare. Una seconda iniezione può essere eseguita nell'emisfero controlaterale.
  7. Suturare la pelle, disinfettare, e permettere all'animale di recuperare da anestesia, come descritto in precedenza per elettroporazione in utero (1.8).

Figura 2
Figura 2. Stereotassico iniezione virale. (A e B) Rappresentazione schematica dei componenti necessari per eseguire l'iniezione stereotassica (A) e un supporto smontato capillare che mostra l'inserimento di un capillary fino al secondo anello (B). (C) Foto di testa di topo immobilizzato dalle barre orecchio e il sostegno palato con la pelle tagliata per esporre il cranio (a sinistra). L'ingrandimento della scatola tratteggiata (destra) mostra le suture laterali e sagittale, il bregma, e il sito di iniezione (cerchio).

3. Trattamento del campione

  1. One-to-tre settimane dopo l'infezione, perfusione il mouse con ca. 100 ml del 4% PFA, sezionare il cervello e post-fix durante la notte nel 4% PFA. Alla fine, BrdU e / o tamoxifen può essere somministrata prima del sacrificio secondo paradigmi diversi per indagare cinetica del ciclo cellulare e per arrestare l'espressione dei transgeni virali fiancheggiati da siti loxP, rispettivamente, 9.
  2. Il cervello può quindi essere trattati per immunoistochimica utilizzando numerosi marcatori di cellule staminali e progenitori e neuroni (ad esempio, Sox2, GFAP, Nestin, tbr2, doublecortin, ecc.)

Representative Results

  1. Nel complesso, elettroporazione in utero produce 60-80% di embrioni elettroporate mostrano forte espressione del gene reporter in una vasta area della corteccia laterale (Figura 3A). Proteine ​​fluorescenti possono essere facilmente individuati su embrioni interi montaggio appena 3-6 ore dopo l'intervento con il segnale dura per più di una settimana. All'interno della zona mirata, circa il 30-50% di cellule normalmente esprimono il transgene (s) e la percentuale di cellule co-esprimono due (o più) co-elettroporate transgeni generalmente superiore al 90% (Figura 3B, sinistra) 6,8 , 15. Mentre un livello minimo di apoptosi (ca. 2,0-2,5%) è stato osservato dopo circa 2 ore di elettroporazione, questo valore tornerà a livelli fisiologici (ca. 0.5-1.0%) dopo circa 6 ore (FC, dati non pubblicati). La proporzione di embrioni o topi incinte muoiono a causa della chirurgia è generalmente trascurabile (<5%). Co-elettroporazione con cdk4/cyclinD1 in queste condizioni, seguito da 48 ore di sviluppo provoca un aumento della espansione di progenitori neurali del 30% (Figura 3B, a destra, e C) 15.

Figura 3
Figura 3. Espansione di progenitori neurali da cdk4/cyclinD1 sovraespressione. (A) foto fluorescenza di una sezione attraverso la corteccia laterale di un embrione di topo 24 ore dopo l'elettroporazione con plasmidi GFP e RFP al giorno embrionale 13. (B) le immagini fluorescenti come in una 48 ore dopo il co-elettroporazione con plasmidi cdk4/GFP e cyclinD1/RFP e immunomarcatura per il marcatore progenitore basale tbr2. Reporter fluorescenti con DAPI counterstainig (a sinistra) e tbr2 (a destra) sono mostrati. Linee indica la superficie apicale della zona ventricolare (VZ; linea bianca) ed i confini della zona subventricolare (SVZ; giallo linee tratteggiate). Notare la maggiore thickness della SVZ nella porzione elettroporate della corteccia (frecce bianche) a causa di un aumento di generazione e l'espansione di progenitori basali dopo sovraespressione di cdk4/cyclinD1. (C) Quantificazione degli effetti presenti in bar B. = SD, p <0.05, n = 3. Grafico a barre in C è preso da Lange et al., 2009 15.

  1. Dopo iniezione virale stereotassico, ca. 80% dei topi operati visualizzare forte espressione dei transgeni in tutto il giro dentato tutto. Espressione costitutiva di GFP può essere facilmente rilevato su 40 sezioni micron appena 4 giorni dopo l'intervento chirurgico. Lungo la rostrale-to-caudale all'asse del giro dentato, circa il 10-30% delle cellule (equivalente ad un totale di ca. 10,000-30,000 cellule) solitamente esprimono il transgene (s) (Figura 4A) 9. La proporzione di topi muoiono a causa della chirurgia è trascurabile (<5%). Tre sovraespressione settimana di cdk4/cyclinD1 in queste condizioni provoca un aumento della NSC di oltre duepieghe (Figura 4B) sono diminuite neurogenesi del 70% (Figura 4C) 9.

Figura 4
Figura 4. Effetti di infezione virale. (A) ricostruzione 3D di immagini 7 fluorescenza prese da 40 micron di spessore sezioni seriali coronali (raccolta 1 ogni 6) lungo il rostrale-to-caudale asse dell'ippocampo. GFP + cellule infette (verde) e la colorazione DAPI nucleare (blu) del giro dentato sono riportati (in alto). Immagini in campo chiaro delle sezioni coronali corrispondenti a quelli indicati in A (al centro) e la rappresentazione 3D (in basso) di tutto l'emisfero cerebrale con l'ippocampo evidenziato in verde pseudocolore (modificato dal cervello Allen Atlas; www.brain-map.org ) . Frecce bianche puntare il sito di iniezione. Laterale (L), rostrale (R), e dorSAL (D) assi (x, y, z coordinate stereotassico) sono indicati (destra). (B e C) Percentuale di nestina + NSC (B) e DCX + neuroni neonati (C) all'interno della popolazione di GFP + cellule infette 3 settimane dopo l'iniezione stereotassica di GFP (bianco) o cdk4/cyclinD1/GFP (nero) virus. Bar = SD, p <0.005, n = 3. Grafici in B e C tratto da Artegiani et al., 2011.

Discussion

Un punto critico per elettroporazione in utero è la qualità e la purezza del DNA dalla sua migrazione direzionale durante la consegna dei campi elettrici dipende dalla sua carica. Protocolli per la purificazione del DNA che non comprendono la rimozione di ulteriori molecole cariche, quali endotossine, possono portare alla mascheratura delle cariche negative DNA naturali che portano alla consegna poveri. Chiaramente, toccare le pareti uterine con gli elettrodi più vicino possibile alla zona da mirata migliorerà l'efficienza elettroporazione. Altrettanto importante è la qualità degli elettrodi utilizzati poiché questo è fondamentale per la consegna di campi elettrici ottimali. Micrograffi nemmeno visibili a occhio e / o residui organici, quali tracce di siero, lipidi, e così via, inevitabilmente si accumulano nel tempo portando ad elettrodi perdono le loro proprietà. Electropes Vecchio e / o sporchi sono la causa più probabile di un improvviso calo di efficienza elettroporazione e, quindi, dovrebbe essere replaced non appena questo si nota. Mentre relativamente semplice, in elettroporazione utero in genere richiede un paio di settimane di formazione al fine di raggiungere in modo soddisfacente e risultati riproducibili. Questa tecnica è molto versatile in quanto può essere applicato virtualmente a qualsiasi organo e tessuto del embrione. Certamente, organi contenenti una cavità, come il cervello, sono particolarmente facili da colpire e consentire un'elevata percentuale di cellule trasfettate causa della facilità di iniettare un volume relativamente grande di DNA.

Un problema comune incontrato nella creazione stereotassico iniezione virale è avere poche cellule infette e / o per individuare le zone indesiderate. Il primo problema è principalmente correlato con l'iniezione di bassa titolazione virus. Cellule 293T con il minor numero di passaggi in coltura crescono più rapidamente e portare a più alti titoli virali. Utilizzando cellule di età superiore a ca. 20 passaggi non è raccomandato e mezzi di trasfezione con meno del 80% di efficienza non assicura una buonaproduzione virale. Risospensione del pellet virale è critica, la sospensione virale deve apparire grumi omogenei e virali che possono occludere il capillare deve essere evitato. I virus sono molto sensibili alla temperatura si abbassa e la conservazione a lungo termine. Per questo motivo, aliquote devono essere permanentemente conservate a -80 ° C e non può essere ricongelato. Anche in queste condizioni, una diminuzione infettività potrebbe essere osservata dopo 6-12 mesi di stoccaggio. Nelle fasi di apprendimento, si consiglia di testare il titolo virale di ogni preparazione virale e di farlo di nuovo dopo la conservazione a lungo termine. La presenza di cellule infettate in aree indesiderate del cervello può dipendere da un posizionamento non ottimale della testa del mouse sul telaio stereotassico, che richiede una certa pratica. Inoltre, è fondamentale non danneggiare la superficie del cervello durante l'apertura del foro sul cranio perché altrimenti non sarà possibile ripristinare il corretto 0 sulla superficie piale, con conseguente iniezione imprecise. Le coordinateche abbiamo fornito in questo protocollo sono definiti C57/BL6 femmine 6-10 settimane e si consiglia loro ottimizzazione per ceppo diverso / età / sesso. Acquisizione di questa tecnica può richiedere più tempo rispetto a elettroporazione utero a causa delle fasi più lunghi necessari per preparare i virus e l'analisi dei campioni. Si consiglia vivamente che i virus vengono utilizzati solo dopo l'intervento chirurgico del mouse e l'iniezione stereotassica sono diventati affidabili e riproducibili. Il primo passo per ottenere questo è quello di iniettare cellule permeanti coloranti DNA, come Hoechst 33342, in topi eutanasia e analizzare i cervelli immediatamente.

In elettroporazione utero e iniezione stereotassica virale sono due potenti sistemi di acutamente e tessuto-specifica manipolare l'espressione genica nel sistema nervoso centrale durante lo sviluppo dei mammiferi e l'età adulta. Nonostante la loro limitazione in termini di orientamento solo una sottopopolazione di cellule, questi sistemi offrono una velocità senza precedenti e facilità rispetto ai metodi più tradizionali, in particolare, la generazione laboriosa e che richiede tempo di topi transgenici. Eppure, nonostante questa somiglianza, esistono molte differenze tra le due tecniche che sono degni di nota. Primo, per quanto riguarda l'orientamento dei diversi tipi di cellule, elettroporazione in utero comporta inizialmente la trasfezione di cellule staminali corrette (chiamato anche cellule gliali radiali) perché queste sono le uniche cellule che delimitano il ventricolo cui viene iniettato il DNA. Come risultato di divisioni cellulari, plasmidi saranno successivamente ereditato da cellule madri mirati, staminali per loro progenitore e / o cellule figlie neuronali che portano alla ridistribuzione di cellule trasfettate in tutta la corteccia come una funzione del tempo. Al contrario, l'utilizzo di lentivirus HIV nel cervello adulto conduce alla infezione simultanea di qualsiasi tipo di cellula incluse cellule staminali, progenitori, neuroni nonché maturi cellule gliali. Di nota, per quanto riguarda usando lentivirus HIV rispetto a retrovirus più comunemente usato è il fattoche l'integrazione lentivirale avverrebbe indipendentemente dallo stato mitotico delle cellule, consentendo così di mira anche di adulti, cellule staminali quiescenti.

In secondo luogo, un altro importante differenza tra elettroporazione e infezione virale è che un transitorio, espressione episomale si ottiene la prima rispetto alla integrazione irreversibile di DNA nel genoma delle cellule infette conseguiti da quest'ultimo. Come risultato di divisioni cellulari consecutive, diluizione dei plasmidi elettroporate e degradazione della proteina cyclinD1 ectopica, deriverebbero ad ogni ciclo cellulare. Così, l'espansione del NSC durante lo sviluppo embrionale è stato dimostrato solo all'ultimo per circa due giorni 15, mentre nel cervello adulto questo effetto è risultato dura per diversi mesi (risultati non pubblicati).

In terzo luogo, poiché i) cdk4/cyclinD1 ha un effetto più forte sulle cellule con un G1 più lunga e ii) commessi progenitori neurali durante lo sviluppo hanno un più lungo ciclo cellularerispetto alle cellule staminali, mentre vale il contrario durante l'età adulta, i nostri due manipolazioni sono stati trovati per innescare l'espansione, in primo luogo, dei progenitori neurali durante lo sviluppo delle cellule staminali e in età adulta. In entrambi i casi un aumento neuroni è stato raggiunto con entrambi i metodi.

Quarto, iniezione virale può essere facilmente eseguita, affidabile e riproducibile, in diverse regioni del cervello adulto semplicemente cambiando le coordinate stereotassico. In contrasto, il targeting preciso di certe regioni del sistema nervoso centrale, come tronco cerebrale, formazione dell'ippocampo, o al midollo spinale, da elettroporazione in utero potrebbe essere più difficile da raggiungere riproducibile. Inoltre, mentre l'iniezione stereotassica può essere eseguita su topi di ogni età, prestazioni ottimali di elettroporazione in utero è limitata da circa E11 a E16. Fasi prima della E11 sarebbe necessario o l'uso di un microscopio backscatter ecografia 18,19 o un culto embrione interoure sistema 17,20.

Recentemente, un crescente interesse per la biologia cellulare di base delle cellule staminali somatiche è stato promosso perché il loro studio e la manipolazione si pensa di essere fondamentale per lo sviluppo di nuove terapie rigenerative basate sulle cellule. In particolare per la sovraespressione di cdk4/cyclinD1, nostro protocollo fornisce i mezzi per aumentare transitoriamente l'espansione di NSC in vivo (Figura 3B e 4B e C e C), al fine di aumentare il numero di neuroni generati nel cervello adulto. Noi crediamo che queste manipolazioni può essere importante in una serie di contesti diversi per comprendere meglio il ruolo di NSC nello sviluppo del cervello, l'evoluzione e l'omeostasi e il loro contributo alla funzione cognitiva o di recupero da degenerazione neurale o lesioni.

Disclosures

BA e FC hanno presentato una domanda di brevetto che descrive l'espansione condizionale di cellule staminali somatiche adulte da cdk4/cyclinD1 virus (EP 10.160.288,6).

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal Centro per le terapie rigenerative, la facoltà di medicina del TU di Dresda, e la DFG Collaborative Research Center SFB655 (A20 sottoprogetto). BA è stato sostenuto da una borsa di studio degli scavi-BB programma, Dresda. Ringraziamo Drs. Noriko Osumi, Tadashi Nomura, Dieter Lie Chichung, e Ravi Jagasia per preziosi consigli durante la creazione di elettroporazione in utero e stereotassico iniezione virale.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Endofree maxi plasmid kit Qiagen 12362
FastGreen Sigma F7258
P-97 Flaming/Brown pipette puller Sutter Instruments
Borosilicate capillaries with filament Sutter Instruments BF120-69-10
Table top laboratory animal anesthesia system VetEquip 901806
Isofluran Baxter HDG9623
Germinator 500 glass bead sterilizer SouthPointe Surgical GRM5-1460
Iris forceps WPI 15917
Betaisodona solution Mundipharma 1931491
Pico Pump WPI PV820
ECM 830 square wave electroporator Harvard Apparatus 450052
Round tweezer electrodes NEPAGENE CUY650P1
Suture material Ethicon V493H
Reflex clip applier for wound closure WPI 500345
Temgesic injection solution Essex Pharma AG
DMEM w/Glutamax-I Invitrogen 31966021
Fetal Bovin Serum Invitrogen 1027016
Penicillin/Streptomicin Gibco 15140
Tissue culture dish Falcon 353003
Polyethylenimine 250 ml Sigma-Aldrich 40872-7
n-Butyric acid, sodium salt Sigma B 5887
Tube, thinwall, polyallomer Beckman 326823 / 331374
Model 900 small animal stereotaxic instrument Kopf Instruments
OPMI pico microscope Zeiss
SYS-Micro4 controller and Nanoliter2000 injector WPI B203MC4
Glass replacement 3.5 nanoliter WPI 4878
SR drill general application Foredam K2272
Antibody Supplier Catalog # Dilution
Doublecortin Santacruz SC8066 1:100
GFAP Chemicon MAB3404 1:500
Nestin BD Biosciences 556309 1:1000
S100β Abcam Ab868 1:1000
Sox2 Millipore AB-5603 1:500
Tbr2 Abcam Ab23345 1:400
Table of antibodies

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References

  1. Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
  2. Lindvall, O., Kokaia, Z. Stem cells for the treatment of neurological disorders. Nature. 441, 1094-1096 (2006).
  3. Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 5, 332-342 (2010).
  4. Lange, C., Calegari, F. Cdks and cyclins link G(1) length and differentiation of embryonic, neural and hematopoietic stem cells. Cell Cycle. 9, 1893-1900 (2010).
  5. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
  6. Inoue, T., Krumlauf, R. An impulse to the brain--using in vivo electroporation. Nat. Neurosci. 4, 1156-1158 (2001).
  7. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 10, 865-872 (2001).
  8. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb. Cortex. Suppl 19 Supp. 120-125 (2009).
  9. Artegiani, B., Lindemann, D., Calegari, F. Overexpression of cdk4 and cyclinD1 triggers greater expansion of neural stem cells in the adult mouse. J. Exp. Med. 208, 937-948 (2011).
  10. Dixit, R., Lu, F., Cantrup, R., Gruenig, N., Langevin, L. M., Kurrasch, D. M. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
  11. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
  12. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
  13. Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors. J. Vis. Exp. (45), e2140 (2010).
  14. Lepousez, G., Alonso, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. M. Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation. J. Vis. Exp. (58), e3380 (2011).
  15. Lange, C., Huttner, W. B., Calegari, F. Cdk4/cyclinD1 overexpression in neural stem cells shortens G1, delays neurogenesis, and promotes the generation and expansion of basal progenitors. Cell Stem Cell. 5, 320-331 (2009).
  16. De Pietri Tonelli, D. Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid. Biotechniques. 41, 727-732 (2006).
  17. Calegari, F., Marzesco, A. M., Kittler, R., Buchholz, F., Huttner, W. B. Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture. Differentiation. 72, 92-102 (2004).
  18. Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
  19. Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5. J. Vis. Exp. (45), e2047 (2010).
  20. Osumi, N., Inoue, T. G. ene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).

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