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Erweiterung der embryonalen und adulten neuralen Stammzellen * These authors contributed equally

Neuroscience
 

Summary

Steuern der Expansion von somatischen Stammzellen ist ein Hauptfaktor, was ihrer Studie und therapeutischen Verwendung. Hier beschreiben wir ein System zur zeitlich steuern Nervenstammzellen Expansion während der Entwicklung und im Erwachsenenalter, die verwendet werden, um die Zahl der Neuronen im Gehirn der Maus erzeugt erhöhen kann.

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Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection. J. Vis. Exp. (68), e4093, doi:10.3791/4093 (2012).

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Abstract

Somatischen Stammzellen sich teilen, um weitere Stammzellen (Expansion) oder mehr differenzierte Zelltypen (Differenzierung), die von grundlegender Bedeutung für das Tissue Formation während der embryonalen Entwicklung und Gewebshomöostase im Erwachsenenalter 1 ist zu generieren. Derzeit werden große Anstrengungen zur Steuerung des Schalters von somatischen Stammzellen von der Expansion zur Differenzierung, da diese wird angenommen, dass von grundlegender Bedeutung für die Entwicklung neuer Strategien für die regenerative Medizin 1,2 investiert. Allerdings ist eine große Herausforderung in der Studie und die Verwendung von somatischen Stammzellen, dass ihre Expansion hat sich als sehr schwer zu kontrollieren.

Hier beschreiben wir ein System, das die Steuerung der neuralen Stamm / Vorläuferzelle (insgesamt als NSC bezeichnet) Expansion in der embryonalen Maus Kortex oder des Hippokampus Erwachsenen durch Manipulation der die Expression des cdk4/cyclinD1 Komplex, ein wichtiger Regulator der G1-Phase ermöglicht des Zellzyklus und somatischen Stammzellen differentiation 3,4. Insbesondere werden zwei unterschiedliche Ansätze beschrieben, mit dem die cdk4/cyclinD1 Komplexes in NSR wird in vivo überexprimiert. Durch den ersten Ansatz wird Überexpression der Zellzyklus-Regulatoren durch Einspritzen Plasmiden für cdk4/cyclinD1 im Lumen des Maus Telencephalon gefolgt von Elektroporation in utero Sie um NSC des lateralen Kortex liefern somit Auslösen episomalen Expression der erhaltene Transgene 5-8. Durch den zweiten Ansatz werden hochkonzentrierte HIV-Viren abgeleiteten stereotaktisch im Gyrus dentatus des Hippocampus erwachsenen Maus injiziert, damit Auslösen konstitutive Expression der Zellzyklusregulatoren nach der Integration des Konstrukts in der viralen Genom der infizierten Zellen 9. Beide Ansätze, deren Grundlagen wurden bereits von anderen Video-Protokolle 10-14 beschrieben, wurden hier, um i optimiert) zu reduzieren Gewebeschäden, ii) target breite Abschnitte von sehr spezifischen Gehirn regions, iii) erzielen hohe Anzahlen von manipulierten Zellen innerhalb jeder Region, und iv) auszulösen hohe Expressionsniveaus der Transgene in jeder Zelle. Transiente Überexpression der Transgene mit den beiden Ansätzen mit unterschiedlichen Mitteln durch natürliche Verdünnung der elektroporierten Plasmide durch Zellteilung oder Tamoxifen Verwaltung in Cre-exprimierenden NSC mit Viren Durchführung cdk4/cyclinD1 von loxP-Stellen flankiert infiziert bzw. 9,15 dh erhalten .

Diese Methoden stellen eine sehr leistungsfähige Plattform, um akut und Gewebe gezielt manipulieren die Expression von jedem Gen im Gehirn der Maus. Insbesondere durch die Manipulation der die Expression des Komplexes cdk4/cyclinD1 ermöglicht unser System die zeitliche Steuerung der Expansion NSC und deren Schalter auf Differenzierung, damit letztlich eine Erhöhung der Anzahl von Neuronen im Gehirn von Säugern erzeugt wird. Unser Ansatz kann von entscheidender Bedeutung für die Grundlagenforschung und die Verwendung somatischer Stammzellen für die Therapiedes zentralen Nervensystem von Säugetieren und gleichzeitig ein besseres Verständnis der i) Stammzellen Beitrag zur Gewebebildung während der Entwicklung, ii) Gewebshomöostase im Erwachsenenalter, iii) die Rolle der adulten Neurogenese in der kognitiven Funktionen, und vielleicht, iv) besser mit somatischen Stammzellen Zellen in Modellen von neurodegenerativen Erkrankungen.

Protocol

Vorbemerkung

Operation muss von ausgebildeten Ermittlern nach Genehmigung der lokalen Behörden für den Tierschutz durchgeführt werden. Müssen alle erforderlichen Vorkehrungen getroffen, um die Schmerzen und Stress zugefügt, um das Tier, einschließlich tiefe Narkose, Verwaltung der postoperativen Analgesie und für Maßnahmen, die länger als 10 min, Anwendung eines Auges Schmiermittel Hornhaut Austrocknung und Erblindung verhindern zu minimieren. Narkotisierten Mäusen müssen ständig warmen bei 37 ° C bis zur vollständigen Genesung und jeder chirurgische Werkzeug und Lösung müssen steril sein. Obwohl die Verwendung eines biologischen Haube ist nicht unbedingt notwendig, muss der Betreiber alle zumutbaren Vorkehrungen treffen, um die Möglichkeit einer Infektion des Tieres während des Betriebs durch das Tragen eines Laborkittel, Maske und Handschuhe zu minimieren. Ebenso muss jeder Schritt über die Erzeugung und Verwendung von Viren zugelassen und müssen in S2 Gebiete gemäß den Vorschriften der örtlichen Behörden erfolgen.Schließlich muss eine gründliche Dekontamination aller Werkzeuge und Oberflächen, die in Kontakt mit Viren gewesen sein könnte nach anerkannten Einrichtung zu Praktiken (HIV durch Abreiben mit 70% Et-OH und / oder Autoklavieren) durchgeführt werden.

Teil 1: Erweiterung der embryonalen NSC

1. In utero Elektroporation

  1. Nach Klonierung die Transgene (dh cdk4/cyclinD1) in PCM-EGFP (Clontech) oder PDSV-mRFPnls Vektoren 16, reinige die Plasmide unter Verwendung EndoFree Kit und resuspendieren in steriler PBS auf eine Konzentration von 3-5 ug / ul. Bald vor der Operation, mischen die Plasmide mit 0,05% FastGreen in PBS bei einem Endverhältnis von ca. 04.04.01 und zentrifugieren der Mischung für 2 min bei 16.000 × g zur Entfernung aller Präzipitate.
  2. Legen Sie das DNA-Gemisch wird in eine zuvor gezogen Borosilikatglas Kapillare. Pulling Parameter mit einem P-97 Pipette Puller sind: Zug: 200; vel: 140; Zeit: 140. Wärme wird durch eine Rampe Test gegeben und hängt von der specific viele Kapillaren verwendet. Montieren Sie die Kapillare an der Düse des PicoPump, die nahe an die in utero Elektroporation Plattform (Abbildung 1A) und unter einem Stereomikroskop, biegen seiner Spitze und nick es am Wendepunkt.
  3. Sterilisieren alle Operationen an einem trockenen Glasperlen Sterilisator und tief betäuben eine schwangere Maus am Tag 12-15 der Trächtigkeit mit einem Isofluran Verdampfer. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf einer Heizplatte bei 37 ° C eingestellt und halten ständig unter Isofluran Verwaltung über eine Bugspitze.
  4. Rasur die Haut des Bauches, mit Betaisodona mehrfach desinfiziert und schließlich wischte zwischen mit 70% Ethanol, und injizieren Buprenorphin (verdünnt in PBS) subkutan mit 0,1 mg / kg Konzentration als Präventivschlag Analgetikum. Verwendung einer feinen Schere, einen 2 cm Längsschnitt der Haut und in der Folge des zugrundeliegenden muskulären Wand, um die Bauchhöhle zu übersetzen. Verzichten in der Peritonealhöhle ca. 2ml IUE Lösung (D-PBS mit 100 U / ml Penicillin / Streptomycin) vorgewärmt auf 37 ° C und die Lösung auf einem Heizblock.
  5. Decken Sie die Maus mit sterilen drap mit einem Riss, aus dem die Uteri entfernt werden. Ziehen Sie den Schnitt mit einem Wolfram-Retraktor identifizieren die Gebärmutter und ziehen Sie ihn heraus hielt sie mit einer Pinzette zwischen benachbarten Embryonen (Abbildung 1B; links) und schließlich lag es auf der sterilen drap. Während der gesamten Operation, spülen Sie die Gebärmutter mit IUE Lösung, um die Orgel und Körperhöhle befeuchten und verhindern Austrocknung des Tieres.
  6. Behandeln Sie die Gebärmutter vorsichtig hielt sie zwischen Daumen und Zeigefinger und drehen ein Embryo bis ihr Kopf ist sichtbar und orientiert sich an der Betreiber. Identifizieren der telencephalen Halbkugeln und Injizieren eines von ihnen aus dem dorsolaterale Seite. Lassen Sie 1-2 ul der DNA-Lösung mit dem Fußschalter eines PicoPump bis die Ventrikel FastGreen (Abbildung 1B, rechts) erläutert wird.
  7. (1C) und liefern 6 Impulse von 30 V für 50 ms mit 950 ms-Intervall zwischen jedem Impuls mittels eines Elektroporators Erzeugen quadratischen elektrischen Feldern betrieben durch einen Fußschalter. Vermeiden die Elektroden mit der Plazenta zu schließen, da dies zur Beschädigung der Hämorrhagie und Embryos führen kann.
  8. Wenn alle Embryonen injiziert werden und elektroporiert, legen die Gebärmutter wieder in die Bauchhöhle und schließen Sie die muskulösen Wände mit einer Naht String Nähen alle 3-4 mm. Die Knoten sollten auf den Muskel eng anliegen, aber nicht zu eng, um ein wenig Schwellung des Gewebes ermöglichen. Schließlich schließen die darüber liegende Haut mit Metallklammern. Desinfizieren Sie die Haut mit Betaisodona, entfernen Sie die Maus aus der Isofluran-Maske und übertragen sie in einem Gehäuse Käfig, wenn hellwach. Überwachen Sie die Erholung der Maus, bis Bewegungsapparates Verhalten ist normal.

2. Die Verarbeitung des samspiel

  1. Ein oder mehrere Tage nach der Elektroporation, opfern die Maus, sammeln die Embryonen und diejenigen identifizieren, richtig elektroporiert mit einem fluoreszierenden Stereomikroskop (1D). Sezieren die Gehirne auf eiskaltem PBS, und befestigen Sie sie über Nacht in 4% PFA (Paraformaldehyd in Phosphatpuffer pH 7,4). Schließlich kann BrdU vor der Tötung nach verschiedenen Paradigmen verabreicht werden, um Zellzykluskinetik und Zellproliferation 3 untersuchen.
  2. Die Gehirne werden dann zum Schneiden und Immunfärbung für die mehreren Marker der radialen Gliazellen, basale Vorläuferzellen und Neuronen (Pax6, Nestin, tbr2, Tbr1, Tuj1 usw.), um die Wirkung der funktionellen Transgenen auf gezielte NSC und deren Nachkommen, die auszuwerten sind verarbeiteten identifiziert durch die Expression des Co-elektroporierten Reportergens.

Abbildung 1
Abbildung 1.In utero Elektroporation. (A) Schematische Darstellung eines in utero Elektroporation Plattform. (B) Die Zeichnungen, die die Positionierung der schwangeren Maus während der Operation (rechts) und Injektion der DNA / FastGreen Mischung (blau) in der Halbkugel telencephalen einer Maus Embryo (links). (C) Schematische Darstellung der Anordnung der Elektroden in Kontakt mit der Uteruswand mit der Anode (+) benachbart zu der Injektionsstelle (blau). Pfeile zeigen die Wanderung der DNA zur Anode. (D) Bild von einer Maus-Embryo 24 Stunden nach Elektroporation mit GFP Plasmide an embryonalen Tag 13. Eine gestrichelte Linie grenzt die telencephalen Hemisphäre. Schema in einer modifizierten aus Calegari et al., 2004 17.

Teil 2: Expansion of Adult NSC

Ein. Produktion von HIV-abgeleiteten Viruspartikel

  1. Tag 1: Platte 5 x 10 6 293T-Zellen auf einer 10 cmSchale mit 8 ml D-MEM, enthaltend 10% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum und 100 U / ml Penicillin / Streptomycin (Kulturmedium). Verwenden Sie 15 Gerichte für ein Viruspräparats und Kultur über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2.
  2. Tag 2: Zu jeder Schüssel, in 1 ml Ebene D-MEM 5 ug von jeder der drei Plasmide, die für i verdünnen) VSVG (Vesicular Stomatitis Virus Typ G) Hüllprotein, ii) gag / pol (gruppenspezifische Antigen / Polymerase) und iii) eine polycistronische Konstrukt exprimiert die funktionellen und Reporter-Transgenen (dh cdk4/cyclinD1/GFP) zuvor in einem HIV-basierten Transfer-Vektor (p6NST90) 9 kloniert. Mischen dieser Lösung mit 1 ml D-MEM mit 45 ul von Polyethylenimin, die vorher gelöst wurde in PBS auf 1 mg / ml Stammlösung, und Inkubation für 15-30 min bei Raumtemperatur. In der Zwischenzeit, entfernen Sie die Medien aus den Zellen und 4 ml pro Schale von frischen D-MEM mit 15% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum und 100 U / ml Penicillin / Streptomycin. Fügen Sie die 2 ml Transfektionsgemisch und Kultur über Nacht.
  3. Tag 3: add 120 ul 500 mM pro Gericht, um die Expression der Transgene zu verbessern Na-Butyrat, vorsichtig mischen und Kultur für 6-8 Stunden nach dem die Transfektion Medium mit 5 ml Kulturmedium ersetzen.
  4. Tag 4: sammeln die Überstände (ca. 70 ml insgesamt), durch einen 0,22 um Filter und Transfer in 2 Polyallomer Zentrifugenröhrchen (35 x 89 mm) passieren. Ultrazentrifuge bei 110,000 × g für 90 min bei 4 ° C unter Verwendung einer Schaukel Rotors. Überstand verwerfen, 6 ml PBS in jedes Röhrchen pipettieren und auf Eis für 1 Stunde. Das Pellet und übertragen sie in ein Polyallomer Zentrifugenröhrchen (14 x 95 mm). Ultrazentrifuge bei 110,000 × g für 90 min bei 4 ° C unter Verwendung einer Schaukel Rotors. Überstand verwerfen, das Pellet in 50 ul PBS, machen 5 ul Aliquots und bei -80 ° C. Virustiter wird in dem Bereich von 10 8 -10 9 KBE / ml betragen. (Hinweis: Viren sind sehr temperaturempfindlich und Lagerung, avoid re-Gefrieren, auf Trockeneis zu halten während des Transports und auftauen kurz vor Gebrauch.)

2. Stereotaktische Injektion

  1. Anesthetize einen 6-10 Wochen alten Maus mit Isofluran und legen Sie das Tier in Bauchlage auf einem stereotaktischen Rahmen (2A) mit den Ohren Bars und den Gaumen Unterstützung richtig fix den Kopf. Das Tier wird warm gehalten auf einem Heizkissen bei 37 ° C und unter ständiger Isofluran-Administration festgelegt.
  2. Inject subkutan 100 ul von Buprenorphin Gebrauchslösung wie präventive analgetische, rasieren einen Streifen Haut auf dem Kopf der Maus, und desinfizieren wie unter 1.4 beschrieben. Mit einem Skalpell eine ca. 1,5 cm lange longitudinale Einschnitt auf der Kopfhaut Aussetzen des Schädels auf der Ebene der Sagittalnaht. Fahren Sie die Haut auftragen und sanft reinigen Knochenoberfläche mit einem sterilen Wattestäbchen.
  3. Half-füllen eine Glaskapillare (Angaben in 1,2) mit Paraffinöl und klebe sie auf der Einspritzpumpe Einsetzendie Kapillare, bis der zweite Ring (Abb. 2B). Bewegen des Kapillarhalters in der x, y und z-Achse, bis die Spitze der Kapillare auf dem Bregma, die Verbindung zwischen der sagittalen und seitliche Nähte (2C) (mit Hilfe eines Stereomikroskops bestimmt werden kann) positioniert ist, und Reset-x, y und z Werte auf 0.
  4. Bewegen der Kapillare um ± 1,6 mm in der medio-lateralen Achse (x) und -1,9 mm in der anterior-posterioren-Achse (y) und markieren den Knochen unter Verwendung eines chirurgischen Marker. Machen Sie ein Loch von ca. 0,5 mm Durchmesser auf dem Schädel mit einem elektrischen Bohrer Aufmerksamkeit nicht auf das Gehirn schädigen.
  5. Setz einen 5 ul Tröpfchens von viralen Suspension (1 Aliquot) auf ein Stück Parafilm auf den Balken gelegt und Ohr tauchen die Spitze der Kapillare in dem Tröpfchen. Saugen ca. 3,5 ul Virussuspension mit einem Nanoliter Injektor eingestellt bei 55 nl / sec. Führen Sie diesen Schritt schnell wie der Tropfen verdampft.
  6. Bewegen Sie die Kapillare auf die Website of Einspritzung und bewegen Sie ihn nach unten, bis die Spitze berührt die Pia-Oberfläche. Setzen Sie den dorso-ventralen Achse (z) auf 0 gesetzt. Zu diesem Zeitpunkt in das Gewebe eindringen mit der Kapillare zur -1,9 mm und freizugeben 1,5 ul viralen Suspension mit einer Geschwindigkeit von 4 nl / sec. Warten für 2-3 Minuten, um den Rückfluss von Virussuspension Trog die Kapillarspur minimieren und dann zurückziehen Kapillare. Eine zweite Injektion können in der kontralateralen Halbkugel ausgeführt werden.
  7. Naht der Haut, desinfizieren, und lassen Sie das Tier aus der Narkose wieder wie zuvor in utero Elektroporation (1,8) beschrieben.

Abbildung 2
Abbildung 2. Stereotaxischen viralen Injektion. (A und B) Schematische Darstellung der Komponenten benötigt wird, um stereotaktische Injektion (A) und eine demontierte Kapillarhalter zeigt das Einsetzen eines ca. durchzuführenpillary bis der zweite Ring (B). (C) Bild von der Maus Kopf durch das Ohr Bars und Gaumen Unterstützung mit der Haut immobilisiert geschnitten, um den Schädel (links) auszusetzen. Die Vergrößerung des gestrichelten Kasten (rechts) zeigt die laterale und sagittalen Nahtmaterial, das Bregma und die Injektionsstelle (Kreis).

3. Verarbeitung der Probe

  1. Ein bis drei Wochen nach der Infektion, versorgen die Maus mit ca. 100 ml 4% PFA, sezieren das Gehirn und das Post-fix über Nacht in 4% PFA. Schließlich kann BrdU und / oder Tamoxifen vor der Tötung nach unterschiedlichen Paradigmen verabreicht werden, um Zellzykluskinetik untersuchen und die Expression der viralen Transgenen von loxP-Stellen flankierten Stop bzw. 9.
  2. Das Gehirn kann dann zur Immunfärbung unter Verwendung mehrerer Marker von Stamm-und Vorläuferzellen und Neuronen (zB Sox2, GFAP, Nestin, tbr2, Doublecortin usw.) verarbeitet werden.

Representative Results

  1. Insgesamt ergibt Elektroporation in utero 60-80% der elektroporierten Embryonen Anzeigen starke Expression des Reportergens in einem weiten Bereich des seitlichen Kortex (Abbildung 3A). Fluoreszierende Proteine ​​kann leicht auf whole mount Embryonen sobald 3-6 Stunden nach der Operation werden mit dem Signal einer Dauer von mehr als einer Woche erfaßt. Innerhalb der Zielregion, ungefähr 30-50% der Zellen in der Regel das Transgen exprimieren (n) mit dem Anteil an Zellen Co-Expression von zwei (oder mehr) mit-elektroporierten Transgene wobei üblicherweise oberhalb 90% (3B, links) 6,8 , 15. Während ein minimales Niveau der Apoptose (ca. 2,0-2,5%) nach ca. 2 Stunden von Elektroporation beobachtet werden konnte, wird dieser Wert auf physiologische Werte (ca. 0,5-1,0%) nach ca. 6 Stunden (FC, unveröffentlichte Daten) zurück. Der Anteil von Embryonen oder trächtigen Mäusen sterbenden aufgrund der Operation ist typischerweise sehr gering (<5%). Co-Elektroporation mit cdk4/cyclinD1 unter diesen Bedingungen, gefolgt von 48 Stunden Entwicklung löst eine Zunahme der Dehnung von neuralen Vorläuferzellen um 30% (3B, rechts, und C) 15.

Abbildung 3
Abbildung 3. Ausbau der neuralen Vorläuferzellen durch cdk4/cyclinD1 Überexpression. (A) Fluoreszenz-Bild eines Schnittes durch die laterale Kortex eines Mausembryo 24 Stunden nach Elektroporation mit GFP und RFP Plasmide an embryonalen Tag 13. (B) Fluorescent Bilder wie in einem 48 Stunden nach Ko-Elektroporation mit cdk4/GFP und cyclinD1/RFP Plasmide und Immunomarkierung für den basalen Vorläuferzellen Marker tbr2. Fluorescent Reporter mit DAPI counterstainig (links) und tbr2 (rechts) dargestellt. Linien zeigt die apikale Oberfläche der ventrikulären Zone (VZ; weiße Linie) und die Grenzen des subventrikulären Zone (SVZ, gelb gestrichelte Linien). Beachten Sie die erhöhten thickness des SVZ im elektroporierten Abschnitt des Cortex (weiße Pfeile) aufgrund einer erhöhten Erzeugung und Expansion von basalen Vorläuferzellen nach Überexpression cdk4/cyclinD1. P <0,05;, n = 3 (c) Quantifizierung des Effekts in B. Bars = SD gezeigt. Balkendiagramm in C von Lange et al., 2009 15 übernommen.

  1. Nach viralen stereotaktische Injektion, ca. 80% der Mäuse zeigen betätigten starke Expression der Transgene in der gesamten Gyrus dentatus. Konstitutive Expression von GFP können leicht auf 40 um Abschnitte sobald von 4 Tagen nach der Operation festgestellt. Entlang der rostralen Beträge kaudalen Achse des Gyrus dentatus, etwa 10-30% der Zellen (entspricht einer Gesamtausbeute von ca.. 10.000-30.000 Zellen) exprimieren das Transgen Regel (n) (4A) 9. Der Anteil von Mäusen sterben infolge der Operation ist vernachlässigbar (<5%). Drei Wochen Überexpression von cdk4/cyclinD1 unter diesen Bedingungen löst eine Erhöhung der NSC um mehr als zwei-Falten (4B), während abnehmende Neurogenese um 70% (4C) 9.

Abbildung 4
Abbildung 4. Wirkungen von Virusinfektion. (A) 3D-Rekonstruktion von 7 Fluoreszenzaufnahmen von 40 um dicke seriellen Kranzschnitte (1 Sammeln jedes 6) entlang der rostralen-zu-Schwanz-Achse des Hippocampus entnommen. GFP + infizierten Zellen (grün) und DAPI Kernfärbung (blau) des Gyrus dentatus dargestellt (oben). Hellfeld Bilder der Kranzschnitte entsprechend denen in A (Mitte) und 3D-Darstellung (unten) des gesamten Gehirnhälfte mit dem Hippocampus in grün Falschfarbe (aus dem Allen Brain Atlas modifiziert; hervorgehoben dargestellt www.brain-map.org ) . Weiße Pfeile zeigen die Injektionsstelle. Laterale (L), rostralen (R) und dorsal (D) Achsen (x, y, und z stereotaktischen Koordinaten) sind angegeben (rechts). (B und C) Anteil der Nestin + NSC (B) und DCX + neugeborenen Neuronen (C) innerhalb der Population GFP + infizierten Zellen 3 Wochen nach stereotaktische Injektion von GFP (weiß) oder cdk4/cyclinD1/GFP (schwarz) Viren. Bars = SD, p <0,005; n = 3. Graphs in B und C aus Artegiani et al., 2011 übernommen.

Discussion

Ein entscheidender Schritt in utero Elektroporation ist die Qualität und Reinheit der DNA seit seiner gerichtete Migration während der Lieferung der elektrischen Felder hängt seine Ladung. Protokolle für DNA-Reinigung, die keine Entfernung der zusätzlichen geladenen Molekülen wie Endotoxinen, kann auf die Maskierung der natürlichen DNA negativen Ladungen was zu schlechter Lieferung führen. Klar ist, dass die Berührung der Uteruswand mit den Elektroden möglichst nahe zu dem Bereich gezielt zu verbessern Elektroporationseffizienz. Ebenso wichtig ist die Qualität der verwendeten Elektroden, da dies grundlegend für die Lieferung der optimale elektrische Felder. Mikrokratzer nicht sogar mit bloßem Auge sichtbar und / oder organische Reste, wie Spuren von Serum, Lipide, und so weiter, wird unweigerlich Laufe der Zeit ansammeln, was zu Elektroden verliert ihre Eigenschaften. Alt und / oder verschmutzte electropes sind die wahrscheinlichste Ursache für einen plötzlichen Abfall bei der Elektroporation Effizienz und damit sollte r seineplaced sobald dies bemerkt wird. Während relativ einfach, in utero Elektroporation erfordert in der Regel ein paar Wochen Training, um zufrieden und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Diese Technik ist sehr vielseitig, da sie angewendet, praktisch ist, um alle Organe und Gewebe des sich entwickelnden Embryos. Sicherlich sind Organe enthält einen Hohlraum, wie Gehirn, besonders einfach zu richten und damit für einen hohen Anteil an transfizierten Zellen auf Grund der Leichtigkeit des Einspritzens ein relativ großes Volumen von DNA.

Ein häufiges Problem bei der Einrichtung stereotaxischen viralen Injektion auftritt, ist auf wenige infizierte Zellen und / oder zu einer unerwünschten Bereichen auszurichten. Das erste Problem wird hauptsächlich mit der Injektion von niedrigem Titer Viren korreliert. 293T-Zellen mit geringeren Zahl von Passagen in Kultur wachsen schneller und führen zu höheren Virustiter. Verwendung von Zellen älter als ca. 20 Passagen wird nicht empfohlen, und Mittel der Transfektion mit weniger als 80% Wirkungsgrad nicht gewährleisten eine gutevirale Produktion. Resuspension des viralen Pellet ist auch kritisch, hat die virale Suspension homogen und virale Klumpen, verschließen die Kapillare müssen vermieden werden könnte erscheinen. Viren sind sehr temperaturempfindlich Tropfen und Langzeitlagerung. Aus diesen Gründen müssen Aliquots dauerhaft bei -80 ° C gelagert werden und kann nicht wieder eingefroren werden. Auch unter diesen Bedingungen konnte eine Abnahme der Infektivität nach 6-12 Monaten Lagerung beachtet werden. In den Lernphasen, empfehlen wir, um das virale Titer von jedem Viruspräparats zu testen und es wieder tun nach längerer Lagerung. Die Anwesenheit von infizierten Zellen in unerwünschte Bereiche des Gehirns auf eine suboptimale Positionierung der Maus Kopf auf der stereotaktischen Rahmen, die einige Übung erfordert abhängen. Darüber hinaus ist es wichtig, nicht die Oberfläche des Gehirns beschädigen beim Öffnen der Öffnung an der Schädelbasis, weil sonst wird es nicht möglich sein, die 0 setzen korrekt auf der Pia-Oberfläche, was zu einer ungenauen Injektion. Die Koordinatendass wir in diesem Protokoll vorgesehen sind, um C57/BL6 6-10 Wochen alte Weibchen bezeichnet, und wir empfehlen sie bis zur anderen Stamm / Alter / Geschlecht. Erwerb dieser Technik kann mehr Zeit erfordern als in utero Elektroporation aufgrund der längeren Phasen benötigt, um die Viren vorbereitet und die Proben analysieren. Wir empfehlen dringend, dass Viren nur verwendet werden, nachdem der Maus Operation und stereotaktische Injektion geworden zuverlässig und reproduzierbar. Der erste Schritt, um dies zu erreichen ist es, Zell-permeierenden DNA Farbstoffe, wie Hoechst 33342, in Mäuse euthanasiert injizieren und analysieren die Gehirne sofort.

In utero Elektroporation und stereotaktische viralen Injektion sind zwei leistungsstarke Systeme akut und Gewebe gezielt manipulieren Genexpression im ZNS während der Entwicklung von Säugetieren und Erwachsenenalter. Trotz ihrer Begrenzung Targeting nur eine Subpopulation von Zellen, bieten diese Systeme eine beispiellose Geschwindigkeit und Leichtigkeit zu herkömmlichen Methoden verglichen, in insbesondere die umständliche und zeitraubende Generierung von transgenen Mäusen. Doch trotz dieser Ähnlichkeit gibt einige Unterschiede zwischen den beiden Techniken, die erwähnenswert sind. Zuerst in Bezug auf die Ausrichtung der verschiedenen Zelltypen, die in utero Elektroporation führt zunächst zu der Transfektion von Stammzellen ordnungsgemäßen (auch als radiale Gliazellen), weil dies die einzigen Zellen begrenzenden Ventrikels wo die DNA eingespritzt werden. Als Ergebnis der Zellteilungen, wird anschließend von Plasmiden gezielte, Mutter Stammzellen ihre Vorläuferzellen und / oder neuronalen Tochterzellen, die zur Umverteilung der transfizierten Zellen in der Kortex als eine Funktion der Zeit geerbt werden. Im Gegensatz dazu führt die Verwendung von HIV Lentiviren im erwachsenen Gehirn auf die gleichzeitige Infektion von jedem Zelltyp wie Stammzellen, Vorläuferzellen Neuronen sowie reifen Gliazellen. Zu beachten ist, im Hinblick auf die Verwendung von HIV Lentiviren zu häufiger verwendeten Retroviren gegenüberliegenden ist die Tatsache, dass lentivirale Integration würde unabhängig von der mitotischen Zustand der Zellen auftreten, so dass die Targeting auch Erwachsene, ruhenden Stammzellen.

Zweitens ist ein weiterer wichtiger Unterschied zwischen Elektroporation und viralen Infektion, die eine vorübergehende, episomale Expression des früheren erreicht wird, wie zum irreversiblen Integration der DNA in das Genom der infizierten Zellen durch das letztere erreicht entgegengesetzt. Als Ergebnis der aufeinanderfolgenden Zellteilungen Verdünnung der elektroporierten Plasmiden und Abbau des ektopischen CyclinD1 Protein würde an jedem Zellzyklus eintreten. So wurde Ausbau des NSC während der Embryonalentwicklung nur zuletzt für etwa zwei Tage 15 gezeigt, während im erwachsenen Gehirn dieser Effekt wurde festgestellt, dass für mehrere Monate (unveröffentlichte Ergebnisse) dauert.

Drittens, da i cdk4/cyclinD1) hat eine stärkere Wirkung auf Zellen mit einer längeren G1 und ii) gebunden neuralen Vorläuferzellen während der Entwicklung eine längere Zellzyklusals Stammzellen, während das Gegenteil der im Erwachsenenalter wahr, wurden unsere beiden Manipulationen gefunden, um die Expansion, vor allem von neuralen Vorläuferzellen während der Entwicklung und Stammzellen im Erwachsenenalter auslösen. In jedem Fall eine Zunahme der Neuronen wurde von beiden Methoden erreicht.

Viertens viralen Injektion leicht durchgeführt, zuverlässig und reproduzierbar, in vielen unterschiedlichen Bereichen des erwachsenen Gehirn durch einfaches Ändern der stereotaktischen Koordinaten. Im Gegensatz dazu könnte Zielgenauigkeit bestimmter Regionen des zentralen Nervensystems, wie Hirnstamm, Hippokampus, oder Rückenmark durch Elektroporation in utero schwieriger sein, reproduzierbar zu erreichen. Darüber hinaus, während stereotaktische Injektion bei Mäusen jeden Alters durchgeführt werden kann, wird eine optimale Leistung des in utero Elektroporation von etwa E11 bis E16 begrenzt. Stufen vor E11 würde erfordern entweder den Einsatz eines Ultraschall-Backscatter-Mikroskop 18,19 oder eine ganze Embryo kulture-System 17,20.

Vor kurzem hat ein zunehmendes Interesse an grundlegenden zellbiologischen von somatischen Stammzellen gefördert worden, weil ihre Studie und Manipulation gedacht werden, um grundlegend zur Entwicklung neuartiger Zell-basierte regenerative Therapien. Insbesondere für die Überexpression von cdk4/cyclinD1 stellt unser Protokoll die Mittel, um vorübergehend erhöhen die Expansion von NSC in vivo (3B und C und 4B und C), um die Zahl der Neuronen im erwachsenen Gehirn generiert erhöhen. Wir glauben, dass diese Manipulation kann beispielsweise in einer Anzahl von unterschiedlichen Kontexten wichtig zum besseren Verständnis der Rolle der NSC der Entwicklung des Gehirns, der Evolution und Homöostase sowie ihr Beitrag zu kognitiven Funktion oder Erholung von neuronalen Degeneration oder Verletzung.

Disclosures

BA und FC haben eine Patentanmeldung beschreibt die bedingte Ausweitung der adulten somatischen Stammzellen durch cdk4/cyclinD1 Viren (EP 10.160.288,6) eingereicht.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch das Center for Regenerative Therapies, der Medizinischen Fakultät der TU Dresden und dem DFG-Sonderforschungsbereich SFB655 (Teilprojekt A20) unterstützt. BA wurde durch ein Stipendium der DIGS-BB-Programm, Dresden unterstützt. Wir danken Drs. Noriko Osumi, Tadashi Nomura, Dieter Chichung Lie und Ravi Jagasia für wertvolle Ratschläge bei der Einrichtung in utero Elektroporation und stereotaktische viralen Injektion.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Endofree maxi plasmid kit Qiagen 12362
FastGreen Sigma F7258
P-97 Flaming/Brown pipette puller Sutter Instruments
Borosilicate capillaries with filament Sutter Instruments BF120-69-10
Table top laboratory animal anesthesia system VetEquip 901806
Isofluran Baxter HDG9623
Germinator 500 glass bead sterilizer SouthPointe Surgical GRM5-1460
Iris forceps WPI 15917
Betaisodona solution Mundipharma 1931491
Pico Pump WPI PV820
ECM 830 square wave electroporator Harvard Apparatus 450052
Round tweezer electrodes NEPAGENE CUY650P1
Suture material Ethicon V493H
Reflex clip applier for wound closure WPI 500345
Temgesic injection solution Essex Pharma AG
DMEM w/Glutamax-I Invitrogen 31966021
Fetal Bovin Serum Invitrogen 1027016
Penicillin/Streptomicin Gibco 15140
Tissue culture dish Falcon 353003
Polyethylenimine 250 ml Sigma-Aldrich 40872-7
n-Butyric acid, sodium salt Sigma B 5887
Tube, thinwall, polyallomer Beckman 326823 / 331374
Model 900 small animal stereotaxic instrument Kopf Instruments
OPMI pico microscope Zeiss
SYS-Micro4 controller and Nanoliter2000 injector WPI B203MC4
Glass replacement 3.5 nanoliter WPI 4878
SR drill general application Foredam K2272
Antibody Supplier Catalog # Dilution
Doublecortin Santacruz SC8066 1:100
GFAP Chemicon MAB3404 1:500
Nestin BD Biosciences 556309 1:1000
S100β Abcam Ab868 1:1000
Sox2 Millipore AB-5603 1:500
Tbr2 Abcam Ab23345 1:400
Table of antibodies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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