Author Produced

Expansion du embryonnaires et cellules souches neurales adultes par * These authors contributed equally

Neuroscience
 

Summary

Contrôle de l'expansion des cellules souches somatiques est un facteur majeur qui pèse sur leurs études et leur utilisation en thérapie. Ici, nous décrivons un système à contrôler temporellement les cellules souches neurales l'expansion au cours du développement et de l'âge adulte, ce qui peut être utilisé pour augmenter le nombre de neurones générés dans le cerveau de souris.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection. J. Vis. Exp. (68), e4093, doi:10.3791/4093 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cellules souches somatiques peuvent se divisent pour produire des cellules souches supplémentaires (extension) ou des types cellulaires plus différenciés (différenciation), ce qui est fondamental pour la formation des tissus au cours du développement embryonnaire et l'homéostasie tissulaire au cours de l'âge adulte 1. Actuellement, de grands efforts sont investis pour la commande du commutateur de cellules souches somatiques de l'expansion à la différenciation, car cela est considéré comme fondamental pour le développement de nouvelles stratégies de 1,2 médecine régénérative. Cependant, un défi majeur pour l'étude et l'utilisation des cellules souches somatiques, c'est que leur expansion a été très difficile à contrôler.

Ici, nous décrivons un système qui permet le contrôle de souches neurales / cellules progénitrices (mentionné comme NSC) l'expansion dans le cortex embryonnaire de la souris ou l'hippocampe adulte en manipulant l'expression du complexe cdk4/cyclinD1, un régulateur majeur de la phase G1 du cycle cellulaire des cellules souches somatiques et différenciation 3,4. Plus précisément, deux approches différentes sont décrites par laquelle le complexe cdk4/cyclinD1 est surexprimé dans NSC in vivo. En première approche, la surexpression des régulateurs du cycle cellulaire est obtenue en injectant des plasmides codant pour cdk4/cyclinD1 dans la lumière du télencéphale de la souris suivie par électroporation in utero pour les livrer à NSC de la corticale latérale, par conséquent, le déclenchement de l'expression épisomique transgènes 5-8. Par la seconde approche, fortement concentrés VIH virus dérivés sont stéréotaxique injecté dans le gyrus denté de l'hippocampe de souris adultes, ainsi, déclenchant une expression constitutive des régulateurs du cycle cellulaire après intégration de la construction viral dans le génome des cellules infectées 9. Les deux approches, dont les principes de base ont déjà été décrites par des protocoles vidéo 10-14, d'autres ont été ici optimisés pour i) réduire les dommages aux tissus, ii) des portions larges cibles du cerveau très spécifique regions, iii) obtenir un nombre élevé de cellules manipulées à l'intérieur de chaque région, et iv) déclencher des niveaux élevés d'expression de transgènes dans chaque cellule. Surexpression transitoire de transgènes à l'aide des deux méthodes est obtenue par des moyens différents, à savoir en dilution naturelle des plasmides électroporées en raison de la division cellulaire ou le tamoxifène administration en exprimant Cre-NSC infectées par le virus portant cdk4/cyclinD1 flanqué par des sites loxP, respectivement 9,15 .

Ces méthodes fournissent une plate-forme très puissante de façon aiguë et tissu-spécifique de manipuler l'expression de n'importe quel gène dans le cerveau de souris. En particulier, par la manipulation de l'expression du complexe cdk4/cyclinD1, notre système permet le contrôle de l'expansion temporelle NSC et leur passage à la différenciation, donc, en fin de compte l'augmentation du nombre de neurones générés dans le cerveau des mammifères. Notre approche peut être d'une importance capitale pour la recherche fondamentale et l'utilisation de cellules souches somatiques pour la thérapiedu système nerveux central des mammifères, tout en offrant une meilleure compréhension de i) enrayer la contribution à la formation du tissu cellulaire au cours du développement, ii) l'homéostasie tissulaire au cours de l'âge adulte, iii) le rôle de la neurogenèse adulte dans les fonctions cognitives, et peut-être, iv) une meilleure utilisation somatique tige cellules dans des modèles de maladies neurodégénératives.

Protocol

Note préliminaire

La chirurgie doit être réalisée par des enquêteurs formés intégralement sur l'approbation des autorités locales pour le bien-être animal. Toutes les précautions doivent être prises pour minimiser la douleur et le stress infligé aux animaux, y compris une anesthésie profonde, l'administration de l'analgésie postopératoire et, pour les opérations qui durent plus de 10 minutes, l'application d'un lubrifiant oculaire pour prévenir la déshydratation de la cornée et la cécité. Souris anesthésiées doivent être constamment tenus au chaud à 37 ° C jusqu'à la guérison complète et tous les outils chirurgicaux et la solution doit être stérile. Bien que l'utilisation d'une hotte biologique n'est pas strictement nécessaire, l'exploitant doit prendre toutes les précautions raisonnables pour réduire au minimum la possibilité d'infecter l'animal lors de l'opération par le port d'une blouse, un masque et des gants. De même, à chaque étape concernant la production et l'utilisation de virus doit être autorisée et doit être exécuté dans les zones S2 selon les prescriptions des autorités locales.Enfin, une décontamination approfondie de tous les outils et les surfaces qui auraient pu être en contact avec des virus doit être effectuée conformément aux pratiques de désinfection des installations agréées (pour le VIH en les essuyant avec 70% Et-OH et / ou autoclave).

Partie 1: Expansion des embryonnaire NSC

1. Dans électroporation in utero

  1. Après le clonage des transgènes (c.-à cdk4/cyclinD1) dans PCMS-EGFP (Clontech) ou PDSV-mRFPnls vecteurs 16, purifier les plasmides en utilisant Endofree kit et remettre en suspension dans du PBS stérile à une concentration de 3-5 pg / pl. Peu de temps avant la chirurgie, mélanger les plasmides avec 0,05% FastGreen dans du PBS à un ratio final de ca. 04:04:01 et centrifuger le mélange pendant 2 min à 16000 xg pour éliminer tout précipité.
  2. Chargez le mélange d'ADN dans un verre borosilicate déjà tiré capillaire. Tirer les paramètres à l'aide d'une pipette P-97 extracteur sont: traction: 200; vel: 140; durée: 140. La chaleur est donnée par un test de rampe et dépend de la spécificationbeaucoup ific des capillaires utilisés. Montez le capillaire sur le bout de la PicoPump qui est proche de la plate-forme dans électroporation in utero (figure 1A) et, sous un stéréomicroscope, plier sa pointe et nick il au point d'inflexion.
  3. Stériliser tous les outils de chirurgie dans un stérilisateur à billes de verre sec et profondément anesthésier une souris enceinte au jour 12-15 de la gestation à l'aide d'un vaporisateur d'isoflurane. Placez l'animal en décubitus dorsal sur une plate-forme de chauffage réglé à 37 ° C et à l'isoflurane sous administration constante à travers un cône de nez.
  4. Raser la peau de l'abdomen, désinfectez-les avec de multiples fois Betaisodona, éventuellement essuyer entre les deux avec 70% d'éthanol, et injecter la buprénorphine (dilué dans du PBS) par voie sous cutanée à raison de 0,1 mg / kg la concentration en préventive analgésique. L'aide de ciseaux fins, faire une coupe longitudinale 2 cm de la peau et, par la suite, de la paroi musculaire sous-jacent pour accéder à la cavité péritonéale. Verser dans le ca cavité péritonéale. 2ml de solution IUE (D-PBS contenant 100 U / ml de pénicilline / streptomycine) préchauffé à 37 ° C et maintenir la solution sur un bloc chauffant.
  5. Couvrir la souris avec drap stérile contenant une fissure à partir de laquelle l'utérus sera supprimé. Rentrer l'incision à l'aide d'un écarteur de tungstène, d'identifier l'utérus et le sortir en le tenant avec une pince entre les embryons adjacentes (figure 1B, à gauche), et enfin il se coucha sur le drap stérile. Pendant toute l'opération, rincez l'utérus avec une solution IUE pour hydrater la cavité d'organes et du corps et de prévenir la déshydratation de l'animal.
  6. Manipulez soigneusement l'utérus en le tenant entre le pouce et l'index et tourner un embryon jusqu'à sa tête est visible et orienté vers l'opérateur. Identifier les hémisphères télencéphaliques et injecter un d'entre eux du côté dorso-latéral. Relâchez 1-2 pi de la solution d'ADN à l'aide de la pédale d'un PicoPump jusqu'à ce que le ventricule est décrit par FastGreen (figure 1B, à droite).
  7. (figure 1C) et d'offrir 6 impulsions de 30 V pendant 50 ms à 950 ms d'intervalle entre chaque impulsion en utilisant un électroporateur générer de forme carrée champs électriques exploités grâce à une pédale. Éviter de placer les électrodes près de la barrière placentaire, car cela pourrait provoquer une hémorragie et des lésions de l'embryon.
  8. Lorsque tous les embryons sont injectés et électroporation, placez l'utérus dans la cavité abdominale et à proximité des parois musculaires avec une chaîne de suture suturer tous les 3-4 mm. Les nœuds doivent être bien ajustées au muscle mais pas trop serré pour permettre un peu de gonflement des tissus. Enfin, fermez la peau recouvrant l'aide de pinces métalliques. Désinfecter la peau avec Betaisodona, retirez la souris à partir du masque de l'isoflurane et le transférer dans une cage de logement lorsqu'il est complètement éveillé. Surveiller le rétablissement de la souris jusqu'à ce que le comportement locomoteur est normal.

2. Traitement de l'échanexemple

  1. Un ou plusieurs jours après l'électroporation, le sacrifice de la souris, la collecte des embryons et d'identifier ceux correctement électroporation en utilisant un stéréomicroscope fluorescent (figure 1D). Disséquer les cerveaux sur PBS glacé, et les fixer nuit à 4% PFA (paraformaldéhyde dans du tampon phosphate pH 7,4). Finalement, BrdU peut être administré avant le sacrifice selon des paradigmes différents pour étudier la cinétique du cycle cellulaire et 3 prolifération cellulaire.
  2. Les cerveaux sont ensuite traitées pour la coupe et l'immunomarquage pour les plusieurs marqueurs de cellules gliales radiales, les progéniteurs basales et les neurones (Pax6, la nestine, tbr2, TBR1, Tuj1 etc) pour évaluer l'effet des transgènes fonctionnels sur ciblé NSC et leurs descendants qui sont identifiée par l'expression du gène rapporteur co-électroporation.

Figure 1
Figure 1.Électroporation in utero. (A) Représentation schématique d'une plate-forme de électroporation in utero. (B) Les dessins indiquant la position de la souris enceinte pendant la chirurgie (à droite) et l'injection du mélange ADN / FastGreen (bleu) dans l'hémisphère télencéphalique d'un embryon de souris (à gauche). (C) Schéma montrant le placement des électrodes en contact avec les parois de l'utérus avec l'anode (+) adjacent au site d'injection (bleu). Les flèches indiquent la migration de l'ADN vers l'anode. (D) Image d'un embryon de souris 24 heures après l'électroporation avec des plasmides GFP au jour embryonnaire 13. La ligne pointillée délimite l'hémisphère télencéphalique. Un régime en modifiées de Calegari et al., 2004 17.

Partie 2: Expansion des adultes NSC

1. Production de VIH-particules virales issues

  1. Jour 1: plaque de 5 x 10 6 cellules 293T sur un 10 cmplat avec 8 ml de D-MEM contenant 10% de sérum inactivé de la chaleur de veau foetal et 100 U / ml de pénicilline / streptomycine (milieu de culture). Utilisez 15 plats pour une préparation virale et culture d'une nuit à 37 ° C, 5% de CO 2.
  2. Jour 2: pour chaque plat, diluer dans 1 ml de plaine D-MEM 5 ug de chacune des 3 plasmides codant pour i) la protéine VSVG enveloppe (type de virus de la stomatite vésiculaire G), ii) gag / pol (antigène spécifique de groupe / polymérase) et iii) un polycistronique construction exprimant les transgènes et fonctionnels (par exemple reporter cdk4/cyclinD1/GFP) précédemment clonés dans un vecteur de transfert à base de VIH (p6NST90) 9. Mélanger cette solution avec 1 ml de D-MEM contenant 45 ul de polyéthylènimine qui a été préalablement dissous dans du PBS à 1 mg / ml de solution mère, et incuber pendant 15-30 min à température ambiante. Pendant ce temps, retirez le support des cellules et ajouter 4 ml par boîte de frais D-MEM contenant 15% de sérum inactivé chaleur de veau foetal et 100 U / ml de pénicilline / streptomycine. Ajouter au m 2l de mélange de transfection et la nuit de la culture.
  3. Jour 3: ajouter 120 ul de 500 mM de Na-butyrate par plat d'améliorer l'expression des transgènes, mélanger délicatement et la culture pendant 6-8 heures, après quoi remplacer le milieu de transfection avec 5 ml de milieu de culture.
  4. Jour 4: recueillir les surnageants (environ 70 ml au total), passer à travers un filtre de 0,22 um et le transfert en 2 tubes à centrifuger polyallomère (35 x 89 mm). Ultracentrifugeuse à 110.000 xg pendant 90 min à 4 ° C en utilisant un rotor swing. Jeter le surnageant, ajouter 6 ml de PBS dans chaque tube et incuber sur de la glace pendant 1 heure. Reprendre le culot et le transférer dans un tube à centrifuger polyallomère (14 x 95 mm). Ultracentrifugeuse à 110.000 xg pendant 90 min à 4 ° C en utilisant un rotor swing. Jeter le surnageant, resuspendre le culot dans 50 ul de PBS, faire 5 aliquotes et conserver à -80 ° C. Titre viral est de l'ordre de 10 8 -10 9 CFU / ml. (Remarque: les virus sont très sensibles à la température et le stockage, avoIdentifiant re-congélation, garder sur la glace sèche pendant le transport et décongeler rapidement avant de l'utiliser.)

2. Injection stéréotaxique

  1. Anesthésier une souris 6-10 semaines à l'isoflurane et placer l'animal en décubitus ventral sur un cadre stéréotaxique (figure 2A) à l'aide des barres d'oreilles et la bouche d'appui pour bien fixer la tête. L'animal est gardé au chaud sur un coussin chauffant réglé à 37 ° C et sous administration isoflurane constante.
  2. Injecter par voie sous cutanée 100 pl de solution buprénorphine travailler comme analgésique préventif, de se raser une bande de peau sur la tête de la souris, et désinfecter comme décrit en 1.4. Avec un scalpel, faire un ca. 1,5 cm de long incision longitudinale sur la peau du crâne tête d'exposition au niveau de la suture sagittale. Rétracter la peau et nettoyez doucement la surface de l'os avec un coton-tige stérile.
  3. Remplir à moitié un verre capillaire (spécifications 1.2) avec de l'huile de paraffine et le monter sur la pompe d'injection insertionle capillaire jusqu'à la seconde bague (figure 2B). Déplacer le support de tube capillaire dans l'axe x, y et z jusqu'à ce que la pointe du capillaire est positionné sur le bregma, le point de liaison entre les fils de suture sagittale et latérale (figure 2C) (à déterminer à l'aide d'un stéréomicroscope), et re-ensemble x, y, et z de 0.
  4. Déplacer le capillaire de ± 1,6 mm dans l'axe médio-latéral (x) et -1,9 mm dans l'axe antéro-postérieur (y) et marquer l'os à l'aide d'un stylo marqueur chirurgical. Faire un trou d'env. 0,5 mm de diamètre sur le crâne à l'aide d'une perceuse électrique veillant à ne pas endommager le cerveau.
  5. Mettez une goutte de 5 ul de la suspension virale (1 aliquote) sur un morceau de parafilm placé sur les barres d'oreilles et plonger la pointe du capillaire dans la gouttelette. Sucer ca. 3,5 pl de suspension virale à l'aide d'un injecteur nanolitre fixé à 55 nl / sec. Exécutez cette étape rapidement que la goutte s'évapore.
  6. Déplacez le capillaire à l'emplacement oinjection f et vers le bas jusqu'à ce que la pointe touche la surface de la pie-mère. Réinitialiser la valeur de l'axe dorso-ventral (z) à 0. À ce stade, pénétrer dans le tissu avec le capillaire de -1,9 mm et relâchez 1,5 ul de la suspension virale à un taux de 4 nl / sec. Attendre 2-3 minutes pour minimiser le reflux de l'auge suspension virale de la piste capillaire et puis rentrer le capillaire. Une deuxième injection peut être effectuée dans l'hémisphère controlatéral.
  7. Suturer la peau, désinfecter et permettre à l'animal de se remettre de l'anesthésie comme décrit précédemment pour l'électroporation in utero (1,8).

Figure 2
Figure 2. Stéréotaxique injection virale. (A et B) Représentation schématique des composants nécessaires pour effectuer l'injection stéréotaxique (A) et un support démonté capillaire montrant l'insertion d'un capillary jusqu'à ce que le second anneau (B). (C) Image de la tête de la souris immobilisé par les barres d'oreilles et un soutien palais avec la peau coupée à exposer le crâne (à gauche). Le grossissement de la zone en pointillés (à droite) montre les sutures latérales et sagittales, le bregma, et le site d'injection (cercle).

3. Traitement de l'échantillon

  1. Une à trois semaines après l'infection, perfuser la souris avec ca. 100 ml de PFA à 4%, disséquer le cerveau et post-fix it la nuit à 4% PFA. Finalement, BrdU et / ou le tamoxifène peut être administré avant le sacrifice selon des paradigmes différents pour étudier la cinétique du cycle cellulaire et de cesser de l'expression des transgènes viraux flanqués par des sites loxP, respectivement 9.
  2. Le cerveau peut alors être traitée pour immunocoloration en utilisant plusieurs marqueurs de cellules souches et progéniteurs et les neurones (par exemple Sox2, GFAP, la nestine, tbr2, doublecortine, etc.)

Representative Results

  1. Dans l'ensemble, électroporation in utero donne 60-80% des embryons électroporées affichent une forte expression du gène rapporteur dans une vaste zone du cortex latéral (figure 3A). Les protéines fluorescentes peuvent être facilement détectées sur des embryons entiers de montage dès que 3-6 heures après la chirurgie avec le signal d'une durée supérieure à une semaine. Dans la zone ciblée, environ 30-50% des cellules expriment généralement le transgène (s) avec la proportion de cellules co-exprimant les deux (ou plusieurs) co-électroporation transgènes étant généralement supérieure à 90% (figure 3B, à gauche) 6,8 , 15. Même si un niveau minimal de l'apoptose (environ 2,0-2,5%) a pu être observée au bout d'environ 2 heures de l'électroporation, cette valeur sera de retour à des niveaux physiologiques (ca. 0,5-1,0%) après environ 6 heures (FC, données non publiées). La proportion d'embryons ou des souris enceintes meurent à cause de la chirurgie est généralement négligeable (<5%). Co-électroporation avec cdk4/cyclinD1 dans ces conditions suivie par 48 heures de développement déclenche une augmentation de la dilatation de progéniteur neural de 30% (figure 3B, à droite, et C) 15.

Figure 3
Figure 3. L'expansion des progéniteurs neuronaux par cdk4/cyclinD1 surexpression. (A) image de fluorescence d'une coupe à travers la corticale latérale d'un embryon de souris 24 heures après électroporation avec des plasmides GFP et RFP à jour embryonnaire 13. (B) images fluorescentes comme dans un 48 heures après co-électroporation avec des plasmides cdk4/GFP et cyclinD1/RFP et immunomarquage pour le marqueur progéniteur basale tbr2. Rapporteurs fluorescents avec DAPI counterstainig (à gauche) et tbr2 (à droite) sont représentés. Lignes indique la surface apicale de la zone ventriculaire (VZ; ligne blanche) et les limites de la zone sous-ventriculaire (SVZ, jaune lignes pointillées). Notez l'augmentation de thickness de la SVZ dans la partie électroporée du cortex (flèches blanches) en raison d'une production accrue et l'expansion des progéniteurs de base après la surexpression de cdk4/cyclinD1. (C) Quantification de l'effet montré dans les bars B. = SD, p <0,05, n = 3. Graphique à barres dans C est tiré de Lange et al., 2009 15.

  1. Après virale injection stéréotaxique, ca. 80% des souris fonctionnant afficher une forte expression des transgènes dans le gyrus denté entier. L'expression constitutive de la GFP peut être facilement détecté sur 40 sections um dès 4 jours après la chirurgie. Long de l'axe rostro-caudale à du gyrus denté, environ 10-30% des cellules (équivalent à un total d'environ 10.000-30.000. Cellules) en général expriment le transgène (s) (figure 4A) 9. La proportion de souris meurent à cause de la chirurgie est négligeable (<5%). Trois surexpression semaine de cdk4/cyclinD1 dans ces conditions provoque une augmentation de la CSN par plus de deuxplis (figure 4B) tout en diminuant la neurogenèse de 70% (figure 4C) 9.

Figure 4
Figure 4. Effets de l'infection virale. (A) de reconstruction 3D de 7 images de fluorescence prises à partir de 40 um d'épaisseur de série sections coronales (collecte de 1 toutes les 6) le long de l'axe rostro-caudale à de l'hippocampe. GFP + cellules infectées (vert) et DAPI coloration nucléaire (bleu) du gyrus denté sont présentés (en haut). Images en champ clair des coupes coronales correspondant à ceux représentés en A (au milieu) et de la représentation 3D (en bas) de tout l'hémisphère cérébral avec l'hippocampe surligné en vert pseudocouleur (modifié d'après l'Atlas Allen Brain; www.brain-map.org ) . Les flèches blanches pointer du site d'injection. Latérale (L), rostrale (R), et dorsal (D) des axes (x, y, et z les coordonnées stéréotaxiques) sont indiquées (à droite). (B et C) Proportion de la nestine + NSC (B) et DCX + nouveaux neurones (C) au sein de la population de cellules GFP + infectés 3 semaines après l'injection stéréotaxique de la GFP (blanc) ou cdk4/cyclinD1/GFP (noir) virus. Bars = SD, p <0,005, n = 3. Graphiques en B et C proviennent Artegiani et al., 2011.

Discussion

Une étape cruciale pour électroporation in utero est la qualité et la pureté de l'ADN depuis sa migration directionnelle lors de la livraison des champs électriques dépend de sa charge. Les protocoles de purification de l'ADN qui ne comprennent pas l'élimination des autres molécules chargées, tels que les endotoxines, peuvent conduire à l'masquage des charges d'ADN naturels négatifs conduisant à une mauvaise prestation. De toute évidence, toucher les parois utérines avec les électrodes aussi près que possible de la zone à cibler permettra d'améliorer l'efficacité d'électroporation. Tout aussi important est la qualité des électrodes utilisées depuis ce qui est fondamental pour la livraison de champs électriques optimales. Les micro-rayures même pas visibles à l'œil nu et / ou des résidus organiques, tels que des traces de sérum, de lipides, et ainsi de suite, inévitablement s'accumulent avec le temps conduisant à des électrodes perdent leurs propriétés. Electropes anciens et / ou sales sont la cause la plus probable d'une baisse soudaine de l'efficacité d'électroporation et, par conséquent, devrait être replaced dès que cela est remarqué. Bien que relativement simple, électroporation in utero nécessite généralement quelques semaines de formation afin d'atteindre de manière satisfaisante et des résultats reproductibles. Cette technique est très polyvalent car il peut être appliqué, pratiquement, à n'importe quel organe et de tissus de l'embryon en développement. Certes, les organes contenant une cavité, par exemple le cerveau, sont particulièrement faciles à cibler et permettre à une proportion élevée de cellules transfectées en raison de la facilité d'injection d'un volume relativement important de l'ADN.

Un problème fréquemment rencontré dans la mise en place stéréotaxique injection virale est d'avoir quelques cellules infectées et / ou de cibler des zones indésirables. Le premier problème est essentiellement corrélée à l'injection de faible titre de virus. Des cellules 293T avec diminution du nombre de passages en culture se développent plus rapidement et entraîner une hausse des titres viraux. En utilisant des cellules de plus de ca. 20 passages n'est pas recommandée et les moyens de transfection avec moins de 80% d'efficacité ne garantissent pas une bonneproduction virale. Remise en suspension du culot viral est également critique, la suspension virale doit comparaître massifs homogènes et virales qui pourraient obstruer les capillaires doivent être évités. Les virus sont très sensibles aux baisses de température et de stockage à long terme. Pour ces raisons, des aliquotes doivent être stockés de façon permanente à -80 ° C et ne peut pas être recongelé. Même dans ces conditions, une diminution de l'infectiosité a pu être observée après 6-12 mois de stockage. Dans les phases d'apprentissage, nous vous conseillons de tester le titre viral de chaque préparation virale et de le faire à nouveau après un stockage à long terme. La présence de cellules infectées dans les zones indésirables du cerveau peut dépendre d'un positionnement sous-optimale de la tête de la souris sur le cadre stéréotaxique, ce qui nécessite un peu de pratique. En outre, il est essentiel de ne pas endommager la surface du cerveau, tout en ouvrant le trou sur le crâne parce que sinon il ne sera pas possible de réinitialiser le 0 correctement sur la surface de la pie-mère, résultant de l'injection imprécis. Les coordonnéesque nous avons fourni dans ce protocole sont appelés C57/BL6 6-10 femelles semaines et nous vous suggérons de les optimiser pour la souche différente / âge / sexe. L'acquisition de cette technique peut exiger plus de temps que électroporation in utero due aux phases plus nécessaires pour préparer les virus et analyser les échantillons. Nous recommandons fortement que les virus ne sont utilisés après la chirurgie de la souris et injection stéréotaxique sont devenus fiable et reproductible. La première étape pour atteindre cet objectif est d'injecter les colorants ADN de cellules infiltrant, comme Hoechst 33342, chez les souris euthanasiées et d'analyser les cerveaux immédiatement.

Électroporation in utero et stéréotaxique injection virale sont deux systèmes puissants et aux aiguë du tissu-spécifique de manipuler l'expression des gènes dans le SNC au cours du développement chez les mammifères et l'âge adulte. En dépit de leur limitation dans le ciblage seulement une sous-population de cellules, ces systèmes fournissent une vitesse sans précédent et la facilité par rapport à des méthodes plus conventionnelles, in particulier la génération laborieuse et prend du temps de souris transgéniques. Pourtant, malgré cette similitude, il existe plusieurs différences entre les deux techniques qui méritent d'être mentionnées. Tout d'abord, en ce qui concerne le ciblage des différents types de cellules, électroporation in utero conduit d'abord à la transfection de cellules souches appropriées (également appelés cellules gliales radiales) car ce sont les seules cellules délimitant le ventricule où l'ADN est injecté. À la suite de la division cellulaire, les plasmides seront ensuite hérité de cibles, les cellules souches-mères à leur progéniteur et / ou des cellules filles neuronales conduisant à la redistribution des cellules transfectées dans le cortex en fonction du temps. En revanche, l'utilisation de lentivirus VIH dans le cerveau adulte conduit à l'infection simultanée de n'importe quel type de cellules dont les cellules souches, les progéniteurs des neurones, ainsi que les cellules gliales matures. Il convient de noter, en ce qui concerne l'utilisation des lentivirus VIH par opposition aux rétrovirus les plus couramment utilisés sont le faitque l'intégration se produirait lentiviral indépendamment de l'état mitotique de cellules, permettant ainsi le ciblage aussi des adultes, des cellules souches quiescentes.

D'autre part, une autre différence importante entre l'électroporation et l'infection virale est celle d'un transitoire, l'expression épisomique est atteint par le premier par rapport à l'intégration irréversible de l'ADN dans le génome des cellules infectées obtenus par celui-ci. À la suite de divisions cellulaires consécutives, la dilution des plasmides électroporation, et la dégradation des protéines extra-utérine cyclinD1, il s'ensuivrait à chaque cycle cellulaire. Ainsi, l'expansion du NSC au cours du développement embryonnaire a été démontré que pendant environ deux jours 15 tandis que dans le cerveau adulte cet effet a été constaté que dure plusieurs mois (résultats non publiés).

Troisièmement, étant donné i) cdk4/cyclinD1 a un effet sur les cellules ayant une plus longue G1 et ii) commis progéniteurs neuronaux au cours du développement ont un cycle cellulaire plusque les cellules souches alors que l'inverse est vrai à l'âge adulte, nos deux manipulations ont été trouvés pour déclencher l'expansion, principalement, des progéniteurs neuronaux au cours du développement des cellules souches et à l'âge adulte. Dans les deux cas une augmentation de neurones ont été réalisés par les deux méthodes.

Quatrièmement, l'injection virale peut facilement être réalisé, de manière fiable et reproductible, dans de nombreuses régions du cerveau adulte en changeant simplement les coordonnées stéréotaxiques. En revanche, le ciblage précis de certaines régions du système nerveux central, comme le tronc cérébral, la formation hippocampique, ou la moelle épinière, par électroporation in utero peut-être plus difficile à réaliser de façon reproductible. En outre, tandis que l'injection stéréotaxique peut être réalisée sur des souris de tout âge, des performances optimales de électroporation in utero est limitée d'environ E11 à E16. Étapes préalables à E11, il faudrait soit l'utilisation d'un microscope à rétrodiffusion ultrasonore 18,19 ou un culte embryons entierssystème ure 17,20.

Récemment, un intérêt croissant pour la biologie cellulaire fondamentale des cellules souches somatiques a été promu parce que leur étude et la manipulation sont considérées comme fondamentale pour le développement de nouveaux traitements cellulaires régénératives. En particulier pour la surexpression de cdk4/cyclinD1, notre protocole fournit les moyens pour augmenter transitoirement la dilatation de NSC in vivo (figure 3B et 4B et C et C) afin d'augmenter le nombre de neurones générés dans le cerveau adulte. Nous croyons que ces manipulations peuvent être importantes dans un certain nombre de contextes différents afin de mieux comprendre le rôle du CCS dans le développement du cerveau, l'évolution et l'homéostasie, ainsi que leur contribution à la fonction cognitive ou la récupération de la dégénérescence neuronale ou des blessures.

Disclosures

BA et FC ont déposé une demande de brevet décrivant l'expansion conditionnelle des cellules souches somatiques adultes par cdk4/cyclinD1 virus (EP 10160288.6).

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le Centre pour les thérapies régénératrices, de la Faculté de médecine de l'université technique de Dresde, et la DFG Collaborative Research Center SFB655 (A20 sous-projet). BA a été soutenue par une bourse du programme DIGS-BB, Dresde. Nous remercions les Drs. Noriko Osumi, Tadashi Nomura, Dieter Chichung Lie, et Ravi Jagasia pour obtenir des conseils précieux lors de la mise en place d'électroporation in utero et stéréotaxique injection virale.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Endofree maxi plasmid kit Qiagen 12362
FastGreen Sigma F7258
P-97 Flaming/Brown pipette puller Sutter Instruments
Borosilicate capillaries with filament Sutter Instruments BF120-69-10
Table top laboratory animal anesthesia system VetEquip 901806
Isofluran Baxter HDG9623
Germinator 500 glass bead sterilizer SouthPointe Surgical GRM5-1460
Iris forceps WPI 15917
Betaisodona solution Mundipharma 1931491
Pico Pump WPI PV820
ECM 830 square wave electroporator Harvard Apparatus 450052
Round tweezer electrodes NEPAGENE CUY650P1
Suture material Ethicon V493H
Reflex clip applier for wound closure WPI 500345
Temgesic injection solution Essex Pharma AG
DMEM w/Glutamax-I Invitrogen 31966021
Fetal Bovin Serum Invitrogen 1027016
Penicillin/Streptomicin Gibco 15140
Tissue culture dish Falcon 353003
Polyethylenimine 250 ml Sigma-Aldrich 40872-7
n-Butyric acid, sodium salt Sigma B 5887
Tube, thinwall, polyallomer Beckman 326823 / 331374
Model 900 small animal stereotaxic instrument Kopf Instruments
OPMI pico microscope Zeiss
SYS-Micro4 controller and Nanoliter2000 injector WPI B203MC4
Glass replacement 3.5 nanoliter WPI 4878
SR drill general application Foredam K2272
Antibody Supplier Catalog # Dilution
Doublecortin Santacruz SC8066 1:100
GFAP Chemicon MAB3404 1:500
Nestin BD Biosciences 556309 1:1000
S100β Abcam Ab868 1:1000
Sox2 Millipore AB-5603 1:500
Tbr2 Abcam Ab23345 1:400
Table of antibodies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
  2. Lindvall, O., Kokaia, Z. Stem cells for the treatment of neurological disorders. Nature. 441, 1094-1096 (2006).
  3. Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 5, 332-342 (2010).
  4. Lange, C., Calegari, F. Cdks and cyclins link G(1) length and differentiation of embryonic, neural and hematopoietic stem cells. Cell Cycle. 9, 1893-1900 (2010).
  5. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
  6. Inoue, T., Krumlauf, R. An impulse to the brain--using in vivo electroporation. Nat. Neurosci. 4, 1156-1158 (2001).
  7. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 10, 865-872 (2001).
  8. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb. Cortex. Suppl 19 Supp. 120-125 (2009).
  9. Artegiani, B., Lindemann, D., Calegari, F. Overexpression of cdk4 and cyclinD1 triggers greater expansion of neural stem cells in the adult mouse. J. Exp. Med. 208, 937-948 (2011).
  10. Dixit, R., Lu, F., Cantrup, R., Gruenig, N., Langevin, L. M., Kurrasch, D. M. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
  11. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
  12. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
  13. Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors. J. Vis. Exp. (45), e2140 (2010).
  14. Lepousez, G., Alonso, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. M. Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation. J. Vis. Exp. (58), e3380 (2011).
  15. Lange, C., Huttner, W. B., Calegari, F. Cdk4/cyclinD1 overexpression in neural stem cells shortens G1, delays neurogenesis, and promotes the generation and expansion of basal progenitors. Cell Stem Cell. 5, 320-331 (2009).
  16. De Pietri Tonelli, D. Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid. Biotechniques. 41, 727-732 (2006).
  17. Calegari, F., Marzesco, A. M., Kittler, R., Buchholz, F., Huttner, W. B. Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture. Differentiation. 72, 92-102 (2004).
  18. Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
  19. Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5. J. Vis. Exp. (45), e2047 (2010).
  20. Osumi, N., Inoue, T. G. ene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics