קצב העברת נתונים גבוה תא יחיד ו מרובה תאים מיקרו אנקפסולציה

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

שילוב הדור monodisperse טיפה עם סידור אינרציה של תאים וחלקיקים, אנו מתארים שיטה כדי לתמצת המספר הרצוי של תאים או חלקיקים בטיפה אחת בשיעורים kHz. אנחנו מדגימים את יעילות פעמיים העולה על אלו של אנקפסולציה לא מסודרת עבור טיפות יחיד ו פעמיים החלקיקים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lagus, T. P., Edd, J. F. High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation. J. Vis. Exp. (64), e4096, doi:10.3791/4096 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

הפרוטוקולים בסעיף זה מתארים את החומרים והציוד מנוצל במיוחד על מנת לקבל את תוצאות הניסויים שהוצגו. שימו לב ספקים חלופיים כימיקלים וציוד עשוי להיות מנוצל.

1. המכשיר ייצור ליתוגרפיה Soft

תקן טכניקות ליתוגרפיה רך, 21 במספר אשר הוצגו במאמרים קודמים יופיטר, 22 שימשו ליצירת polydimethylsiloxane (PDMS) רשתות מלוכדות microchannel מצעים זכוכית. מלבד ייצור העתק עובש על ידי אמן photolithography SU-8, התהליכים ניתן לבצע מחוץ לחדר נקי או מכסה המנוע נקי, עם זאת, אבק וחלקיקים עדיין צריך להיות ממוזער כדי להשיג תוצאות עקביות.

  1. עיצוב דפוס ערוץ מיקרו כפי שמוצג באיור 1 ב-AutoCAD (Autodesk Inc). מעסיקים יצרנית צד שלישי (Fineline הדמיה בע"מ) להדפיס ברזולוציה גבוהה (50,000 dpi) טרנסparency המסכה על הסרט מיילר או קוורץ שבו ערוצי שקופים על רקע כהה.
  2. צור סיליקון SU-8 עבור דפוס מאסטר photoresist העתק. בקיצור, ספין SU-8 2050 (MicroChem) photoresist שלילית עם סל"ד מומלץ של היצרן על coater ספין כדי ליצור שכבה עבה על 52 מיקרומטר כמה 7.5 ס"מ נקיים או 10 פרוסות סיליקון ס"מ. לאחר לאפות רך, EDGE הסרת חרוז, חשיפה UV דרך מסכה של איש קשר, שלאחר החשיפה לאפות, פיתוח, וחשיפה המבול, למדוד את עובי שכבת בפועל של 8-SU באמצעות profilometer Dektak (Veeco). סרט עובש אמן על החלק התחתון של התבשיל 4 "או 5" פטרי להתכונן דפוס העתק PDMS.
  3. מערבבים PDMS בסיס אלסטומר עם סוכן אלסטומר ריפוי (Dow Corning) ב 10:01 בסיס יחס W / ל לסוכן ריפוי. יוצקים גם מעורב מבשר PDMS על המאסטר סיליקון כדי ליצור שכבה 2-3 מ"מ עובי הסופי. תערובת של בסיס 20 גרם אלסטומר עם סוכן גרם 2 ריפוי מספיק כדי לכסות 4 "פני קוטר.
  4. מניחים את master עובש PDMS ב תא ייבוש ואקום (Jencons) לדה גז PDMS דפוקה. באמצעות ווסת לחץ (קול בן הזוג), לאט לאט להפחית את מד תא לחץ של 0 "כספית ל -27" כספית מעל 20 דקות, כדי למנוע עודף קצף. השאירו המכשיר בתא ואקום ב -27 "כספית במשך 30 דקות או עד בועות אוויר להיעלם.
  5. לשחרר ואקום ולעבור עובש אב PDMS ל 65 מעלות צלזיוס בתנור (Thermo Scientific) לתקופה של ארבע שעות. המכשיר ניתן להשאיר בתנור למשך הלילה כדי לשפר ריפוי.
  6. הסר את ההתקן מהתנור להתקרר. חותכים בזהירות סביב PDMS רקיק עגול בעזרת סכין דיוק לקלף את PDMS. לחתוך את קווי המתאר מכשיר כפי שמוצג באיור 1 עם אזמל.
  7. פונץ fluidic יציאות (3 לכל מכשיר) בשלוש אזורים עגולים שמוצג באיור 1 באמצעות אגרוף ביופסיה. עבור התקן זה, השתמש 0.75 מ"מ קוטר חיצוני אגרוף (האריס).
  8. לדבוק נייר דבק לצד בדוגמת של PDMS וקליפת להסיר כלאבק. כחלופה עלות חיסכון, אך מעשית מנגנוני פלזמה קונבנציונאלי חמצן, 21,22 פלזמה לטפל בצד בדוגמת של PDMS ו 3 נקי "x 1" מיקרוסקופ שקופיות הזכוכית באמצעות יד שנערך במעבדה קורונה treater (אלקטרו טכני מוצרים בע"מ .). 23 שים לב, כי למכשיר יש להשתמש במנדף או מאוורר היטב בשטח עקב הפרשות האוזון, וכל שעונים וטלפונים סלולריים יש לשמור לפחות עשרה מטרים. התאמת הפרשות קורונה להשיג קורונה יציב עם מינימלי מעוררת. לאט לאט לנופף האלקטרודה על 1/4 "מעל פני השטח כל אחד במשך כ 20 שניות ואז מיד להחזיר את המשטחים שטופלו במגע ליצור קשר קבוע וחזק לפני משטחי PDMS לחזור למצב הטבעי שלהם.
  9. מניחים את המכשיר על צלחת מתכת, ומכניסים לתנור קר, להגדיר את התנור ל 120 מעלות, ואופים במשך הלילה כדי להשלים מליטה לחזור PDMS למצב הידרופובי המקורי. 24 במהלך האפייה זה חום גבוה, לאהוא משטח הזכוכית של הערוץ יהיה גם שניתנו הידרופובי בשל בתצהיר של שכבת הידרופובי דקה על זכוכית. לחלופין, ציפוי הידרופובי כגון Aquapel (PPG Industries) ניתן להזריק לתוך השקעים fluidic באמצעות מזרק 1 מ"ל ומחט המזרק. 12 בזהירות אך בתקיפות להזריק Aquapel ואחריו טיהור אוויר לתוך השקעים fluidic בלי לשבור את PDMS לכוס בונד . באגרסיביות לחזור על טיהור אוויר בכל יציאות כניסת ו לשקע תוך מוחה את כל Aquapel עודף על מנת למנוע כל פיקדונות שעלולים לסתום את הערוצים על גבי ייבוש.

2. לדוגמא הכנת

  1. להכין תרבית תאים בהתאם לנהלים שנקבעו עבור סוג שבחרת התא. עבור מכשיר מסוים נעשה שימוש במחקר זה, 8-15 חלקיקים מיקרומטר או תאים צריך במידה מספקת להורות אנקפסולציה. סוגי תאים קטנים יותר או גדול יותר עשויים לדרוש שינוי הממדים של ערוץ התמקדות להשיג עמ 'Re הולם. עבור ליתוצאות ההפגנה thod המוצג במאמר זה, קלקר 9.9 מיקרומטר microspheres (G1000, Thermo Scientific) מנוצלים כמו המחליפים סלולריים.
  2. מכינים את החלקיק מימית או ההשעיה התא באמצעות ערבוב עדין. בעת שימוש תאים או חלקיקי פוליסטירן, שליטה וריכוז חיוני (ראה איור 4) כדי להשיג אנקפסולציה הורה אידיאלי. שימוש בנתונים הקודמים 12 כמדריך, לחשב את התא הרצוי או ריכוז החלקיקים מבוסס על המרווח הרכבת הורה וגודל מיקרו ערוצים כמו: תא אחד או החלקיקים הצפויים לכל אורך המרווח פעמים רכבת התמקדות חתך באזור הערוץ. אם ריכוז המניות (1% w / w) אינה מספקת, להגביר את הריכוז (כאן 1.5% w / w) על ידי בעדינות צנטריפוגה מדגם המניות, הסרת נוזל supernatant, מחדש השעיית חלקיקים על ידי מערבולת ערבוב, או ערבוב עדין בעת השימוש בתאים. הכן נפח מספיק כדי להסביר את עוצמת אוסף הרצוי במשך זמן ריצה הקשורים FLow כוונון.
  3. שני תאים וחלקיקים פוליסטירן יש משקל סגולי גדול מ 1. אמנם לא הפגינו פרוטוקול זה, לטווח הארוך ניסויים שנמשכו בסדר גודל של דקות ארוכות עד שעות, הציפה להתאים את הפתרון על ידי הוספת המומס כגון CaCl 2 עבור חלקיקים או OptiPrep (Sigma-Aldrich) של תאים.
  4. הכן מדגם 10 מ"ל של שלב fluorocarbon רציפה הנפט על ידי ערבוב שמן fluorocarbon FC-40 (3M) ו-PEG PFPE לחסום פעילי שטח קופולימר 25 (2.5% w / w) (RainDance טכנולוגיות) בצינור צנטריפוגות 15 מ"ל. לחלופין, שמן מינרלי אור (כימיקלים PTI התהליך) יכול להיות מנוצל עם פעילי שטח 90 ABIL-EM (2.5% w / w) (Evonik גולדשמידט Corporation).

3. ניסויי ההתקנה

  1. כוח על מיקרוסקופ אופטי הפוכה (Axio אובזרוור, Zeiss) ואת המצלמה במהירות גבוהה (פנטום V310, Vision Research). להתמקד ולבדוק את הערוצים עבור כפכפים ופסולת באופן ידני על ידי הזזת המכשיר אובאמצעות מיקרוסקופ ממונע הבמה. פסולת כמה קטן יכול להיות דחף החוצה כאשר נוזל זורם. עבור פסולת גדולה או כפכפים ברורות, בחר ערוץ אחר במכשיר כמו פסולת בערוץ התמקדות יכול לפגוע משמעותית באיכות ההזמנה. שים לב, כפכפים לעתים קרובות ניתן להסיר תחת זרם על ידי לחיצה היטב על פני השטח PDMS מעל האזור הפגוע עם פינצטה קהים.
  2. חותכים שלושה אורכי צינורות PVC (0.01 "ID/0.03" OD, Tygon) עבור כניסת מימית, כניסת שמן, וכן עודפים אמולסיה. כדי למזער את נפח מת, לחתוך מספיק צינורות להגיע מן משאבות מזרק לשלב את המיקרוסקופ. לחתוך קצוות צינורות בזווית של 45 מעלות כדי להקל על הכניסה לתוך יציאות fluidic.
  3. להשתמש בפינצטה ללחוץ להתאים צינור מסתיים לתוך השקעים fluidic אגרוף בשלב 1 ולאחר מכן הקש להכיל שני 30 בוטה, קצה מד חלד מזרק מחטים פלדה (SmallParts) את הקצוות החופשיים של מימית המתאימה ואת כניסת צינורות נפט (אין צורך דבק) . מניחים את צינורות מוצא אל R פסולתeservoir. צינור זה יהיה מאוחר יותר נכנסו למאגר אוסף.
  4. העבר את המכשיר צינורות המצורפת לשלב את המיקרוסקופ, ליישר, ולהתמקד זרבובית את המכשיר באמצעות המטרה זמין (20x שימש לצורך ניסוי זה). כוונן עבור K hler תאורה והגדרות מיקרוסקופ אחרים כנדרש הקלטה אופטימלית.
  5. מלא את המזרק 1 מ"ל (BD) עם שלב היטב מעורבת מימית ו מזרק 3 מ"ל (BD) עם פתרון הנפט בשלב מוכן בשלב 2. שים לב כי כל מזרקים של כל אמצעי אחסון ניתן להשתמש ויש שנבחרו בקפידה בהתאם לרוץ פעמים הרצויים וצמצום pulsatility כלשהו. הטה 1 המזרק במאונך קפיצי לעבור בועות אוויר לשקע את המזרק. לאט לאט לדכא את הבוכנה עד כדי לדחוף את האוויר עד קצה המזרק. מחזיק את המזרק במאונך, לחבר את המזרקים כדי מחט המזרק בהתאמה המצורפת למכשיר כבר בשלב 3.3. לדכא את הבוכנה של חיל האוויר באמצעות מחט המזרק נפח הנוזל הוא מת עד עמ 'ushed דרך צינורות כמעט למכשיר. מאובטח לעלות את המזרק משאבת מזרק (Nexus 3000, Chemyx) ועוסקים גוש הבוכנה. חזור על קשרים מזרק 2 ו הר משאבת מזרק 2.
  6. הפעל את המשאבה בכל מזרק התוכנית באמצעות פרוטוקולים היצרן של המשאבה. הגדר את ספיקות הראשונים ש שמן = 50 μL / דקה ו-Q aq = 5 μL / דקה לשלב את השמן בשלב מימית, בהתאמה. התחל את המשאבות.
  7. חכו נוזל זה להיכנס למכשיר ולמלא את הערוצים, דוחף את האוויר המת הנותרים. זה עשוי להימשך מספר דקות. אם יש כמות גדולה של אוויר בצינור היניקה, להגדיל באופן זמני את כל קצב הזרימה עד האוויר מסולק. לא להגדיל את ספיקות גבוהות, כך הלחץ גדול להופיע בערוץ, שעלול לכישלון PDMS אל הכוס בונד.
  8. באמצעות ספיקות ראשוניים, לצפות את היווצרות טיפות בכל נחיר (תוצאות המוצג כאן: 20x magnification, מסגרת הדולר 21005 תמונות בשניה, חשיפה 3 μs). להפחית את השדה במצלמה מבט אל הנחיר רק כדי למקסם את המסגרת הדולר ולצמצם את דרישות הזיכרון אם אפשר. לכידת וידאו מדגם ולוודא כי קצב הדגימה הוא מספיק כדי למנוע aliasing.
  9. כדי למנוע הטיסות הללו (ראה איור 2), להתחיל עם ספיקה נמוכה מימיות. לאט לאט להגביר את קצב זרימת מימית לקיים סדר חלקיקים בערוץ פתרון ארוך מימית כמו עליית קצב הזרימה.
  10. אם ריכוז החלקיקים היא נמוכה מכדי לספק רכבות עם מספר קטן יחסית של חלקיקים "נעדר" מדגם לא ציפה בהתאמה, פיזית להטות את משאבת מזרק לכיוון מוצא את המזרק על מנת לספק ליישוב הדרגתית של חלקיקים לכיוון מוצא את המזרק. שיטה זו באה לידי ביטוי בפרוטוקול וידאו. מדי פעם לסובב את המזרק לאורך הציר שלה עשוי גם להפחית התיישבות בלתי רצויה.
  11. לאחר סידור הולם מתרחשת, להתאים את קצב זרימת הנפט לכוון את תדר הדורגודל הטיפות. היקף הירידה הממוצע יכול להיות מחושב לפי שער זרימת מימית חלקי התדר ירידה הדור כפי שנמדד על ידי לכידת וידאו. חוזרת לשנות את שתי ספיקות להשיג שיעורי אנקפסולציה הרצויות ואמצעי אחסון ירידה.
  12. אנקפסולציה הורה יציב פעם הוא אישר, להעביר את צינור מוצא מן המאגר פסולת אל תוך המאגר אוסף או להאכיל אותו למכשיר אחר לבדיקה שלאחר מכן.
  13. קבע את זמן איסוף מבוסס על המספר הרצוי של טיפות ותדירות הדור מחושב.
  14. להקליט את החלק היחסי של טיפות המכילות 0, 1, 2, ..., N חלקיקים לכמת את היעילות באמצעות בין אם הדור ירידה בתוצאות וידאו או pipetting מדגם של תחליב נאסף לבדיקה.

4. נציג תוצאות

תוצאות מוצגים בו גם להשיג שליטה יחיד החלקיקים ומבוקר פעמיים החלקיקים אנקפסולציה (איור 3). על ידי חיתוך קצב הזרימה FC-40 שמן 1/2, חד החלקיקים אנקפסולציה הופך שני החלקיקים אנקפסולציה. לעומת זאת, נוכל הגדילו את קצב הזרימה מימית כדי לספק חלקיקים זרבובית מהר יותר, אבל אנחנו גם לא הגדילו את הסיכון המתפרצת של הנחל מימית. היסטוגרמות באיור 3 מציגים את מספר השבר של חלקיקים בכל ירידה של שני המקרים, יחד עם ההשוואות פואסון לסטטיסטיקה. טיפות מדי פעם עם אפס חלקיקים הם בעיקר בשל חלקיקים "חסרים" ב הרכבות שהוזמנו, ואילו במקרים בהם ישנם חלקיקים כמוס יותר מאשר התוצאה הרצויה מן המקומיים ריכוזים גבוהים של חלקיקים וחלקיקים שלעתים נודדים לעבר אחד משני תפקידים התמקדות אנכיים. שים לב, הציפה התאמה כמתואר בסעיף 2 לא נוצל. במקום זאת, משאבת מזרק היה מוטה באופן פיזי כדי לאפשר יישוב של חלקיקים לכיוון מוצא את המזרק, מה שמוביל לריכוז גבוה של חלקיקים בזמן הריצה.

class = "jove_content"> ריצה הניסוי מדגים את הצורך חלקיק נכונה ריכוזי תאים מוצגת באיור 4. ללא הזמנה מלאה, קבוצות מקומיות של הסדר חלקיקים כמוסות, אבל טיפות רבות ללא חלקיקים. ההיסטוגרמה מראה את היעילות אנקפסולציה ירד אנקפסולציה 2 הרצויה החלקיקים.

איור 1
באיור 1. מכשיר Encapsulation. א) המכשיר כולל עם פתחי הכניסה, לשקע, ואת ערוץ הזמנת רב. גובה המכשיר הוא 52 מיקרומטר ורוחב הערוץ מזמין הוא 27 מיקרומטר. ב) גם מימית וגם פתחי הכניסה הנפט מסננים פסולת גדולות עם פערים בסדר גודל של רוחב הערוץ מזמין עבור תצוגה מוגדלת של כניסת שמן. ג) צפה זרבובית מוגדלת מראה רוחבי שווה של ערוץ 27 מיקרומטר עבור ערוצי מימית, שמן, ואחריו התכווצות זרבובית של 22 מיקרומטר והרחבת הפתאומית לערוץ רחב יותר מיקרומטר 61.שים לב, את מידותיו של המכשיר המוצג כאן אומתו באמצעות profilometer לאחר microfabrication ו שונה במקצת את ממדי נומינליים על המסכה. התמונה האמיתית של הערוץ מזמין ו זרבובית זמינים באינטרנט כמו איור משלימה 1 . קובץ AutoCAD המסכה יש גם כלל באינטרנט כתוספת כתב היד הזה.

איור 2
איור 2. Hysteresis של נוטף המעבר המתפרצת באמצעות מכשיר רחב יותר (80 מיקרומטר רחב x 22 מיקרומטר גבוהה). א) בקצב FC-40 זרם בלתי פוסק שמן = 45 μL / min), יצירת ירידה מתמדת מתרחשת kHz 10 באמצעות שיעור מימית זרימת ש aq = 8 μL / דקה. כמו קצב זרימת מימית הוא גדל לאט עד 10 & MU, L / min, המתפרצת של זרם נוזל מימי מופעל. ב) כאשר קצב זרימת מוחזר μL 8 / דקה הטיסות הללו ממשיך. שים לב, היווצרות ירידה קבועה ניתן הוקמה מחדש על ידי לחיצה קצרה הפסקה משאבת זרימה מימית (להשהות 1 2 אופייני).

איור 3
איור 3. אנקפסולציה יחיד ו פעמיים החלקיקים. היווצרות) Drop עם תא אחד לכל ירידה (Q שמן = 60 μL / דק ', ש aq = 9 μL / min) עם שיעור ירידה של הדור kHz 6.1, גודל ירידה ממוצעת של 24.4 PL, וכמה מתא בודד יעילות לכידת D k = 79.5% ו P K = 83.7% (λ = 0.95) עבור גודל מדגם של n = 517 טיפות ד ו n p = 491 חלקיקים. ב) היווצרות Drop עם שני תאים לכל ירידה מושגת רק על ידי צמצום FC-40 קצב הזרימה נפט ל -30 ש μ L / min. גדולים יותר (39.8 את PL) נוצרות טיפות בשיעור של 3.8 kHz ביעילות 2 תאים לכידת D k = 71.5% ו P K = 79.5% (λ = 1.80) עבור גודל מדגם של n D = 383 טיפות ו-N p = 689 חלקיקים. CD) שתי היסטוגרמות להשוות את אנקפסולציה ירידה החלקיקים יעילות D K של אנקפסולציה יחיד ו פעמיים החלקיקים הורה עם Poisson לסטטיסטיקה (אנקפסולציה אקראית). שים לב שעבור המקרים, מרווח בין החלקיקים לכיוון הזרימה היא כ 17-18 מיקרומטר עבור חלקיקים, הורה באופן מלא לסירוגין. קטעי וידאו משלימים מראה גם אנקפסולציה יחיד ו פעמיים החלקיקים זמינים באופן מקוון. לחץ כאן כדי להציג סרט תוספת 3 א . לחץ כאן כדי להציג סרט תוספת 3 ב .

התחת = "jove_content"> איור 4
ריכוז איור 4. מאוד משפיע על יעילות אנקפסולציה.) כמו ירידה הריכוז, סידור מלא אינו מתרחש, ובכך "חורים" של הרכבות לצאת, לצאת כמה טיפות עם פחות מ חלקיקים צפויים. ב) ההיסטוגרמה מראה את יעילות ירידה ( D k = 55.9%, P k = 70.9%) אנקפסולציה של שני החלקיקים בשל הערך הנמוך של λ = 1.57 שם יש כמעט אותו מספר חלקיק יחיד טיפות כמו שיש פעמיים החלקיקים טיפות. התוצאה היא דמות שמן ש = 30 μL / דקה ו-Q aq = 9 μL / דקה, תנאי הזרימה זהה איור 3 ב. וידאו משלים נציג זמין באינטרנט. לחץ כאן כדי להציג סרט משלימה 4 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

למרות תארים גבוהים יחסית של ההזמנה, לא טיפות כל יכיל את מספר נכון של חלקיקים או תאים. יעילות Encapsulation יכול להיות מחושב על פי מספר התאים או חלקיקים שהפכו הגלום טיפות עם תפוסה הרצוי חלקי המספר הכולל שלהם. נתונים אלה גלם ניתן להשיג גם מן האלגוריתם וידאו אוטומטית במהירות גבוהה או הדמיה מדגם של תחליב אסף. הדבר משול לשבר של חלקיקים P k הגלום ירידה המכיל חלקיקים K ו את החלק היחסי של טיפות D K שיהיה בה חלקיקים יא. מ איור 3, הן יחיד כפול אנקפסולציה יעילות החלקיקים להכות יעילות אנקפסולציה אקראיים על ידי גורם של 2 לצמצם במידה ניכרת את מספר טיפות עם יותר מ המספר הרצוי של חלקיקים איור 4 מדגים את הצורך בריכוז הנכון עבור יעילות גבוהה. כלומר, & lambd ;, פונקציה של ריכוז החלקיקים הן ונפח טיפה, צריך להיות שווה או קרוב למספר התאים הרצויים לכל טיפה על מנת למקסם את החלקיקים בצורה נכונה, כמוס או תאים. לציין כי ריכוז גבוה של חלקיקים או תאים הוא בדרך כלל דבר טוב עבור הזמנת מלא רכבות צפופות נוטים להתפזר לאורך זמן למלא אזורים ריקים בין רכבות. מצד שני, אם ריכוז גבוה מדי, מספר גבוה של חלקיקים עלולה לגרום לחוסר יציבות interfacial כי הטיסות הללו להשרות על הנחיר. במחקרים מסוימים (כגון אנקפסולציה מתא בודד, למשל), זה עשוי להיות יתרון נוסף, כדי למנוע ריבוי תאים טיפות על חשבון מציגה טיפות יותר ריקים מעט, אז λ מעט נמוך יותר יהיה הרצוי. זה היה גם להגיש בקשה מחקרים שמטרתם יחסי הגומלין בין שני תאים או בין התא לבין החלקיקים, שם טיפות יחיד חלקיק או תא יחיד הם נסבלים יותר מאשר טיפות עם 2 או יותר מסוג אחד של תא או חלקיק.

jove_content "> שמירה λ קבוע לאורך זמן הוא קריטי עבור אנקפסולציה עקבי. אסיסטים הציפה תואמים השליטה ארוכת טווח הריכוז על ידי צמצום ההתיישבות של תאים וחלקיקים של המזרק ואת צינורות. עם זאת, הציפה התאמה גם התוצאות צמיגות גבוהה יותר מימית כי ייתכן לדחות הזמנות (וכתוצאה מכך יותר התמקדות בדרישות הערוץ), להגביר את הירידה בלחץ הערוץ, ולשנות את ספיקות הנדרשים לייצור טיפה. תחליף הציפה תואמים להשתמש בניסוי זה היא פיזית להטות את משאבת מזרק כך שקע המזרק הוא הצביע כמעט אנכית כלפי מטה (כדי למזער את ההדבקה של תאים או חלקיקים אל פנים את המזרק). כאן, השתמשנו בקוטר 9.9 מיקרומטר microspheres עם חלק החלקיקים בנפח של 1.3% (כ -25 מיליון חלקיקים לכל מ"ל), אבל השתמשנו הטיית להגדיל את נפח שברים 2% עבור הנתונים המוצגים באיור 3. החלופה השנייה היא לערבב intermitt נוזל מימיתently עם מיסב כדורי סגור נירוסטה (מצופה טפלון לעבודה עם תאים), תוך שימוש במגנט חיצוני קטן. הטיפול הנדרש עם זאת, כדי למנוע לתת נושאות הכדור להתיישב על קצה המזרק שבו הוא עשוי לחסום את הכניסה צינור היניקה. עם זאת, החלופות האלה הן יותר עבודה אינטנסיבית הדיר פחות התאמה הציפה, כך ההתאמה הציפה הוא המתאים ביותר עבור ניסויים בקנה מידה גדול יותר המתרחשים על פני טווחי זמן ארוכים. בזמן הזמנת אינרציה דורש Re גבוהה מחדש p לפעול, כאשר מימית ותזרימי הנפט דחפה מעלה מעלה, יציב מטפטף טיפות פונה המתפרצת 14 (ראה איור 2) והתוצאות אנקפסולציה בלתי מבוקרת. עבור תאים קטנים מ -10 מיקרומטר חלקיקים המשמשים כאן, מידות ערוץ קטנים עשויים להידרש כדי להשיג עמ 'Re מספיק אם ספיקות לא ניתן להגדיל ללא הטיסות הללו. אחת המוזרות של הטיסות הללו במערכות microfluidic היא יכולה להתרחש תופעות hysteresis Which להקשות להפסיק את הטיסות הללו פשוט על ידי הורדת קצב הזרימה מימית פעם אחת היא מתרחשת חזרה לנקודה שבה לא נצפתה. בהתבסס על תוצאות הניסוי, אפשר לפתח נוטף מימדי או לא ממדי המתפרצת מפת זורמים כמו אלה שפותחו בעבר עבור שיתוף זורמים חרירי צירית 14 ו T-צמתים 26-28 עם קווי המתאר נוספים דרג הדור ירידה, תאים לכל טיפה, ו אנקפסולציה יעילות. מפה זו יספק מפת דרכים חזקים ממנו שיעור הדור ירידה ניתן לחזות לחשב λ ובכך לספק קצב זרימת המשוער עבור זרמי מים ושמן מראש.

אמנם לא הפגינו ישירות כאן, הפחתות נוספות זרימת נפט בקצב ש מאלו שהוצגו איור 3 ב היה עוד יותר להגדיל את מספר החלקיקים לכל טיפה עד שלוש, ארבע, וכן הלאה. כדי להשיג חלקיקים יותר לכל טיפה, או שמן ש חייב להקטין או aqueous קצב הזרימה ש א.ק. חייב לגדול. במאמר מוסגר, יש לנו כלל באינטרנט משלים התסריט MATLAB אשר ממדל את יעילות אנקפסולציה של לכידת מספר רב של חלקיקים בטיפות. המשתמש תשומות את המרווח החלקיקים הממוצע ואת סטיית התקן ריווח החלקיקים, אשר מודדת את מידת ההזמנה. לרכבות הורה, סטיית התקן תהיה קטנה. כמו כן, כניסות של משתמשים גודל טיפה הממוצע ושחרר גודל סטיית התקן, המהווה polydispersity גדלים ירידה. עיין בתיעוד בכתב לקבלת מידע נוסף.

כאשר הגברת קצב זרימת מימית או להקטין את קצב זרימת הנפט להגדיל את מספר חלקיקים או תאים לכל טיפה, את הסיכון של עליית הטיסות הללו יציבים כמו שיעורי הזרימה של כל אחד ליד ערכים קיצוניים. כך, המספר המרבי של חלקיקים השגה / תאים לכל טיפהתהיה תלויה בגיאומטריה המכשיר תכונות נוזלים. בהתחשב בריכוז החלקיקים / תא ספיקת נפט, מספר חלקיקי / תאים לכל טיפה מוגבל על ידי גבולות עליונים על ספיקות מימית, אשר חייב להיות גדול מספיק כדי לגרום הזמנת אבל צריך להיות קטן מספיק כדי למנוע יציבה הטיסות הללו (גזירה גבול הלחצים על תאים כדי להבטיח את יכולת הקיום). לחלופין, לאור קצב הזרימה מימית שבה מתרחשת סדר, קצב זרימת הנפט צריך להישאר מספיק גדול מספיק כדי להישאר בשלטון מטפטף.

שים לב הדור ירידה ו מטפטף על הטיסות הללו המעבר רגישים מאוד ריכוז פעילי שטח. ריכוזים גבוהים פעילי שטח להגדיל את צמיגות השמן, שינוי פרמטרים הדור ירידה. במאמר מוסגר, מחסור של חומרים פעילי שטח ביולוגית הנפוצה לשמנים fluorocarbon מהווה אתגר גדול. נכון לעכשיו, ספק אחד מסחרי (RainDance טכנולוגיות) קיים PFPE-PEG פעילי שטח לחסום קופולימר, 25 אך מחקרים מראים בקנה מידה קטן טכניקות סינתזה של מספר קבוצות פעילי שטח כגון PFPE-HEG. 29,30 חלופות כגון שמן מינרלי אור כבר נוצלו ביישומי הדור ביולוגיים ירידה גישה מגוון רחב יותר של חומרים פעילי שטח זמין, 24,31 אך שים לב כי הגידול המלווה צמיגות לעומת שמן fluorocarbon משנה את הדור הפרמטרים טיפה. בסקירה האחרונה 32 מתאר מספר רב של שמנים שפורסמו שלב פעילי שטח רציפה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

י"א הוא ממציא על הפטנט תלויה ועומדת מבוסס על טכנולוגיה מנוצל כתב היד הזה.

Acknowledgements

אנו מודים RainDance טכנולוגיות למדגם של פעילי שטח PFPE-PEG שימוש במחקר זה, ואנו מודים משאבים BioMEMS מרכז (מהמט טונר, מנהל) על תבנית סיליקון פרוסות סיליקון המשמשת ליצירת העתקים PDMS הערוץ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AutoCAD AutoDesk
Transparency Mask Fineline Imaging Inc.
SU-8 Photoresist MicroChem Corp. 2050
Dektak Profilometer Veeco Instruments, Inc.
Petri Dish BD Biosciences 351058
PDMS Silicone Elastomer Kit Dow Corning Sylgard 184, Material Number (240)4019862
Vacuum Desiccator Jencons 250-030
Vacuum Pump Alcatel Vacuum Technology 2010 C2
Vacuum Regulator Cole-Parmer EW-00910-10
Oven Thermo Fisher Scientific, Inc. Lindberg Blue M, OV800F
Biopsy Punch, 0.75 mm Harris Uni-Core 15072
Laboratory Corona Treater Electro-Technic Products Inc. BD-20AC, SKU 12051A
Glass Slides Gold Seal 3010
Aquapel PPG Industries Alternative Strategy
Polystyrene Microspheres, 9.9 μm Thermo Fisher Scientific, Inc. G1000
OptiPrep Sigma-Aldrich D1556 Not Demonstrated
Luer-Lok Syringes BD Biosciences 1 mL: 309628 3 mL: 309585
FC-40 Fluorocarbon Oil 3M Inc. Sigma Aldrich, F9755
PFPE-PEG Fluorosurfactant RainDance Technologies
Light Mineral Oil PTI Process Chemicals 08042-47-5 Alternative Strategy
Mineral Oil Surfactant Evonik Goldschmidt Corporation ABIL EM 90 Alternative Strategy
Tygon PVC Tubing Small Parts, Inc. TGY-010
30 Gauge Luer-Lok Syringe Needle, 1/2" Small Parts, Inc. NE-301PL-C
Inverted Microscope Carl Zeiss Imaging Axio Observer.Z1
High Speed Camera Vision Research Phantom V310
Syringe Pumps (2) Chemyx Inc. Nexus 3000
Silicone Oil Dow Corning 200 fluid, 10 cSt Optional for Emulsion Storage

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zagnoni, M., Lain, G. L. e, Cooper, J. M. Electrocoalescence mechanisms of microdroplets using localized electric fields in microfluidic channels. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 26, 14443-14449 (2010).
  2. Niu, X. Z., Gielen, F., Edel, J. B., deMello, A. J. A microdroplet dilutor for high-throughput screening. Nat. Chem. 3, 437-442 (2011).
  3. Vincent, M. E., Liu, W., Haney, E. B., Ismagilov, R. F. Microfluidic stochastic confinement enhances analysis of rare cells by isolating cells and creating high density environments for control of diffusible signals. Chemical Society reviews. 39, 974-984 (2010).
  4. Huebner, A. Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics. Chemical communications. 1218-1220 (2007).
  5. Love, J. C., Ronan, J. L., Grotenbreg, G. M., van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. A microengraving method for rapid selection of single cells producing antigen-specific antibodies. Nature biotechnology. 24, 703-707 (2006).
  6. Bradshaw, E. M. Concurrent detection of secreted products from human lymphocytes by microengraving: Cytokines and antigen-reactive antibodies. Clin. Immunol. 129, 10-18 (2008).
  7. Liu, W. S., Kim, H. J., Lucchetta, E. M., Du, W. B., Ismagilov, R. F. Isolation, incubation, and parallel functional testing and identification by FISH of rare microbial single-copy cells from multi-species mixtures using the combination of chemistrode and stochastic confinement. Lab on a chip. 9, 2153-2162 (2009).
  8. Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab on a chip. 8, 1265-1272 (2008).
  9. Koster, S. Drop-based microfluidic devices for encapsulation of single cells. Lab on a chip. 8, 1110-1115 (2008).
  10. Kelly, R. T., Page, J. S., Marginean, I., Tang, K., Smith, R. D. Dilution-free analysis from picoliter droplets by nano-electrospray ionization mass spectrometry. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 48, 6832-6835 (2009).
  11. Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biomedical materials. 5, 21001 (2010).
  12. Edd, J. F. Controlled encapsulation of single-cells into monodisperse picolitre drops. Lab on a chip. 8, 1262-1264 (2008).
  13. Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied Physics Letters. 82, 364 (2003).
  14. Utada, A., Fernandez-Nieves, A., Stone, H., Weitz, D. Dripping to Jetting Transitions in Coflowing Liquid Streams. Physical Review Letters. 99, (2007).
  15. Chabert, M., Viovy, J. L. Microfluidic high-throughput encapsulation and hydrodynamic self-sorting of single cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3191-3196 (2008).
  16. Segrí, G., Silberberg, A. Radial Particle Displacements in Poiseuille Flow of Suspensions. Nature. 189, 209-210 (1961).
  17. Carlo, D. D. i Inertial microfluidics. Lab on a chip. 9, 3038-3046 (2009).
  18. Carlo, D. D. i, Edd, J., Humphry, K., Stone, H., Toner, M. Particle Segregation and Dynamics in Confined Flows. Physical Review Letters. 102, (2009).
  19. Humphry, K. J., Kulkarni, P. M., Weitz, D. A., Morris, J. F., Stone, H. A. Axial and lateral particle ordering in finite Reynolds number channel flows. Physics of Fluids. 22, 081703 (2010).
  20. Lee, W., Amini, H., Stone, H. A., Carlo, D. D. i Dynamic self-assembly and control of microfluidic particle crystals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22413 (2010).
  21. Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane. Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).
  22. Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J. Vis. Exp. (8), e319 (2007).
  23. Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a chip. 6, 1548-1549 (2006).
  24. Hatch, A. C. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab on a chip. 3838-3845 (2011).
  25. Holtze, C. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a chip. 8, 1632-1639 (2008).
  26. Garstecki, P., Stone, H., Whitesides, G. Mechanism for Flow-Rate Controlled Breakup in Confined Geometries: A Route to Monodisperse Emulsions. Physical Review Letters. 94, (2005).
  27. Garstecki, P., Fuerstman, M. J., Stone, H. A., Whitesides, G. M. Formation of droplets and bubbles in a microfluidic T-junction-scaling and mechanism of break-up. Lab on a chip. 6, 437-446 (2006).
  28. Nie, Z. Emulsification in a microfluidic flow-focusing device: effect of the viscosities of the liquids. Microfluidics and Nanofluidics. (2008).
  29. Holt, D. J., Payne, R. J., Chow, W. Y., Abell, C. Fluorosurfactants for microdroplets: interfacial tension analysis. Journal of colloid and interface science. 350, 205-211 (2010).
  30. Holt, D. J., Payne, R. J., Abell, C. Synthesis of novel fluorous surfactants for microdroplet stabilisation in fluorous oil streams. Journal of Fluorine Chemistry. 131, 398-407 (2010).
  31. Hatch, A. C., Fisher, J. S., Pentoney, S. L., Yang, D. L., Lee, A. P. Tunable 3D droplet self-assembly for ultra-high-density digital micro-reactor arrays. Lab on a chip. 11, 2509-2517 (2011).
  32. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a chip. 12, 422-433 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics