उच्च Throughput एकल - कक्ष और एकाधिक - कक्ष सूक्ष्म encapsulation

Bioengineering

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Summary

Monodisperse ड्रॉप पीढ़ी कोशिकाओं और कणों के inertial आदेश देने के साथ संयोजन, हम kHz के दर पर एक एक बूंद में कोशिकाओं या कणों के एक वांछित संख्या encapsulate करने के लिए विधि का वर्णन. हम दो बार unordered encapsulation के एकल और डबल कण बूंदों के लिए उन से अधिक क्षमता प्रदर्शित करता है.

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Lagus, T. P., Edd, J. F. High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation. J. Vis. Exp. (64), e4096, doi:10.3791/4096 (2012).

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Abstract

Protocol

प्रोटोकॉल इस अनुभाग में सामग्री और उपकरण विशेष रूप से उपयोग करने के लिए प्रयोगात्मक प्रस्तुत परिणाम प्राप्त करने का वर्णन है. ध्यान दें कि रसायनों और उपकरणों के लिए वैकल्पिक आपूर्तिकर्ताओं का उपयोग किया जा सकता है.

1. युक्ति निर्माण और शीतल लिथोग्राफी

मानक नरम लिथोग्राफी तकनीक 21, एक संख्या है जो की पिछले जौव लेख में चित्रित किया गया है, 22 polydimethylsiloxane (PDMS) microchannel ग्लास substrates के लिए बंधुआ नेटवर्क बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया. SU-8 से photolithography द्वारा मास्टर प्रतिकृति ढालना निर्माण के अलावा, प्रक्रियाओं एक कमरा साफ या स्वच्छ हुड के बाहर प्रदर्शन किया जा सकता है, लेकिन धूल, particulates और अभी भी अनुरूप परिणाम प्राप्त करने के लिए कम से कम किया जाना चाहिए.

  1. डिजाइन एक माइक्रो चैनल पैटर्न के रूप में AutoCAD के (Autodesk इंक) में चित्र 1 में दिखाया गया है. एक तीसरे पक्ष के निर्माता (Fineline इमेजिंग इंक) को रोजगार के लिए एक उच्च संकल्प (50,000 डीपीआई) ट्रांस प्रिंटMylar फिल्म या क्वार्टज जहां चैनलों के एक अंधेरे पृष्ठभूमि पर पारदर्शी हैं पर पारदर्शिता मुखौटा.
  2. सिलिकॉन और प्रतिकृति ढलाई के लिए SU-8 photoresist के मास्टर बनाएँ. संक्षेप में स्पिन, SU-8 2050 (MicroChem) के निर्माता के लिए एक साफ 7.5 सेमी या 10 सेमी सिलिकॉन वफ़र पर 52 माइक्रोन मोटी परत बनाने के स्पिन - coater पर की सिफारिश की आरपीएम के साथ नकारात्मक photoresist. के बाद नरम सेंकना, धार मनका हटाने, एक संपर्क मुखौटा, सेंकना के बाद जोखिम, विकास, बाढ़ और जोखिम, एसयू 8 Dektak profilometer (Veeco है) का उपयोग परत के वास्तविक मोटाई मापने के माध्यम से यूवी जोखिम. एक 4 या 5 "पेट्री डिश के तल पर टेप मास्टर मोल्ड - PDMS प्रतिकृति ढलाई के लिए तैयार करने के लिए.
  3. मिक्स PDMS elastomer के आधार इलास्टोमेर एक 10:1 अनुपात w / w इलाज एजेंट आधार में इलाज एजेंट (डॉव Corning) के साथ. सिलिकॉन मास्टर पर एक 2-3 मिमी अंतिम मोटाई परत बनाने के लिए अच्छी तरह से मिश्रित PDMS अग्रदूत डालो. 2 ग्राम इलाज एजेंट के साथ 20 ग्राम elastomer के आधार का एक मिश्रण के लिए एक 4 "व्यास सतह को कवर करने के लिए पर्याप्त है.
  4. Maste प्लेसr मोल्ड और निर्वात desiccator में PDMS de-गैस uncured PDMS (Jencons). एक दबाव नियामक (कोल परमार) का प्रयोग, धीरे से पारा -27 के लिए पारा 20 मिनट से अधिक 0 से कक्ष पण दबाव अत्यधिक झाग से बचने की कमी. निर्वात चैम्बर में युक्ति -27 "पारा में 30 मिनट या जब तक हवा बुलबुले गायब छोड़ो.
  5. वैक्यूम रिलीज और एक ° चार घंटे की एक न्यूनतम के लिए सी ओवन (थर्मो वैज्ञानिक) 65 मास्टर ढालना और PDMS चाल युक्ति के लिए इलाज को बेहतर बनाने के लिए रातोंरात ओवन में छोड़ा जा सकता है.
  6. युक्ति ओवन से निकालें और शांत करने के लिए अनुमति देते हैं. ध्यान से परिपत्र वफ़र के आसपास PDMS कटौती एक सटीक और PDMS बाहर चाकू छील का उपयोग. युक्ति रूपरेखा कटौती के रूप में एक स्केलपेल के साथ चित्र 1 में दिखाया.
  7. पंच तीन दौर चित्र 1 में दिखाया क्षेत्रों एक बायोप्सी पंच का उपयोग में fluidic बंदरगाहों (प्रति युक्ति तीन). इस उपकरण के लिए एक 0.75 एमएम बाहरी व्यास पंच (हैरिस) का उपयोग करें.
  8. PDMS और छील के नमूनों की ओर स्कॉच टेप का पालन करना किसी भी हटाने केधूल. पारंपरिक ऑक्सीजन प्लाज्मा apparatuses के लिए एक लागत बचत लेकिन व्यवहार्य विकल्प के रूप में, 21,22 प्लाज्मा PDMS और एक साफ 3 "x 1" काँच की खुर्दबीन स्लाइड के नमूनों की ओर एक हाथ से आयोजित प्रयोगशाला प्रभामंडल treater (विद्युत Technic उत्पाद इंक का उपयोग करने का इलाज ). 23 ध्यान दें कि इस डिवाइस एक धूआं डाकू या अच्छी तरह हवादार ओजोन निर्वहन के कारण क्षेत्र में इस्तेमाल किया जाना चाहिए, और सब देखता है और सेल फोन कम से कम दस फीट दूर रखा जाना चाहिए. प्रभामंडल निर्वहन समायोजित करने के लिए न्यूनतम चिन्गारी निकालना के साथ एक स्थिर प्रभामंडल प्राप्त करने के लिए. धीरे धीरे हर सतह से ऊपर 1/4 के बारे में इलेक्ट्रोड की लहर के लगभग 20 सेकंड के लिए और फिर तुरंत संपर्क में इलाज सतहों लाने के लिए एक मजबूत स्थायी बांड फार्म से पहले PDMS सतहों को उनके मूल राज्य के लिए लौटने.
  9. एक धातु की थाली डिवाइस पर रखें, एक शांत ओवन में जगह, 120 डिग्री सेल्सियस के लिए ओवन सेट, और संबंध को पूरा करने और इस उच्च तापमान पाक, टी के दौरान अपने मूल हाइड्रोफोबिक राज्य 24 PDMS लौटने रातोंरात सेंकनावह चैनल के गिलास सतह भी हाइड्रोफोबिक कांच पर एक पतली परत हाइड्रोफोबिक के बयान की वजह से प्रदान की जाएगी. वैकल्पिक रूप से, Aquapel (PPG इंडस्ट्रीज) के रूप में hydrophobic कोटिंग्स fluidic एमएल 1 सिरिंज और एक सिरिंज सुई का उपयोग बंदरगाहों में अंतःक्षिप्त किया जा सकता है 12. ध्यान से लेकिन दृढ़ता से fluidic बंदरगाहों में कांच बंधन PDMS को तोड़ने के बिना हवा मिटाने के बाद Aquapel इंजेक्षन . Inlet और आउटलेट बंदरगाहों पर आक्रामक हवा शुद्ध करना दोहराने जबकि किसी भी अतिरिक्त Aquapel पोंछते क्रम में करने के लिए किसी भी जमा है कि सुखाने पर चैनलों को रोकना कर सकते से बचने के.

2. नमूना तैयार करना

  1. अपने चुने हुए सेल प्रकार के लिए स्थापित की प्रक्रियाओं के लिए एक सेल संस्कृति के अनुसार तैयार करें. इस अध्ययन में इस्तेमाल विशेष डिवाइस के लिए, 8-15 माइक्रोन कणों या कोशिकाओं को पर्याप्त रूप से encapsulation के लिए आदेश देना चाहिए. छोटा या बड़ा सेल प्रकार ध्यान केंद्रित चैनल के आयाम बदलने के लिए पर्याप्त रे पी. प्राप्त करने की आवश्यकता हो सकती है. मेरे लिएthod प्रदर्शन परिणाम इस पत्र में दिखाया, 9.9 माइक्रोन polystyrene microspheres (G1000, थर्मो वैज्ञानिक) सेल surrogates के रूप में उपयोग कर रहे हैं.
  2. जलीय या कोमल मिश्रण के माध्यम से सेल निलंबन कण तैयार. जब कोशिकाओं या polystyrene कणों का उपयोग कर, एकाग्रता नियंत्रण आवश्यक है (देखें चित्रा 4) के लिए आदर्श का आदेश दिया encapsulation के प्राप्त करने के. पिछले 12 एक गाइड के रूप में डेटा का उपयोग करना, इच्छित कक्ष या कण एकाग्रता का आदेश दिया गाड़ी रिक्ति और सूक्ष्म चैनल आकार के आधार पर की गणना के रूप में: एक सेल या उम्मीद अनुदैर्ध्य ट्रेन रिक्ति बार ध्यान केंद्रित चैनल पार के अनुभागीय क्षेत्र में प्रति कण. अगर शेयर एकाग्रता (1% w / w) अपर्याप्त है, धीरे centrifuging स्टॉक नमूना, सतह पर तैरनेवाला तरल निकालने और फिर निलंबित, मिश्रण या और gentler मिश्रण भंवर द्वारा कणों द्वारा एकाग्रता (1.5% w / w) में वृद्धि जब कोशिकाओं का उपयोग. खाते के लिए वांछित संग्रह मात्रा के लिए और रन FL के साथ जुड़े समय के लिए पर्याप्त मात्रा तैयारओउ ट्यूनिंग.
  3. दोनों कोशिकाओं और polystyrene के कणों को एक विशिष्ट एक से अधिक गुरुत्वाकर्षण है. इस प्रोटोकॉल में नहीं दिखा हालांकि, लंबी अवधि के घंटे के लिए कई मिनट के आदेश पर स्थायी प्रयोगों के लिए, उछाल या कणों OptiPrep (सिग्मा Aldrich) कोशिकाओं के लिए के लिए एक 2 CaCl के रूप में इस तरह के घुला हुआ पदार्थ जोड़कर समाधान मैच.
  4. 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में fluorocarbon तेल FC-40 (3) और PFPE खूंटी surfactant ब्लॉक copolymer 25 (2.5% w / w) (Raindance टेक्नोलॉजीज) के मिश्रण से तैयार निरंतर fluorocarbon तेल चरण के 10 एमएल नमूना. वैकल्पिक रूप से, प्रकाश खनिज तेल (पीटीआई प्रक्रिया रसायन) ABIL EM-90 (2.5% w / w) surfactant (Evonik Goldschmidt निगम) के साथ उपयोग किया जा सकता है.

3. प्रयोगात्मक सेटअप

  1. उल्टे ऑप्टिकल (Axio ऑब्जर्वर, Zeiss) खुर्दबीन और उच्च गति कैमरा (प्रेत V310, विजन रिसर्च) पर शक्ति. फोकस और या तो स्वयं युक्ति चलती मोज़री और मलबे के लिए चैनल का निरीक्षण याएक motorized खुर्दबीन मंच का उपयोग करके. कुछ छोटे मलबे से बाहर धकेल दिया जा सकता है जब के माध्यम से तरल बहता है. बड़े मलबे या स्पष्ट मोज़री के लिए, डिवाइस पर एक और चैनल का चयन करने के लिए ध्यान केंद्रित चैनल में मलबे के रूप में गुणवत्ता में काफी आदेश नीचा कर सकते हैं. ध्यान दें कि मोज़री अक्सर PDMS कुंद चिमटी साथ प्रभावित क्षेत्र से ऊपर सतह पर मजबूती से दबाकर कर सकते हैं प्रवाह के तहत हटाया जा.
  2. कट तीन पीवीसी टयूबिंग की लंबाई (0.01 "ID/0.03" आयुध डिपो, Tygon) जलीय प्रवेश के लिए, तेल प्रवेश, और पायस आउटलेट. मृत मात्रा को कम करने के लिए, बस के टयूबिंग सिरिंज पंप से खुर्दबीन मंच तक पहुँचने के लिए पर्याप्त कटौती. एक 45 ° कोण पर टयूबिंग समाप्त होता है कटौती के fluidic बंदरगाहों में प्रविष्टि की सुविधा.
  3. प्रेस करने के लिए फिट ट्यूब fluidic चरण 1 में छिद्रित बंदरगाहों में समाप्त होता है और फिर संबंधित जलीय और तेल प्रवेश ट्यूब (कोई चिपकने वाला आवश्यक) की मुफ्त समाप्त होता है में दो 30 कुंद की नोक गेज स्टेनलेस स्टील सिरिंज सुई (SmallParts) फिट दबाएँ चिमटी का प्रयोग करें . एक बेकार आर में आउटलेट टयूबिंग रखेंeservoir. इस ट्यूब बाद एक संग्रह जलाशय में ले जाया जाएगा.
  4. युक्ति और संलग्न टयूबिंग खुर्दबीन मंच में ले जाएँ, संरेखित, और उपकरण उपलब्ध उद्देश्य (20x इस प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया गया था) का उपयोग नोक पर ध्यान केंद्रित. कश्मीर hler रोशनी और अन्य खुर्दबीन सेटिंग्स के रूप में इष्टतम रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक के लिए समायोजित करें.
  5. अच्छी तरह से मिश्रित जलीय चरण और तेल चरण में चरण 2 में तैयार समाधान के साथ एक 3 एमएल सिरिंज (बी) के साथ एक 1 एमएल सिरिंज (बी) भरें. ध्यान दें कि किसी भी मात्रा की कोई सीरिंज इस्तेमाल किया जा सकता है ध्यान से वांछित रन बार और कोई pulsatility के न्यूनतम पर निर्भर करता है चयनित चाहिए. एक सिरिंज खड़ी झुकाव और सिरिंज के आउटलेट को हवाई बुलबुले को स्थानांतरित करने के लिए झटका है. धीरे धीरे सिरिंज टिप करने के लिए हवा धक्का पर्याप्त गोताख़ोर दबाना. सिरिंज होल्डिंग खड़ी है, पहले से ही 3.3 चरण में डिवाइस से जुड़ी संबंधित सिरिंज सुई सीरिंज कनेक्ट. गोताख़ोर दबाना सिरिंज सुई मृत मात्रा के माध्यम से हवा मजबूर जब तक तरल पदार्थ पी हैलगभग डिवाइस के लिए टयूबिंग के माध्यम से ushed. सुरक्षित रूप से एक सिरिंज पंप (3000 संबंध, Chemyx) सिरिंज माउंट और सवार ब्लॉक संलग्न हैं. दूसरे सिरिंज के लिए कनेक्शन को दोहराएँ और एक दूसरे सिरिंज पंप करने के लिए माउंट.
  6. प्रत्येक सिरिंज पंप और पंप के निर्माता प्रोटोकॉल का उपयोग कर कार्यक्रम पर बिजली. क्यू तेल के लिए प्रारंभिक प्रवाह दरों सेट = 50 μL / मिनट और क्यू aq = 5 / μL तेल चरण और जलीय चरण के लिए मिनट, क्रमशः. पंप प्रारंभ करें.
  7. प्रत्येक तरल पदार्थ के लिए प्रतीक्षा करने के लिए युक्ति दर्ज करें और चैनल को भरने, बाहर शेष मृत हवा धक्का. यह कई मिनट लग सकते हैं. अगर वहाँ प्रवेश टयूबिंग में एक हवा की एक बड़ी राशि है, अस्थायी रूप से प्रत्येक प्रवाह की दर में वृद्धि जब तक हवा निष्कासित कर दिया है. प्रवाह चैनल में इतना अधिक है कि बड़े दबाव होते हैं, संभावित PDMS के लिए ग्लास के बंधन की विफलता के लिए प्रमुख दरों में वृद्धि नहीं.
  8. प्रारंभिक प्रवाह दरों का प्रयोग, नोक पर बूंदों के गठन का निरीक्षण (परिणाम यहाँ दिखाया: 20x magnificatio हैn, फ्रेम दर 21,005 एफपीएस, जोखिम 3 μs). केवल नोक देखने का कैमरा क्षेत्र को कम करने के लिए फ्रेम दर को अधिकतम करने के लिए और स्मृति आवश्यकताओं को कम यदि संभव हो तो. नमूना वीडियो पर कब्जा करने और पुष्टि करते हैं कि नमूना दर अलियासिंग से बचने के लिए पर्याप्त है.
  9. Jetting के (चित्र 2 देखें) से बचने के लिए, कम जलीय प्रवाह की दर के साथ शुरू करते हैं. धीरे जलीय प्रवाह की दर में वृद्धि करने के लिए लंबे समय के प्रवाह की दर बढ़ जाती है के रूप में जलीय समाधान चैनल में कणों के आदेश निरीक्षण.
  10. यदि कण एकाग्रता भी अपेक्षाकृत कुछ "लापता" कणों और नमूना उछाल नहीं मिलान किया गया था के साथ गाड़ियों को उपलब्ध कराने के लिए कम है, शारीरिक रूप से सिरिंज पंप सिरिंज आउटलेट की ओर झुकाव के लिए उपलब्ध कराने, सिरिंज आउटलेट की ओर कणों की क्रमिक बसने. यह विधि वीडियो प्रोटोकॉल में प्रदर्शन किया है. समय - समय पर अपनी धुरी के साथ सिरिंज घूर्णन भी अवांछित बसने को कम कर सकते हैं.
  11. एक बार पर्याप्त आदेश होता है, तेल प्रवाह की दर को समायोजित करने के लिए पीढ़ी आवृत्ति धुन औरबूंदों के आकार. मतलब ड्रॉप मात्रा जलीय प्रवाह ड्रॉप पीढ़ी के रूप में वीडियो पर कब्जा द्वारा मापा आवृत्ति द्वारा विभाजित दर का उपयोग कर की गणना की जा सकती है. Iteratively दोनों प्रवाह दर को समायोजित करने के लिए वांछित encapsulation के दरों में और ड्रॉप मात्रा प्राप्त करने के.
  12. एक बार स्थिर आदेश दिया encapsulation की पुष्टि की है, बेकार जलाशय से एक संग्रह जलाशय में आउटलेट टयूबिंग या ले जाने के बाद परीक्षण के लिए एक और डिवाइस में फ़ीड.
  13. संग्रह की बूँदों की वांछित संख्या और गणना पीढ़ी आवृत्ति के आधार पर समय का निर्धारण करते हैं.
  14. 0, 1, 2, ..., एन कणों से युक्त करने के लिए दक्षता यों या निरीक्षण के लिए एकत्र पायस का एक नमूना pipetting द्वारा या तो ड्रॉप पीढ़ी वीडियो परिणाम का उपयोग बूंदों के अंश रिकार्ड.

4. प्रतिनिधि परिणाम

परिणाम प्रस्तुत कर रहे हैं जो दोनों नियंत्रित एकल कण और नियंत्रित encapsulation के डबल कण (चित्रा 3) को प्राप्त करने. काटने के द्वाराFC-40 तेल आधे में प्रवाह दर, एकल कण encapsulation के दो कण encapsulation हो जाता है. इसके विपरीत, हम जलीय प्रवाह नोजल को कणों और अधिक जल्दी देने दर बढ़ा सकता है, लेकिन हम भी जलीय धारा की jetting के होने का खतरा बढ़ होता है. चित्रा 3 में histograms के दो मामलों लिए पॉसों आँकड़े तुलना के साथ साथ ड्रॉप प्रति कणों की भिन्नात्मक संख्या उपस्थित. शून्य कणों के साथ कभी कभी बूँदें 'लापता' का आदेश दिया ट्रेनों में कणों के कारण मुख्य रूप से कर रहे हैं, जबकि ऐसे मामलों में जहां स्थानीय उच्च कण सांद्रता और कणों जो कभी कभी दो खड़ी ध्यान केंद्रित पदों की ओर पलायन से वांछित परिणाम की तुलना में अधिक समझाया कणों हैं. ध्यान दें कि मिलान उछाल धारा 2 में वर्णित के रूप में इस्तेमाल नहीं किया गया. इसके बजाय, सिरिंज पंप शारीरिक रूप से के सिरिंज आउटलेट की ओर कणों की व्यवस्थित, चलाने के दौरान कणों के एक उच्च एकाग्रता के लिए अग्रणी की अनुमति झुका हुआ था.

चित्रा 4 में दिखाया गया है. आदेश के बिना पूर्ण, कणों के आदेश की स्थानीय समूहों और समझाया, कर रहे हैं, लेकिन कई बूँदें कणों के बिना कर रहे हैं. एक हिस्टोग्राम कम वांछित दो कण encapsulation के लिए encapsulation के दक्षता से पता चलता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. इनकैप्सुलेशन युक्ति. inlets, आउटलेट, और लंबे समय तक आदेश चैनल के साथ) एक समग्र युक्ति. युक्ति ऊंचाई 52 माइक्रोन है और आदेश चैनल चौड़ाई 27 माइक्रोन है. ख) दोनों जलीय और तेल inlets के आदेश तेल के प्रवेश के बढ़े हुए देखने के लिए चैनल चौड़ाई के आदेश पर अंतराल के साथ बड़े मलबे फिल्टर है. ग) बढ़े नोक देखने के जलीय और तेल चैनलों, 22 माइक्रोन और एक व्यापक 61 माइक्रोन चैनल अचानक विस्तार की नोक संकुचन के बाद के लिए 27 माइक्रोन के बराबर चैनल चौड़ाई से पता चलता है.ध्यान दें कि इस उपकरण का आयाम यहाँ दिखाया microfabrication के बाद एक profilometer का उपयोग सत्यापित किया गया है और मुखौटा पर नाममात्र आयाम से थोड़ा अलग हैं. आदेश चैनल और नोक का एक सच है छवि के रूप में उपलब्ध हैं ऑनलाइन पूरक चित्रा 1 . AutoCAD के मुखौटा फ़ाइल भी इस पांडुलिपि के लिए एक पूरक के रूप में ऑनलाइन शामिल किया गया है.

चित्रा 2
चित्रा 2 jetting के एक व्यापक डिवाइस (उच्च 80 माइक्रोन चौड़ा x 22 माइक्रोन) का उपयोग करते हुए संक्रमण के लिए टपकाव का हिस्टैरिसीस. ) लगातार FC-40 प्रवाह की दर (क्यू तेल = 45 μL / मिनट), स्थिर ड्रॉप गठन 10 kHz पर होता है एक जलीय प्रवाह दर क्यू = 8 μL / मिनट aq का उपयोग. के रूप में जलीय प्रवाह दर धीरे - धीरे 10 और मीटर बढ़ जाती हैयू, एल / मिनट, जलीय द्रव धारा के jetting के शुरू हो रहा है. ख) जब प्रवाह दर 8 μL / जारी jetting के मिनट के लिए वापस आ रहा है. ध्यान दें कि स्थिर ड्रॉप गठन किया जा सकता है संक्षेप में जलीय प्रवाह पंप (1 सेकंड थामने के ठेठ है) रोक के द्वारा फिर से स्थापित.

चित्रा 3
चित्रा 3 सिंगल और डबल - कण encapsulation के.) ड्रॉप प्रति एक सेल (के साथ छोड़ गठन क्यू तेल = 60 μL / मिनट, क्यू aq = 9 / 6.1 kHz के एक बूंद पीढ़ी दर, औसत बूंद के आकार के साथ μL मिनट) 24.4 PL, और एक एकल कक्ष पर कब्जा क्षमता डी कश्मीर = 79.5% और कश्मीर पी = (λ 0.95 =) n का एक नमूना आकार के लिए 83.7% d p = 517 बूँदें और n = 491 कणों). ख दो कोशिकाओं के साथ छोड़ गठन ड्रॉप प्रति बस 30 μ के लिए एफसी-40 प्रवाह दर क्यू तेल को कम करने के द्वारा प्राप्त किया जाता हैएल / मिनट. बड़ा बूँदें (39.8 pl) 3.8 kHz के एक दर पर एक पर कब्जा दो सेल दक्षता के साथ गठन कर रहे हैं डी कश्मीर = 71.5% और पी कश्मीर = 79.5% (λ 1.80 =) n का एक नमूना आकार के लिए = 383 बूँदें और n p = 689 कणों सीडी) दो histograms ड्रॉप encapsulation के कण का आदेश दिया पॉसों आँकड़े यादृच्छिक encapsulation के साथ एकल और डबल कण encapsulation के कश्मीर के विकास क्षमता की तुलना करें. ध्यान दें कि दोनों ही मामलों के लिए प्रवाह की दिशा में कण रिक्ति पूरी तरह से आदेश दिया, बारी कणों के लिए 17-18 माइक्रोन के बारे में है. पूरक दोनों सिंगल और डबल - कण encapsulation के दिखा वीडियो उपलब्ध हैं ऑनलाइन. पूरक मूवी 3a देखने के लिए यहां क्लिक करें . पूरक मूवी 3b देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .


चित्रा 4. एकाग्रता बहुत encapsulation के दक्षता को प्रभावित करता है एकाग्रता कम हो जाती है के रूप में), पूर्ण आदेश नहीं होती है, और इस तरह गाड़ियों में "छेद" उभरने, कम से कम प्रत्याशित कणों के साथ कुछ बूँदें छोड़ने ख) हिस्टोग्राम की कमी हुई दक्षता को दर्शाता है ( डी कश्मीर = 55.9%, पी कश्मीर दो कण के कारण λ का एक कम मूल्य = 1.57 जहां वहाँ लगभग के रूप में कई एकल कण बूंदों के रूप में डबल कण बूँदें हैं encapsulation के लिए = 70.9%). क्यू तेल से यह आंकड़ा परिणाम = 30 μL / मिनट और क्यू aq = 9 μL / मिनट, में चित्रा 3b के लिए के रूप में एक ही प्रवाह की स्थिति. एक प्रतिनिधि पूरक वीडियो ऑनलाइन उपलब्ध है. पूरक मूवी 4 देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

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Discussion

आदेश के अपेक्षाकृत उच्च डिग्री के बावजूद, सभी बूंदों कणों या कक्षों की उचित संख्या नहीं शामिल होंगे. इनकैप्सुलेशन दक्षता कि वांछित उनकी कुल संख्या से विभाजित अधिभोग के साथ बूंदों में समझाया हो कक्षों या कणों की संख्या के रूप में गणना की जा सकती है. इन कच्चे डेटा से एक स्वचालित उच्च गति वीडियो एल्गोरिथ्म या इमेजिंग से एकत्र पायस का एक नमूना भी प्राप्त कर सकते हैं. यह कणों पी कश्मीर के अंश एक कश्मीर कणों और बूँदें डी कश्मीर का अंश है कि कश्मीर कणों के होते हैं युक्त ड्रॉप में समझाया तुलना की जा सकती है. चित्रा 3 से दो का एक पहलू पर दोनों सिंगल और डबल कण encapsulation के क्षमता से यादृच्छिक encapsulation के क्षमता और मात बहुत कणों की वांछित संख्या से अधिक के साथ बूंदों की संख्या को कम चित्रा 4 उच्च दक्षता के लिए उचित सांद्रता के लिए आवश्यकता को दर्शाता है. कि है, और lambd एक;, दोनों कण एकाग्रता और ड्रॉप मात्रा के एक समारोह है, बराबर या ड्रॉप प्रति वांछित कोशिकाओं को सही ढंग से समझाया कणों या कोशिकाओं को अधिकतम संख्या में करीब होना चाहिए. ध्यान दें कि कणों या कोशिकाओं के एक उच्च एकाग्रता आमतौर पर पूर्ण आदेश देने के लिए एक अच्छी बात है के रूप में घने गाड़ियों को समय पर बाहर फैला है और गाड़ियों के बीच खाली क्षेत्रों को भरने करते हैं. दूसरी ओर, अगर एकाग्रता बहुत अधिक है, कणों की उच्च संख्या है कि नोक पर jetting के प्रेरित interfacial अस्थिरता का कारण हो सकता है. विशिष्ट अध्ययन (जैसे उदाहरण के लिए encapsulation के एकल कोशिका के रूप में) में, यह अधिक लाभप्रद हो सकता है कुछ अधिक खाली बूंदों शुरू करने की कीमत पर कई सेल बूंदों से बचने के सकता है, तो एक से थोड़ा कम λ वांछित जाएगा. यह दो कोशिकाओं के बीच या एक सेल और एक कण है, जहां एक कण या एकल कक्ष बूंदों सेल या कण का एक प्रकार के दो या अधिक के साथ बूंदों से अधिक संतोषजनक के बीच बातचीत के उद्देश्य से अध्ययन के लिए भी लागू होता है.

> jove_content समय पर एक निरंतर λ उछाल बनाए रखने के अनुरूप encapsulation के लिए महत्वपूर्ण है कोशिकाओं और सिरिंज और टयूबिंग में कणों के बसने को कम करने से मिलान लंबे समय तक एकाग्रता नियंत्रण में सहायता करता है. हालांकि, उछाल भी एक उच्च जलीय चिपचिपापन में परिणाम मिलान कि हो सकता है आदेश अब चैनल की आवश्यकताओं को ध्यान केंद्रित करने में जिसके परिणामस्वरूप में देरी करने के लिए, चैनल दबाव ड्रॉप वृद्धि, और ड्रॉप पीढ़ी के लिए आवश्यक प्रवाह दरों में बदलाव उछाल के लिए एक विकल्प के इस प्रयोग में इस्तेमाल किया मिलान करने के लिए शारीरिक रूप से सिरिंज पंप झुकाव है तो कि सिरिंज आउटलेट बताया है लगभग खड़ी नीचे (सिरिंज इंटीरियर के लिए कक्षों या कणों के आसंजन कम से कम है) यहाँ, हम 1.3% (लगभग 25 लाख कणों एमएल प्रति) के एक कण की मात्रा अंश के साथ 9.9 माइक्रोन व्यास की microspheres का उपयोग किया है, लेकिन हम झुकने का उपयोग करने के लिए मात्रा भिन्न वृद्धि चित्रा 3 में दिखाया गया डेटा के लिए 2% करने के लिए एक दूसरे वैकल्पिक करने के लिए जलीय द्रव intermitt मिश्रण केently एक संलग्न स्टेनलेस स्टील के बॉल बेयरिंग के साथ (कोशिकाओं के साथ काम करने के लिए लेपित Teflon) एक छोटे से बाहरी चुंबक का उपयोग कर. देखभाल तथापि दे गेंद असर सिरिंज टिप व्यवस्थित करने के लिए जहां प्रवेश टयूबिंग के लिए प्रवेश द्वार को रोक देना हो सकता है से बचने की आवश्यकता है. हालांकि, इन विकल्पों में अधिक श्रम गहन और कम उछाल मिलान से repeatable हैं, तो उछाल मिलान बड़े पैमाने पर लंबे समय फ्रेम पर होने वाली प्रयोगों के लिए सबसे उपयुक्त है. जबकि जड़त्वीय आदेश उच्च पुन की आवश्यकता है और पुन पी के लिए काम करते हैं, जब जलीय और तेल प्रवाह उच्च और उच्च धकेल रहे हैं, स्थिर बूंदों की टपकाव 14 (चित्र 2 देखें) और अनियंत्रित encapsulation के परिणाम jetting के बदल जाता है. 10 माइक्रोन कणों यहां इस्तेमाल की तुलना में छोटे कोशिकाओं के लिए, छोटे चैनल आयाम अगर प्रवाह दर jetting के बिना नहीं बढ़ाई जा सकती पर्याप्त रे पी. हासिल करने के लिए आवश्यक हो सकता है. सिस्टम microfluidic में jetting के की एक ख़ासियत है कि हिस्टैरिसीस प्रभाव w ​​हो सकता हैhich यह मुश्किल बस जलीय प्रवाह की दर कम एक बार यह एक बिंदु है जहां यह नहीं देखा गया है वापस होता है द्वारा jetting के बंद करने के लिए बनाते हैं. प्रयोगात्मक परिणाम के आधार पर, एक एक आयामी या गैर आयामी jetting के प्रवाह पहले अक्षीय सह बह 14 नलिका और ड्रॉप पीढ़ी दर के लिए अतिरिक्त आकृति, ड्रॉप प्रति कोशिकाओं के साथ 26-28 टी जंक्शनों के लिए विकसित की तरह उन नक्शा करने के लिए टपकाव का विकास, और सकता है encapsulation के दक्षता. इस नक्शे ड्रॉप से ​​जो पीढ़ी दर λ की गणना करने के लिए भविष्यवाणी की जा सकती है एक मजबूत खाका प्रदान करने और इस प्रकार पानी और तेल एक प्राथमिकताओं धाराओं के लिए एक अनुमान के अनुसार प्रवाह दर को प्रदान करेगा.

जबकि यहां से सीधे नहीं दिखा, चित्रा 3b में प्रस्तुत उन से तेल प्रवाह दर क्यू तेल में अतिरिक्त कटौती और तीन, चार बूंद प्रति कणों की संख्या में वृद्धि होगी, और इतने पर. ड्रॉप प्रति अधिक कणों को प्राप्त करने के लिए, या तो क्यू तेल कम या Aqu चाहिएईओयू प्रवाह दर क्यू वायु गुणवत्ता में वृद्धि होगी. एक अलग रूप में, हम एक ऑनलाइन पूरक शामिल MATLAB स्क्रिप्ट है जो कणों की बूंदों में किसी भी नंबर पर कब्जा करने के encapsulation के दक्षता मॉडल. उपयोगकर्ता औसत कण रिक्ति और एक कण रिक्ति मानक विचलन है, जो आदेश की डिग्री मॉडल आदानों. गाड़ियों के लिए आदेश दिया है, मानक विचलन छोटा हो जाएगा. इसके अतिरिक्त, उपयोगकर्ता जानकारी औसत ड्रॉप आकार और आकार ड्रॉप मानक विचलन, जो बूंद के आकार के polydispersity के लिए खातों. अतिरिक्त जानकारी के लिए स्क्रिप्ट प्रलेखन के लिए संदर्भ लें.

जब जलीय प्रवाह की दर बढ़ रही है या कणों या ड्रॉप प्रति कोशिकाओं, अस्थिर jetting के चरम मानों के पास संबंधित प्रवाह दरों के रूप में बढ़ जाती है की जोखिम की संख्या को बढ़ाने के तेल प्रवाह की दर कम है. इस प्रकार, प्राप्त कणों / ड्रॉप प्रति कोशिकाओं की अधिकतम संख्यायुक्ति ज्यामिति और तरल पदार्थ के गुणों पर निर्भर करेगा. एकाग्रता / कण सेल और तेल प्रवाह की दर को देखते हुए, ड्रॉप प्रति कणों / कोशिकाओं की संख्या जलीय प्रवाह दर पर ऊपरी सीमा है, जो काफी बड़े आदेश प्रेरित लेकिन काफी छोटे से अस्थिर से बचने के jetting के (सीमा और कतरनी होना चाहिए होना चाहिए द्वारा विवश है कोशिकाओं पर तनाव व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए). वैकल्पिक रूप से, एक जलीय प्रवाह दर है जिस पर आदेश होती दिया, तेल प्रवाह की दर पर्याप्त काफी बड़े के लिए टपकाव शासन में रहने रहना चाहिए.

ध्यान दें कि ड्रॉप पीढ़ी और संक्रमण jetting के करने के लिए टपकाव surfactant एकाग्रता के लिए बहुत संवेदनशील होते हैं. उच्च सांद्रता surfactant तेल की चिपचिपाहट बढ़ाने के लिए, ड्रॉप पीढ़ी के मानकों को बदलने. एक अलग रूप में, fluorocarbon तेल के लिए व्यापक रूप से उपलब्ध biocompatible है surfactants की कमी एक बड़ी चुनौती प्रस्तुत करता है. वर्तमान में, एक वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ता (Raindance टेक्नोलॉजीज) PFPE खूंटी ब्लॉक copolymer surfactants, 2 के लिए मौजूद है5 पढ़ाई लेकिन छोटे पैमाने के रूप में PFPE - HEG surfactant समूहों की एक संख्या के संश्लेषण तकनीक का प्रदर्शन प्रकाश खनिज तेल के रूप में 29,30 वैकल्पिक. अनुप्रयोगों जैविक बूंद पीढ़ी में उपयोग किया गया है करने के लिए उपलब्ध surfactants का एक व्यापक रेंज, 24,31 का उपयोग लेकिन ध्यान दें कि साथ दलदलापन में वृद्धि के रूप में fluorocarbon तेल की तुलना में ड्रॉप पीढ़ी पैरामीटर बदल. हाल ही में एक 32 समीक्षा प्रकाशित सतत चरण तेल और surfactants की एक बड़ी संख्या का वर्णन है.

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Disclosures

जेई एक लंबित इस पांडुलिपि में प्रौद्योगिकी का उपयोग के आधार पर पेटेंट पर एक आविष्कारक है.

Acknowledgements

हम PFPE खूंटी surfactant के इस अध्ययन में उपयोग के नमूने के लिए Raindance टेक्नोलॉजीज धन्यवाद, और हम BioMEMS संसाधन केंद्र (Mehmet Toner, निदेशक) सिलिकॉन वफ़र PDMS चैनल प्रतिकृतियां बनाने के लिए इस्तेमाल किया आचारण के लिए धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AutoCAD AutoDesk
Transparency Mask Fineline Imaging Inc.
SU-8 Photoresist MicroChem Corp. 2050
Dektak Profilometer Veeco Instruments, Inc.
Petri Dish BD Biosciences 351058
PDMS Silicone Elastomer Kit Dow Corning Sylgard 184, Material Number (240)4019862
Vacuum Desiccator Jencons 250-030
Vacuum Pump Alcatel Vacuum Technology 2010 C2
Vacuum Regulator Cole-Parmer EW-00910-10
Oven Thermo Fisher Scientific, Inc. Lindberg Blue M, OV800F
Biopsy Punch, 0.75 mm Harris Uni-Core 15072
Laboratory Corona Treater Electro-Technic Products Inc. BD-20AC, SKU 12051A
Glass Slides Gold Seal 3010
Aquapel PPG Industries Alternative Strategy
Polystyrene Microspheres, 9.9 μm Thermo Fisher Scientific, Inc. G1000
OptiPrep Sigma-Aldrich D1556 Not Demonstrated
Luer-Lok Syringes BD Biosciences 1 mL: 309628 3 mL: 309585
FC-40 Fluorocarbon Oil 3M Inc. Sigma Aldrich, F9755
PFPE-PEG Fluorosurfactant RainDance Technologies
Light Mineral Oil PTI Process Chemicals 08042-47-5 Alternative Strategy
Mineral Oil Surfactant Evonik Goldschmidt Corporation ABIL EM 90 Alternative Strategy
Tygon PVC Tubing Small Parts, Inc. TGY-010
30 Gauge Luer-Lok Syringe Needle, 1/2" Small Parts, Inc. NE-301PL-C
Inverted Microscope Carl Zeiss Imaging Axio Observer.Z1
High Speed Camera Vision Research Phantom V310
Syringe Pumps (2) Chemyx Inc. Nexus 3000
Silicone Oil Dow Corning 200 fluid, 10 cSt Optional for Emulsion Storage

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References

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