High-Throughput-Einzel-Zell-und Multiple-Zelle Mikroverkapselung

Bioengineering

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Summary

Das Kombinieren der monodispersen Tropfenerzeugung mit Beschleunigungssensoren Anordnung von Zellen und Partikeln, beschreiben wir ein Verfahren, um eine gewünschte Anzahl von Zellen oder Teilchen in einem einzelnen Tropfen mit kHz Preise zu kapseln. Wir demonstrieren die Effizienz zweimal höher sind als die von ungeordneten Kapselung für Single-und Double-Teilchen-Tropfen.

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Lagus, T. P., Edd, J. F. High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation. J. Vis. Exp. (64), e4096, doi:10.3791/4096 (2012).

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Abstract

Protocol

Die Protokolle in diesem Abschnitt beschreiben die Materialien und Ausrüstungen, die speziell auf die experimentellen Ergebnisse präsentiert bekommen genutzt. Beachten Sie, dass andere Anbieter für Chemikalien und Ausrüstung verwendet werden kann.

1. Bauelementherstellung und Softlithographie

Standard-Soft-Lithographie-Techniken, 21 von denen einige in früheren JOVE Artikel wurden oft vorgestellten wurden 22 für die Erstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS) Mikrokanal Netzwerke gebunden an Glassubstraten verwendet. Abgesehen von Masterreproduktion Formenbau von SU-8 Photolithographie können die Prozesse außerhalb von einem Reinraum oder sauberen Abzug durchgeführt werden, jedoch Staub und Partikel sollten noch minimiert werden, um konsistente Ergebnisse zu erzielen.

  1. Entwerfen Sie ein Mikro-Kanal-Muster wie in Abbildung 1 in AutoCAD (Autodesk Inc.) gezeigt. Von einem Dritten Herstellers (Fineline Imaging Inc.), um eine hohe Auflösung (50.000 dpi) trans druckenTransparenz-Maske auf Mylar-Folie oder Quarz, wo Kanäle sind transparent auf einem dunklen Hintergrund.
  2. Erstellen Sie eine Silizium-und SU-8 Fotolack-Master für Replik Guß. Kurz gesagt, spinnen SU-8-2050 (MicroChem) negativer Photoresist mit vom Hersteller empfohlenen rpm auf einem Spin-Coater, eine 52 um dicke Schicht auf ein sauberes 7,5 cm oder 10 cm Silizium-Wafer zu erzeugen. Nach Weichbacken, Randentlackung, UV-Belichtung durch eine Maske Kontakt, Post-Exposure Bake, Entwicklung und Flutbelichtung, messen die tatsächliche Dicke des SU-8-Schicht mit Hilfe eines Dektak Profilometer (Veeco). Band der Master-Form auf den Boden eines 4 "oder 5" Petrischale für PDMS Replikat Formen herzustellen.
  3. Mix PDMS-Elastomer-Basis mit Elastomer Härtungsmittel (Dow Corning) in einem Verhältnis von 10:1 w / w Basis zu Härter. Gießen Sie gut gemischten PDMS-Vorläufer auf den Silizium-Master eine 2-3 mm endgültige Dicke Schicht schaffen. Eine Mischung aus 20 g Elastomer-Basis mit 2 g Härtungsmittel ausreichend ist, um ein 4 "Durchmesser bedecken.
  4. Legen Sie die Master Schimmel und PDMS im Vakuumexsikkator (Jencons) zu de-Gas nicht ausgehärteten PDMS. Verwendung eines Druckreglers (Cole Parmer), langsam abnehmen die Kammer Überdruck von 0 "Hg bis -27" Hg innerhalb von 20 Minuten, um ein übermäßiges Schäumen zu vermeiden. Lassen Vorrichtung in der Vakuumkammer bei -27 "Hg für 30 Minuten oder bis Luftblasen verschwinden.
  5. Lassen Vakuum bewegen und Master-Form und PDMS zu einem 65 ° C Ofen (Thermo Scientific) bei einem Mindestaufenthalt von vier Stunden. Die Vorrichtung kann in den Ofen über Nacht Härten zu verbessern gelassen werden.
  6. Entfernen Sie das Gerät aus dem Ofen nehmen und abkühlen lassen. Schneiden Sie vorsichtig PDMS um kreisförmige Scheibe mit einer Präzisions-Messer schälen und aus PDMS. Ausschneiden Vorrichtung Form wie in 1 gezeigt, mit einem Skalpell.
  7. Stanz fluidische Anschlüsse (drei pro Gerät) in den drei Regionen jähriger in 1 gezeigt unter Verwendung eines Biopsiestanze. Für dieses Gerät mit einem 0,75 mm Außendurchmesser Stempel (Harris).
  8. Beachten Tesafilm auf das strukturierte Seite des PDMS und einem Peeling entfernenStaub. Als kostengünstige, aber lebensfähige Alternative zu herkömmlichen Sauerstoff-Plasma-Geräte, Plasma-Behandlung 21,22 mit der strukturierten Seite des PDMS und einem sauberen 3 "x 1" Glas-Objektträger mit einem Handheld-Labor Corona Anlage (Electro-Technic Products Inc .). 23. Hinweis, dass dieses Gerät in einem Abzug oder gut belüfteten Raum durch Ozon Entladung verwendet werden sollte, und alle Uhren und Handys sollte mindestens drei Meter entfernt gehalten werden. Passen Sie die Corona-Entladung, um eine stabile Korona mit minimaler Funkenbildung zu erreichen. Langsam schwenken die Elektrode etwa 1/4 "über jeder Fläche für etwa 20 Sekunden und dann sofort bringen die behandelten Oberflächen in Kontakt, um eine starke dauerhafte Verbindung bilden, bevor die PDMS-Oberflächen in ihre Heimat zurückzukehren.
  9. Stellen Sie das Gerät auf einer Metallplatte, in einem kalten Ofen, stellen Sie den Backofen auf 120 ° C und über Nacht backen, um die Bindung zu vervollständigen und die PDMS zu seiner ursprünglichen hydrophoben Zustand. Zurück 24 Während dieser hohen Temperatur backen, ter Glasoberfläche des Kanals auch hydrophob aufgrund der Ablagerung von einer dünnen hydrophoben Schicht auf dem Glas werden. Alternativ kann hydrophoben Beschichtungen, wie Aquapel (PPG Industries) in die fluidischen Anschlüsse unter Verwendung einer 1 ml Spritze und einer Nadel Spritze injiziert werden. 12 sorgfältig aber fest injizieren Aquapel von Spülluft in die fluidischen Anschlüsse ohne die PDMS auf Glas-Bindung gefolgt . Aggressiv wiederholen Sie die Entlüftung auf allen Einlass-und Auslasskanäle, während Wischen Sie überschüssiges Aquapel, um eventuelle Ablagerungen, die die Kanäle verstopfen können nach dem Trocknen zu vermeiden.

2. Probenvorbereitung

  1. Bereiten Sie eine Zellkultur nach festgelegten Verfahren für Ihr ausgewähltes Zelltyp. Für das spezielle Gerät in dieser Studie verwendet wird, sollte 8-15 um Teilchen oder Zellen adäquat für die Verkapselung zu bestellen. Kleinere oder größere Zelltypen, die Änderung der Abmessungen der Fokussierung Kanal, um eine angemessene Re p erreichen. Für die mirThSB Demonstration Ergebnisse in dieser Arbeit gezeigt, werden um 9,9 Polystyrol-Mikrosphären (G1000, Thermo Scientific) als Surrogate Zelle genutzt.
  2. Bereiten Sie die wässrige Partikel-oder Zellsuspension durch vorsichtiges Mischen. Bei der Verwendung von Zellen oder Polystyrol-Teilchen, ist die Kontrolle, Konzentration (siehe Abbildung 4), um ideale bestellt Kapselung zu erzielen. Mit bisherigen Daten 12 als Leitfaden, berechnen Sie die gewünschte Zelle oder Partikelkonzentration von der bestellten Zug Abstand und Mikro-Kanal-Größe basiert wie: eine Zelle oder ein Teilchen pro erwarteten Längs-Zug mal Abstand die Fokussierung Kanal Querschnittsfläche. Wenn die Stoffkonzentration (1% w / w) nicht ausreichend ist, Erhöhung der Konzentration (hier 1,5% w / w) durch leichtes Zentrifugieren der Probe Lager, überstehende Flüssigkeit entfernt, und Resuspendieren der Teilchen durch Vortex-Mischen, Mischen oder sanfteren bei der Verwendung von Zellen. Vorbereitung eines angemessenen Volumens zu berücksichtigen gewünschte Sammelvolumen und für Laufzeit mit fl verbundenow-Tuning.
  3. Beide Zellen und Polystyrol-Partikel ein spezifisches Gewicht größer als eins. Obwohl es in diesem Protokoll gezeigt, für Langzeit-Experimenten Dauer in der Größenordnung von mehreren Minuten bis zu Stunden, einverstanden Auftrieb die Lösung durch Zugabe eines gelösten Stoffes wie CaCl 2 für Partikel oder Optiprep (Sigma-Aldrich) für Zellen.
  4. Eine 10 ml Probe des kontinuierlichen Fluorkohlenstoffphase Ölphase durch Mischen des Fluorkohlenstofföl FC-40 (3M) und PFPE-PEG-Block-Copolymer-Tensid 25 (2,5% w / w) (RainDance Technologies) in einem 15 ml-Zentrifugenröhrchen. Alternativ kann leichtes Mineralöl (PTI Verfahren Chemicals) mit ABIL-EM 90 Tensid (2,5% w / w) (Evonik Goldschmidt Corporation) verwendet werden.

3. Experimenteller Aufbau

  1. Schalten Sie den invertierten optischen Mikroskop (Axio Observer, Zeiss) und High-Speed-Kamera (Phantom V310, Vision Research). Konzentrieren Sie und prüfen Sie die Kanäle für Clogs und Schutt durch entweder manuell das Gerät bewegen odermit einem motorisierten Mikroskop Bühne. Einige kleine Trümmer heraus geschoben werden kann, wenn Flüssigkeit durchströmt. Für große Trümmer oder offensichtliche Clogs, wählen Sie einen anderen Kanal auf dem Gerät als Fremdkörper in der Fokussierung Kanal kann degradieren Bestellung Qualität erheblich. Beachten Sie, dass Clogs können oft unter Strom, indem Sie fest auf dem PDMS-Oberfläche über der betroffenen Region mit stumpfen Pinzette entfernt werden.
  2. Schneiden drei Längen von PVC-Schläuchen (0,01 "ID/0.03" OD, Tygon) für die wässrige Einlaß, Öleinlass und Auslaß Emulsion. Um Totvolumen zu minimieren, gerade genug, um Schläuche von den Spritzenpumpen auf dem Mikroskoptisch erreichen geschnitten. Schneiden Sie Rohrenden in einem 45 ° Winkel zum Einsetzen in fluidischen Anschlüsse zu erleichtern.
  3. Sie mit einer Pinzette drücken passen die Rohrenden in die fluidischen Anschlüsse in Schritt 1 gestanzt und drücken Sie dann passen zwei 30-Gauge-Blunt-Spitze aus Edelstahl Kanülen (Kleinteile) in die freien Enden der jeweiligen wässrigen und öligen Einlaßrohren (kein Klebstoff erforderlich) . Setzen Sie den Ablaufschlauch in einen Abfallbehälter reservoir. Dieser Schlauch wird später in einen Sammelbehälter bewegt werden.
  4. Bewegen Sie das Gerät und die angeschlossenen Schlauch mit dem Mikroskoptisch, ausrichten und konzentrieren sich auf die Düse mit einem Gerät zur Verfügung Objektiv (20x wurde für dieses Experiment verwendet wird). Passen Sie für K hler Beleuchtung und andere Einstellungen als Mikroskop für eine optimale Aufnahme erforderlich.
  5. In eine 1 ml-Spritze (BD) mit der gut gemischten wässrigen Phase und einer 3 ml Spritze (BD) mit der Ölphase Lösung in Schritt 2 hergestellt. Beachten Sie, dass alle Spritzen nach einem der Volumen verwendet werden können, sollten sorgfältig ausgewählt werden je nach den gewünschten Laufzeiten und Minimierung jeglicher Pulsatilität. Neigen Sie eine Spritze vertikal und Flick, um Luftblasen an die Spritzenauslaßstück bewegen. Drücken Sie langsam genug, um die Kolben Luft zu der Kanüle zu schieben. Halten der Spritze vertikal, verbinden die Spritzen mit der entsprechenden Spritze Nadel bereits auf das Gerät in Schritt 3.3 befestigt. Drücken Kolben, um die Luft durch die Spritzennadel Totvolumen zwingen, bis die Flüssigkeit pushed durch den Schlauch fast an das Gerät. Befestigen Sie die Spritze zu einer Spritzenpumpe (Nexus 3000, Chemyx) und den Kolben in Eingriff Block. Wiederholen Sie die Anschlüsse für die zweite Spritze und montieren Sie an einen zweiten Spritzenpumpe.
  6. Leistung auf jeder Spritzenpumpe und Programm unter Verwendung der Pumpe Herstellers Protokolle. Stellen Sie die ersten Flussraten bis Q = Öl 50 &mgr; l / min und Q AQ = 5 &mgr; l / min für die Öl-Phase und der wässrigen Phase, beziehungsweise. Starten Sie die Pumpen.
  7. Warten Sie für jede Flüssigkeit in das Gerät eindringen und füllen Sie die Kanäle, Ausschieben verbleibende tote Luft. Dies kann einige Minuten dauern. Wenn es eine große Menge an Luft in dem Einlassschlauch, vorübergehend zu erhöhen, jedes Strömungsrate, bis die Luft ausgestoßen wird. Erhöhen Sie nicht die Durchflussmengen so hoch, dass große Belastungen treten in den Kanal, was möglicherweise zu PDMS-Glas-Bindung Misserfolg.
  8. Mit den ersten Flussraten, beobachten die Bildung von Tropfen an der Düse (hier gezeigten Ergebnisse: 20x magnification, 21005 fps Bildrate, Belichtung 3 us). Reduzieren Sie die Kamera Sichtfeld nur die Düse, um die Frame-Rate zu maximieren und die Speicheranforderungen, wenn möglich. Nehmen Sie Videos und Probe bestätigen, dass die Abtastrate ausreichend, um Aliasing zu vermeiden ist.
  9. Zur Vermeidung von Strahlen (siehe Abbildung 2), mit niedrigen Flussraten wässrigen starten. Langsam erhöhen wäßrigen Strömungsrate zu beobachten Reihenfolge der Partikel in der wässrigen Lösung langen Kanal, wenn die Strömungsrate zunimmt.
  10. Ist die Partikelkonzentration ist zu niedrig, um Züge mit relativ wenigen "fehlenden" Partikel und die Probe wurde nicht abgestimmt Auftrieb geben, körperlich kippen Sie die Spritzenpumpe in Richtung der Spritzenauslaßstück zu bieten allmählichen Absetzen der Teilchen in Richtung der Spritze Steckdose. Dieses Verfahren ist in dem Video-Protokoll gezeigt. In regelmäßigen Abständen Drehen der Spritze entlang ihrer Achse kann auch reduzieren unerwünschte Besiedlung.
  11. Sobald eine angemessene Ordnung auftritt, stellen Sie die Ölmenge, die Generierung Frequenz abzustimmen undGröße der Tropfen. Die mittlere Tropfenvolumen kann mit Hilfe der wässrigen Durchfluss durch den Rückgang Generation Frequenz wie von Video-Capture gemessen aufgeteilt werden. Iterativ anpassen beide Volumenströme zu wünschen Kapselung Preise und Tropfenvolumen zu erreichen.
  12. Sobald stabile bestellt Kapselung bestätigt wird, bewegen Sie den Ablaufschlauch aus dem Abfall Reservoir in einen Sammelbehälter oder speisen ihn in ein anderes Gerät für die anschließende Prüfung.
  13. Bestimmen Sie die Sammlung auf Zeit gewünschte Anzahl von Tröpfchen und der berechneten Frequenz-Generation basiert.
  14. Datensatz der Anteil von Tropfen, die 0, 1, 2, ..., N Teilchen, um die Effizienz Quantifizierung unter Verwendung von entweder Tropfenerzeugung Video Ergebnisse oder durch Pipettieren einer Probe der gesammelten Emulsion zur Inspektion.

4. Repräsentative Ergebnisse

Die Ergebnisse werden präsentiert, die sowohl zu erreichen kontrollierte Ein-Teilchen und kontrollierten Doppelblind-Teilchen-Verkapselung (Abbildung 3). Durch das Schneidendie FC-40 Ölmenge in der Hälfte, wird Einteilchen-Verkapselung Zwei-Teilchen-Kapselung. Umgekehrt könnte man die wässrige Durchfluss, um Partikel zu der Düse schneller liefern erhöht haben, aber wir würden auch das Risiko von Strahlen von dem wässrigen Strom erhöht haben. Histogramme in Abbildung 3 präsentieren die gebrochene Zahl der Teilchen pro Tropfen für die beiden Fälle zusammen mit Vergleiche mit Poisson-Statistik. Die gelegentlichen Tropfen mit Null Teilchen sind in erster Linie die "fehlenden" Teilchen in den bestellten Züge, während die Fälle, in denen es mehr als gewünscht eingekapselten Teilchen Folge lokal hohen Partikelkonzentrationen und Partikel, die manchmal zu einem der zwei vertikalen Fokuspositionen zu migrieren. Beachten Sie, dass Auftrieb passend wie in Abschnitt 2 beschrieben wurde nicht genutzt. Stattdessen wurde die Spritzenpumpe physikalisch gekippt, damit Absetzen der Partikel in Richtung der Spritze Auslaß, was zu einer hohen Konzentration von Partikeln während des Laufs.

Abbildung 4 dargestellt. Ohne vollständige Bestellung, werden lokalisierte Gruppen von Teilchen Ordnung und gekapselt, aber viele Tropfen sind ohne Partikel. Ein Histogramm zeigt die verminderte Verkapselungseffizienz für die gewünschte Partikelgröße zwei Kapselung.

1
Abbildung 1. Encapsulation Gerät. a) Gesamt-Gerät mit Buchten, Steckdose und lange Bestellweg. Das Gerät beträgt 52 um und die Bestellung von Kanalbreite beträgt 27 um. b) Sowohl wässrigen und öligen Einlässe große Trümmer Filter mit Lücken in der Größenordnung von der Bestellung Kanalbreite für die vergrößerte Ansicht des Öleinlasses. c) Die vergrößerte Ansicht zeigt Düse gleich Kanalweiten 27 um den wässrigen und öligen Kanälen, durch die Kontraktion der Düse 22 um und plötzliche Ausdehnung einer breiteren Kanal 61 um folgt.Beachten Sie, dass die Abmessungen der hier gezeigten Vorrichtung überprüft wurden mit einem Profilometer nach Mikrofabrikation und unterscheiden sich geringfügig von den Nennweiten auf der Maske. Ein wahres Bild des Bestellers Kanal und Düse sind online verfügbar als Supplemental Abbildung 1 . Die AutoCAD-Datei Maske wurde ebenfalls eingeschlossen Online als Ergänzung zu diesem Manuskript.

2
Abbildung 2. Hysterese eines tropfenden zu Jetting Übergang mit einem größeren Gerät (80 x 22 um breit um hoch). a) Bei konstanten FC-40 Durchfluss (Q Öl = 45 ul / min), tritt stetigen Tropfenbildung bei 10 kHz mit einer wässrigen Volumenstrom Q AQ = 8 ul / min. Als die wässrige Strömungsrate wird langsam auf 10 m erhöht undu, L / min, Ausstoßen der wässrigen Fluidstrom ausgelöst wird. b) Wenn die Durchflussrate ist auf 8 ul / min Jetting weiter zurück. Beachten Sie, dass stetige Tropfenbildung kann durch kurzes Anhalten der wässrigen Strömungspumpe (a 1 Sekunde Pause ist typisch) wieder hergestellt werden.

Abbildung 3
Abbildung 3. Einzel-und Doppel-Teilchen-Kapselung. A) Tropfenbildung mit einer Zelle pro Tropfen (Öl Q = 60 ul / min, Q aq = 9 ul / min) mit einem Tropfen Generation von 6,1 kHz, mittlere Tropfengröße von 24,4 pL, und ein Single-Cell-Abscheidung Wirkungsgrade D k = 79,5% und P k = 83,7% (λ = 0,95) für eine Stichprobengröße von n d = 517 Tropfen und n p = 491 Teilchen. b) Drop-Formation mit zwei Zellen pro Tropfen wird einfach durch eine Verringerung der FC-40 Öl-Fördermenge Q bis 30 μ erreichtL / min. Die größere (39,8 pL) Tropfen werden mit einer Rate von 3,8 kHz mit einer Zwei-Zell-Capture-Effizienz ausgebildet D k = 71,5% und P k = 79,5% (λ = 1,80) für eine Probe von n d = 383 und n Tropfen p = 689 Teilchen. cd) Zwei Histogramme vergleichen Sie die Drop-Kapselung Partikel Wirkungsgrade D k der bestellten Single-und Double-Teilchen-Verkapselung mit Poisson-Statistik (random Kapselung). Beachten Sie, dass in beiden Fällen, Partikel Abstand in Strömungsrichtung um etwa 17-18 für vollständig geordneten abwechselnd Teilchen ist. Zusätzliche Videos zeigen sowohl Single-und Double-Teilchen-Kapselung sind online verfügbar. Klicken Sie hier um Supplemental Film 3a anzuzeigen . Klicken Sie hier um Supplemental Film 3b sehen .


Abbildung 4. Konzentration stark beeinflusst Verkapselungseffizienz. A) Als die Konzentration nimmt ab, voller Ordnung findet nicht statt, und damit "Löcher" in den Zügen entstehen, so dass einige Tropfen mit weniger als erwarteten Partikel. B) Das Histogramm zeigt die verringerte Effizienz ( D k = 55,9%, P k = 70,9%) für Zwei-Teilchen durch Einkapselung auf einen niedrigeren Wert von λ = 1,57, wo es annähernd so viele Einzelpartikel-abfällt, da Doppel-Teilchen Tropfen. Dieser Angabe liegt Q Öl = 30 ul / min und Q AQ = 9 ul / min, die gleichen Bedingungen wie für die Flow Abbildung 3b. Ein Vertreter ergänzende Video ist online verfügbar. Klicken Sie hier um Supplemental Movie 4 sehen .

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Discussion

Trotz der relativ hohen Grad der Bestellung werden nicht alle Tropfen enthalten die richtige Anzahl von Partikeln oder Zellen. Verkapselungseffizienz kann als die Anzahl von Zellen oder Partikeln, die in Tropfen mit der gewünschten Belegung durch die Gesamtzahl unterteilt eingekapselt geworden berechnet werden. Diese Rohdaten können entweder von einem automatisierten High-Speed-Video-Algorithmus oder aus einer Stichprobe von Imaging gesammelt Emulsion erhalten werden. Dies kann zu der Fraktion von Teilchen P k in einem Tropfen mit k Teilchen und der Anteil von Tropfen D k, k Teilchen enthalten würde eingekapselt verglichen werden. Aus Abbildung 3, übertreffen sowohl die Einzel-und Doppelzimmer Partikel Verkapselungseffizienzen zufällig Verkapselungseffizienzen um mehr als den Faktor zwei und reduzieren die Anzahl der Tropfen mit mehr als der gewünschten Anzahl von Partikeln Abbildung 4 zeigt die Notwendigkeit einer angemessenen Konzentrationen für einen hohen Wirkungsgrad.; das heißt, & lambd a;, die eine Funktion des Partikelkonzentration und Tropfenvolumen, sollte gleich oder nahe an der Anzahl der gewünschten Zellen pro Tropfen ordnungsgemäß eingekapselten Teilchen oder Zellen zu maximieren. Beachten Sie, dass eine höhere Konzentration von Partikeln oder Zellen in der Regel ist eine gute Sache für die vollständige Bestellung als dichte Züge, um sich auszubreiten über die Zeit und füllen leerer Regionen zwischen den Zügen neigen. Auf der anderen Seite, wenn die Konzentration zu hoch ist, kann die große Anzahl von Teilchen zu Instabilitäten, die Grenzflächen-Strahlen an der Düse zu induzieren. In bestimmten Untersuchungen (zB Ein-Verkapselung von Zellen, zum Beispiel), kann es vorteilhafter sein, um mehrere Zellen Tröpfchen auf Kosten der Einführung ein paar leeren Tröpfchen zu vermeiden, so dass eine etwas geringere λ gewünschten wird. Dies würde auch Studien die Wechselwirkungen zwischen zwei Zellen oder zwischen einer Zelle und eines Teilchens, wo einzelne-Teilchen oder einzelligen Tröpfchen erträglicher als Tröpfchen mit zwei oder mehr von einer Art von Zelle oder Teilchen ausgerichtet sind.

jove_content "> Die Aufrechterhaltung einer konstanten λ im Laufe der Zeit ist von entscheidender Bedeutung für die konsequente Kapselung. Auftrieb Matching hilft bei der langfristigen Kontrolle Konzentration durch Reduktion Absetzen von Zellen und Partikeln in der Spritze und Schlauch. jedoch auch passende Auftrieb bewirkt eine höhere Viskosität, die wässrige kann Bestellung verzögern (was zu mehr Konzentration Channel-Anforderungen), erhöhen Sie den Kanal Druckabfall, und ändern Sie die Durchflussmengen für Drop-Generation erforderlich. Eine Alternative zum Auftrieb Matching in diesem Experiment verwendet wird, um körperlich kippen Sie die Spritzenpumpe, so dass die Spritzenauslaßstück hingewiesen wird fast senkrecht nach unten (die Adhäsion von Zellen oder Partikeln an der Spritze Innenraum zu minimieren). Hier haben wir 9,9 Mikrometer Durchmesser Mikrokügelchen mit einer Partikelgröße Volumenanteil von 1,3% (etwa 25 Millionen Partikeln pro ml), aber wir verwendet schwenkbar in Volumenanteilen zu erhöhen bis 2% für die Daten in 3 gezeigt. Eine zweite Alternative besteht darin, die wässrige Flüssigkeit zu mischen intermittently mit geschlossenem Edelstahl-Kugellager (Teflon für die Arbeit mit Zellen beschichtet) mit einem kleinen externen Magneten. Vorsicht ist jedoch zu vermeiden, dass das Kugellager an die Spitze der Spritze niederzulassen, wo sie den Eingang zum Zulaufschlauch darf verschließen erforderlich. Allerdings sind diese Alternativen mehr arbeitsintensiv und weniger Auftrieb als wiederholbare Matching, so Auftrieb Matching ist am besten geeignet für Experimente auftretenden größeren Maßstab über lange Zeiträume. Während Inertial-Bestellung erfordert hohe Re und Re p zu bedienen, wenn die wässrige und Öl strömt höher und höher, geschoben werden ständig tropfenden Tropfen dreht sich um Jetting 14 (siehe Abbildung 2) und unkontrollierte Kapselung Ergebnisse. Für Zellen kleiner als die Teilchen 10 um welche hier können kleinere Kanalabmessungen erforderlich, um ausreichend Re p erreichen, wenn die Flussrate kann nicht ohne Ausstoßen erhöht werden. Eine Besonderheit der Strahlen in mikrofluidischen Systemen besteht darin, dass Hysterese-Effekte auftreten können werden machen es schwierig, zu stoppen Ausstoßen durch einfaches Absenken des wäßrigen Strömungsrate einmal wieder tritt bis zu einem Punkt, wo es nicht beobachtet wurde. Basierend auf experimentellen Ergebnissen könnte man die Entwicklung einer eindimensionalen oder nicht-dimensionsmäßigen, tropft die Turbulenzströmung Karte, wie sie zuvor für die axiale Zusammenarbeit fließenden Düsen 14 und T-Verbindungen 26 bis 28 mit zusätzlichen Konturen für Tropfen Erzeugungsrate, Zellen pro Tropfen entwickelt und Verkapselungseffizienz. Diese Karte würde eine robuste Roadmap, aus denen die Drop-Rate-Generation vorhergesagt λ berechnet werden können und somit einen geschätzten Durchfluss für Wasser und Öl Streams a priori.

Obwohl nicht direkt hier gezeigt, würde weitere Verringerungen der Ölmenge Q Öl von den in 3b dargestellt weiteren Erhöhung der Anzahl von Partikeln pro Tropfen auf drei, vier, und so weiter. Um mehr Partikel pro Tropfen zu erreichen, muss entweder Q Öl zu verringern oder die AQUEOB Durchflussmenge Q aq muss steigen. Nebenbei bemerkt, haben wir eine Online-Ergänzung enthalten MATLAB-Skript , das die Kapselung Effizienz der Erfassung einer beliebigen Anzahl von Partikeln in Tropfen modelliert. Die Benutzereingaben die mittlere Teilchengröße Abstand und eine Teilchengröße Abstand Standardabweichung, die den Grad der Ordnung modelliert. Für Züge bestellt, wird die Standardabweichung klein sein. Darüber hinaus gibt der Benutzer die mittlere Tropfengröße und Tropfengröße Standardabweichung, die für die Polydispersität von Tropfengrößen ausmacht. Finden Sie im Skript-Dokumentation für weitere Informationen.

Bei einer Erhöhung des wäßrigen Strömungsrate oder Verringern der Ölmenge, die Anzahl von Partikeln oder Zellen pro Tropfen, die Gefahr einer instabilen Ausstoßen zunimmt, wenn die jeweiligen Strömungsraten der Nähe extremer Werte zu erhöhen. Somit kann die maximale Anzahl der erreichbaren Teilchen / Tropfen Zellen prowird am Gerät Geometrie und Fluid-Eigenschaften abhängen. Angesichts der Partikel / Zellkonzentration und Öldurchfluss, wird die Anzahl der Partikel / Zellen pro Tropfen Obergrenzen für wässrige Flussraten, die groß genug sein, um zu induzieren Bestellung muss aber klein genug, um zu vermeiden instabilen Ausstoß (und Grenze Scherung muss eingeschränkt Spannungen auf Zellen, um die Rentabilität zu gewährleisten). Alternativ dazu gegeben eine wässrige Strömungsgeschwindigkeit, bei der Bestellung auftritt, muss die Ölmenge bleibt ausreichend groß genug, um in der tropfenden Regime bleiben.

Beachten Sie, dass Drop-Generation und der tropfende zu Jetting Übergang sehr empfindlich auf Tensidkonzentration sind. Hohe Tensidkonzentrationen erhöhen die Viskosität des Öls, das Ändern der Drop-Parametern an. Nebenbei stellt der Mangel an allgemein verfügbar biokompatible Tenside für Fluorkohlenwasserstoff Öle eine große Herausforderung. Derzeit gibt es einen kommerziellen Lieferanten (RainDance Technologies) für PFPE-PEG Blockcopolymer-Tenside, 25, aber Studien zeigen kleine Synthesetechniken einer Reihe von oberflächenaktiven Gruppen wie PFPE-HEG. 29,30 Alternativen wie leichtes Mineralöl in biologischen Tropfenerzeugung Anwendungen verwendet worden, um ein breiteres Spektrum von erhältliche Tenside, 24,31 übersetzen Beachten Sie jedoch, dass die begleitenden Anstieg der Viskosität zu Fluorkohlenstofföl verglichen verändert die Drop-Parametern an. Eine aktuelle Übersicht 32 beschreibt eine große Anzahl von veröffentlichten kontinuierliche Phase Ölen und Tensiden.

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Disclosures

JE ist ein Erfinder auf einen anhängigen Patent auf die Technologie in diesem Manuskript verwendet basiert.

Acknowledgements

Wir danken RainDance Technologies für die Probe von PFPE-PEG-Tensid in dieser Studie verwendeten, und wir danken den BioMEMS Resource Center (Mehmet Toner, Regisseur) für die Silizium-Wafer verwendet werden, um Schimmel PDMS-Kanal Repliken zu erstellen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AutoCAD AutoDesk
Transparency Mask Fineline Imaging Inc.
SU-8 Photoresist MicroChem Corp. 2050
Dektak Profilometer Veeco Instruments, Inc.
Petri Dish BD Biosciences 351058
PDMS Silicone Elastomer Kit Dow Corning Sylgard 184, Material Number (240)4019862
Vacuum Desiccator Jencons 250-030
Vacuum Pump Alcatel Vacuum Technology 2010 C2
Vacuum Regulator Cole-Parmer EW-00910-10
Oven Thermo Fisher Scientific, Inc. Lindberg Blue M, OV800F
Biopsy Punch, 0.75 mm Harris Uni-Core 15072
Laboratory Corona Treater Electro-Technic Products Inc. BD-20AC, SKU 12051A
Glass Slides Gold Seal 3010
Aquapel PPG Industries Alternative Strategy
Polystyrene Microspheres, 9.9 μm Thermo Fisher Scientific, Inc. G1000
OptiPrep Sigma-Aldrich D1556 Not Demonstrated
Luer-Lok Syringes BD Biosciences 1 mL: 309628 3 mL: 309585
FC-40 Fluorocarbon Oil 3M Inc. Sigma Aldrich, F9755
PFPE-PEG Fluorosurfactant RainDance Technologies
Light Mineral Oil PTI Process Chemicals 08042-47-5 Alternative Strategy
Mineral Oil Surfactant Evonik Goldschmidt Corporation ABIL EM 90 Alternative Strategy
Tygon PVC Tubing Small Parts, Inc. TGY-010
30 Gauge Luer-Lok Syringe Needle, 1/2" Small Parts, Inc. NE-301PL-C
Inverted Microscope Carl Zeiss Imaging Axio Observer.Z1
High Speed Camera Vision Research Phantom V310
Syringe Pumps (2) Chemyx Inc. Nexus 3000
Silicone Oil Dow Corning 200 fluid, 10 cSt Optional for Emulsion Storage

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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