High Throughput Single-cel en Multiple-cel Micro-encapsulatie

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

De combinatie van monodisperse druppel generatie met traagheid ordening van cellen en deeltjes, beschrijven we een methode om een ​​gewenst aantal cellen of deeltjes in te kapselen in een enkele druppel op kHz tarieven. We laten zien efficiëntie twee maal groter dan die van niet-geordende inkapseling voor enkel-en dubbel-deeltje druppels.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lagus, T. P., Edd, J. F. High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation. J. Vis. Exp. (64), e4096, doi:10.3791/4096 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

De protocollen in dit hoofdstuk beschrijven de materialen en uitrusting die specifiek gebruikt om de gepresenteerde experimentele resultaten te verkrijgen. Merk op dat alternatieve leveranciers van chemicaliën en apparatuur kan worden gebruikt.

1. Apparaat Fabricage en zachte lithografie

Standaard zachte lithografie technieken, 21 waarvan een aantal zijn gekenmerkt in voorgaande Jove artikelen, werden 22 gebruikt voor het maken polydimethylsiloxaan (PDMS) microkanaal netwerken gebonden aan glas substraten. Naast meester replica schimmel fabricage door SU-8 fotolithografie, kunnen de processen worden uitgevoerd buiten een schone kamer of schone kap, maar stof en deeltjes moet nog steeds worden geminimaliseerd om consistente resultaten te bereiken.

  1. Ontwerp een micro-kanaalraster zoals getoond in figuur 1 AutoCAD (AutoDesk Inc.) Door een derde fabrikant (Fineline Imaging Inc) naar een hoge resolutie (50.000 dpi) trans af te drukkentransparantie masker op Mylar-film of kwarts, waar kanalen zijn transparant op een donkere achtergrond.
  2. Maak een silicium en SU-8 fotolak master voor replica gieten. Kort draaien SU-8 2050 (Microchem) negatieve fotolak met fabrikant aanbevolen rpm op een spin-coater een 52 pm dikke laag op een schone 7,5 cm of 10 cm siliciumplak maken. Na de zachte bakken, rand kraal verwijderen, UV-blootstelling via een contact masker, na blootstelling bakken, ontwikkeling en vloed blootstelling, het meten van de werkelijke dikte van de SU-8 lagen met behulp van een Dektak profilometer (Veeco). Tape de matrijs op de bodem van een 4 "en 5" petrischaal voorbereiding van PDMS replica vormen.
  3. Mix PDMS elastomeer basis met elastomeer verharder (Dow Corning) in een verhouding 10:01 w / w basis voor verharder. Giet goed gemengde PDMS voorloper op het silicium master naar een 2-3 mm uiteindelijke dikte laag te maken. Een mengsel van 20 g elastomeer basis met 2 g hardingsmiddel voldoende 4 "diameter oppervlak.
  4. Plaats de master schimmel en PDMS in vacuüm exsiccator (Jencons) naar de-gas van de niet-uitgeharde PDMS. Met behulp van een drukregelaar (Cole Parmer), langzaam afnemen de kamer gage druk van 0 "Hg tot -27" Hg meer dan 20 minuten om overmatige schuimvorming te voorkomen. Laat het apparaat in de vacuümkamer bij -27 "Hg gedurende 30 minuten of totdat de luchtbellen verdwijnen.
  5. Laat vacuüm en bewegen meester schimmels en PDMS op een 65 ° C oven (Thermo Scientific) voor een minimum van vier uur. De inrichting kan blijven de oven gedurende de nacht uitharding te verbeteren.
  6. Verwijder het apparaat uit de oven en laat het afkoelen. Knip voorzichtig PDMS rond ronde wafer met een precisie mes en schil uit PDMS. Snij inrichting omtrek zoals weergegeven in figuur 1 met een scalpel.
  7. Punch vloeibare poorten (drie per apparaat) in de drie gebieden ronde figuur 1 met een biopsie punch. Voor dit apparaat, gebruik maken van een 0,75 mm buitendiameter punch (Harris).
  8. Houd scotch tape om de bedrukte zijde van de PDMS en de schil aan een te verwijderenstof. Als een kostenbesparend, maar levensvatbaar alternatief voor de conventionele zuurstof plasma-apparaten, 21,22 plasma behandeling van de bedrukte zijde van de PDMS en een schone 3 "x 1" glas microscoopglaasje met behulp van een hand-held laboratorium corona treater (Electro-Technic Products Inc .). 23 Merk op dat dit apparaat gebruikt moet worden in een zuurkast of een goed geventileerde ruimte te wijten aan ozon ontslag, en alle horloges en mobiele telefoons moeten minstens tien meter afstand worden gehouden. Pas de corona-ontlading tot een stabiele corona te bereiken met een minimum aan vonken. Langzaam zwaaien de elektrode ongeveer 1/4 "boven elk oppervlak ongeveer 20 seconden en onmiddellijk de behandelde oppervlakken in contact brengen van een sterke permanente hechting vormen voor het PDMS oppervlakken naar hun natieve toestand.
  9. Plaats het apparaat op een metalen plaat, plaats op een koele oven, zet de oven voor op 120 ° C, en bak 's nachts om de hechting te voltooien en het PDMS terugkeren naar zijn oorspronkelijke hydrofobe toestand. 24 Tijdens deze hoge temperatuur bakken, thij glas van het kanaal worden gehydrofobeerd door depositie van een dunne hydrofobe laagje op het glas. Als alternatief kan hydrofobe coatings zoals Aquapel (PPG Industries) worden geïnjecteerd in de vloeibare-poorten met een 1 ml spuit en een injectienaald. 12 voorzichtig maar stevig injecteer de Aquapel gevolgd door zuivering lucht in de vloeibare havens zonder het breken van de PDMS om glas bond . Agressief herhaal de ontluchter op alle in-en uitlaat-poorten, terwijl het afvegen overtollige Aquapel om alle deposito's die zouden kunnen verstoppen en de kanalen op het drogen te voorkomen.

2. Monstervoorbereiding

  1. Maak een celkweek volgens vaste procedures voor het door u gekozen celtype. Voor het specifieke apparaat dat wordt gebruikt in dit onderzoek, dient 8-15 micrometer deeltjes of cellen adequaat te bestellen voor inkapseling. Kleiner of groter celtypen kan een wijziging van de afmetingen van de focussering kanaal voldoende Re p bereiken. Voor het meThOD demonstratie resultaten zijn weergegeven in dit document wordt onder 9,9 micrometer polystyreen microsferen (G1000, Thermo Scientific) gebruikt als cel surrogaten.
  2. Bereid de waterige deeltje of celsuspensie door middel van voorzichtig mengen. Bij gebruik cellen of polystyreen deeltjes concentratie in essentieel (zie figuur 4) te bereiken ideale volgorde inkapseling. Met behulp van eerdere gegevens 12 als een gids, de berekening van de gewenste cel of deeltjesconcentratie op basis van de bestelde treinen afstand en micro-kanaals formaat als: een cel of deeltje per verwachte lengte trein afstand keer de nadruk kanaal doorsnede. Als de voorraad concentratie (1% w / w) onvoldoende is, verhogen de concentratie (hier tot 1,5% w / w) door voorzichtig centrifugeren van het stock sample, het verwijderen van bovendrijvende vloeistof, en opnieuw schorsing van de deeltjes door vortex mengen, of zachter mengen bij gebruik cellen. Bereid een voldoende volume om rekening te houden voor de gewenste collectie volume en voor de werktijd in verband met flow tuning.
  3. Zowel cellen en polystyreen deeltjes een soortelijk gewicht groter dan een. Hoewel niet aangetoond in dit protocol, voor de lange termijn experimenten duren in de orde van vele minuten tot uren, drijfvermogen overeenkomen met de oplossing door het toevoegen van een opgeloste stof, zoals CaCl 2 voor deeltjes of OptiPrep (Sigma-Aldrich) voor de cellen.
  4. Bereid een 10 ml monster van de continue fluorkoolstof oliefase door vermenging van de fluorkoolwaterstof olie FC-40 (3M) en PFPE-PEG blokcopolymeer oppervlakteactieve 25 (2,5% w / w) (Raindance Technologies) in een 15 ml centrifugebuis. Als alternatief kan lichte minerale olie (PTI Werkwijze Chemicals) worden gebruikt met ABIL-EM 90 oppervlakteactieve stof (2,5% w / w) (Evonik Goldschmidt Corporation).

3. Experimentele opstelling

  1. Schakel de omgekeerde optische microscoop (Axio Observer, Zeiss) en high speed camera (Phantom V310, Vision Research). Focus en de kanalen voor klompen en vuil inspecteren door handmatig verplaatsen van het apparaat ofdoor een motor microscooptafel. Sommige kleine vuil kan worden geschoven wanneer vloeistof stroomt door. Voor grote vuil of voor de hand liggende klompen, selecteer een ander kanaal op het toestel zoals puin in de aandacht kanaal kan worden afgebroken bestellen kwaliteit aanzienlijk. Merk op dat klompen vaak kan worden verwijderd onder stroom door te drukken stevig op de PDMS oppervlak boven het getroffen gebied met stompe pincet.
  2. Snijd drie lengtes van de PVC-buis (0,01 "ID/0.03" OD, Tygon) voor de waterige inlaat-, olie-inlaat, en emulsie stopcontact. Om dood volume minimaliseren, knip net genoeg slangen te bereiken vanaf de spuit pompen aan de microscoop podium. Snijd buis eindigt in een hoek van 45 ° om het inbrengen te vergemakkelijken in vloeibare poorten.
  3. Pincet om op de buiseinden in de vloeibare poorten geperforeerd in stap 1 passen en druk aanbrengen van twee 30 gauge stompe uiteinde roestvrijstalen injectienaalden (SmallParts) in de vrije uiteinden van de respectieve waterige en olie inlaatbuizen (geen lijm nodig) . Plaats de uitlaat slang in een verspilling reservoir. Deze buis zal later worden verplaatst naar een opvangbak.
  4. Plaats het apparaat en de bijgevoegde slang aan op de microscoop podium, uitlijnen en richten zich op het apparaat met behulp van een mondstuk beschikbare objectieve (20x werd gebruikt voor dit experiment). Pas voor K hler verlichting en andere microscoop instellingen zoals vereist voor een optimale opname.
  5. Vul een 1 ml injectiespuit (BD) met goed gemengde waterige fase en een 3 ml spuit (BD) de oliefase bereid in stap 2. Merk op dat alle spuiten van een volume kan worden gebruikt en dienen zorgvuldig te worden geselecteerd afhankelijk van de gewenste doorlooptijden en minimalisering van eventuele pulsatiliteit. Verticaal kantelen een spuit en beweeg om luchtbellen te verplaatsen naar de spuit stopcontact. Duw langzaam zuiger genoeg om de lucht te duwen om de spuit. Houd de spuit verticaal, sluit de spuiten aan de respectieve naald reeds aan het apparaat in stap 3.3. Druk de zuiger om de lucht te dwingen door middel van de naald dood volume totdat de vloeistof is pushed door de slang bijna op het apparaat. Veilig te monteren tegen de spuit om een ​​injectiepomp (Nexus 3000, Chemyx) en trek de zuiger blok. Herhaal aansluitingen voor de tweede spuit en monteren op een tweede spuit pomp.
  6. Vermogen van elke pomp en spuit programma met behulp van de pomp fabrikant protocollen. Stel de eerste debiet Q olie = 50 pl / min en Q aq = 5 ul / min voor de oliefase en waterfase respectievelijk. Start de pompen.
  7. Wacht tot alle vloeistof om het apparaat in te voeren en de kanalen te vullen, te duwen resterende dode lucht. Dit kan enkele minuten duren. Als er een grote hoeveelheid lucht in de inlaat slang, tijdelijk verhogen elk debiet tot de lucht verdreven. Niet meer het debiet zo hoog dat grote druk optreden in het kanaal, kan leiden tot PDMS op glas losraakt.
  8. Met behulp van de initiële stroomsnelheden, bestudeer de vorming van druppels aan de spuitkop (resultaten hier weergegeven: 20x magnification, frame rate 21.005 fps, blootstelling 3 ps). Verminder de camera gezichtsveld om alleen het pijpje in de frame rate te maximaliseren en het geheugen te verminderen indien mogelijk. Leg sample video's en bevestigen dat de sampling rate is voldoende om aliasing te voorkomen.
  9. Om te voorkomen dat jetting (zie figuur 2), te beginnen met een laag water debiet. Verhoog langzaam het water debiet te observeren ordening van de deeltjes op de lange waterige oplossing kanaal als het debiet toeneemt.
  10. Als de deeltjes concentratie te laag is om treinen te voorzien van relatief weinig "ontbrekende" deeltjes en het monster werd niet geëvenaard drijfvermogen, fysiek kantelt de spuit pomp in de richting van de spuit-uitgang aan te bieden geleidelijk bezinken van deeltjes in de richting van de spuit stopcontact. Deze methode blijkt in de video protocol. Van tijd tot tijd het draaien van de spuit om zijn as kunnen ook de ongewenste vestiging.
  11. Als voldoende bestellen gebeurt, past u de olie debiet naar de generatie frequentie af te stemmen engrootte van druppels. De gemiddelde daling van het volume kan worden berekend met de waterige debiet gedeeld door de daling van generatie frequentie zoals gemeten door video-opname. Iteratief aan te passen beide debieten tot de gewenste inkapseling tarieven en daling volumes te bereiken.
  12. Zodra een stabiele besteld inkapseling wordt bevestigd, beweegt u de afvoer slang van het afval reservoir in een verzameling reservoir of stop het in een ander apparaat voor verdere testen.
  13. Bepaal de verzameling tijd op basis van gewenste aantal druppels en de berekende generatie frequentie.
  14. Neem de fractie van druppels met 0, 1, 2, ..., N deeltjes efficiency kwantificeren behulp van druppel generatie video resultaten of pipetteren een monster opgevangen emulsie voor inspectie.

4. Representatieve resultaten

De resultaten worden gepresenteerd die bereiken zowel gecontroleerde single-deeltjes en gecontroleerde dubbele deeltjes inkapseling (figuur 3). Bij het snijdende FC-40 olie debiet in de helft, single-deeltje inkapseling wordt twee-deeltjes inkapseling. Omgekeerd zouden we hebben het waterige debiet om deeltjes te leveren aan de nozzle sneller, maar we hebben ook zouden hebben verhoogd het risico van jetting van de waterige stroom. Histogrammen in Figuur 3 presenteert de fractionele aantal deeltjes per druppel voor de twee gevallen, samen met vergelijkingen met Poisson statistiek. Incidenteel druppels met nul deeltjes voornamelijk te wijten aan "missing" deeltjes in de geordende treinen, terwijl wanneer er meer ingekapselde deeltjes dan gewenst resultaat van middelbare deeltjesconcentraties en deeltjes die soms migreren naar een van de twee verticale gericht posities. Merk op dat drijfvermogen bijpassende zoals beschreven in paragraaf 2 werd niet benut. In plaats daarvan werd spuitpomp fysiek gekanteld om bezinking van deeltjes naar de uitlaat spuit, waardoor een hoge concentratie van deeltjes tijdens het experiment.

figuur 4. Zonder volledige bestelling, zijn lokale groepen van deeltjes orde en ingekapseld, maar veel druppels zijn zonder deeltjes. Een histogram toont de verminderde inkapseling efficiëntie voor de gewenste twee deeltjes inkapseling.

Figuur 1
Figuur 1. Encapsulation apparaat. a) Algemene apparaat met inhammen, uitlaat, en de lange bestellen kanaal. Het apparaat hoogte is 52 micrometer en de volgorde kanaalbreedte is 27 micrometer. b) zowel waterige en olie inhammen hebben grote brokstukken filters met gaten in de orde van de bestelprocedure kanaalbreedte voor de vergrote weergave van de olie-inlaat. c) De vergrote weergave toont nozzle gelijk kanaalbreedten 27 urn voor de waterige en oliekanalen, gevolgd door het mondstuk samentrekking van 22 urn en plotselinge expansie een bredere 61 pm kanaal.Merk op dat de afmetingen van de inrichting hier zijn getest met een profilometer na microfabricage en enigszins verschillen in de afmetingen van het masker. Een ware beeld van de bestelling kanaal en het mondstuk zijn online beschikbaar als aanvullende Figuur 1 . De AutoCAD masker bestand is ook opgenomen online als aanvulling op dit manuscript.

Figuur 2
Figuur 2. Hysterese van een druipend aan jetting overgang met een groter toestel (80 micrometer breed x 22 micrometer hoog). a) Bij constante FC-40 debiet (Q olie = 45 pL / min), gestage druppelvorming optreedt bij 10 kHz met behulp van een waterige debiet Q aq = 8 pl / min. Aangezien de waterige stroom langzaam verhoogd tot 10 m &u; L / min, jetting van de waterige vloeistof stroom wordt geactiveerd. b) Wanneer de stroom wordt teruggestuurd naar 8 pl / min jetting verder. Merk op dat voortdurende daling van de vorming kan worden hersteld door het kort te pauzeren de waterige stroom pomp (een pauze van 1 seconde is een typisch voorbeeld).

Figuur 3
Figuur 3. Single-en dubbel-deeltje inkapseling. A) Drop formatie met een cel per druppel (Q olie = 60 pL / min, Q aq = 9 pL / min) met een daling generatie tarief van 6,1 kHz, gemiddelde druppelgrootte van 24,4 pL, en een eencellige capture efficiëntie D k = 79,5% en Pk = 83,7% (λ = 0,95) voor een monster van n d = 517 druppels en n p = 491 deeltjes. b) druppelvorming met twee cellen per druppel wordt eenvoudig bereikt door het verminderen van de FC-40 debiet Q olie tot 30 μL / min. De grotere (39,8 pL) druppels worden gevormd met een snelheid van 3,8 kHz met een twee-cel vangdoelmatigheid D k = 71,5% en Pk = 79,5% (λ = 1,80) voor een monster van n d = 383 druppels en n p = 689 deeltjes. cd) twee staven vergelijken met de daling van inkapseling deeltje efficiëntie D k van de bestelde enkel-en dubbel-deeltje inkapseling met Poisson statistieken (willekeurige inkapseling). Merk op dat voor beide gevallen deeltjes afstand in de stromingsrichting ongeveer 17-18 pm voor volledig geordende, afwisselend deeltjes. Aanvullende video's met zowel single-en double-deeltje inkapseling zijn online beschikbaar. Klik hier om aanvullende Movie 3 bis te bekijken . Klik hier om aanvullende Movie 3b te bekijken .


Figuur 4. Concentratie van grote invloed op inkapselefficiëntie. A) Als de concentratie afneemt, volledige bestelling doet zich niet voor, en dus "gaten" in de treinen komen, waardoor er enkele druppels met minder dan verwacht deeltjes. B) Het histogram van de afname van de efficiëntie laat zien ( D k = 55,9%, Pk = 70,9%) voor twee-deeltjes inkapseling door een lagere waarde van λ = 1,57 waar nagenoeg evenveel enkele druppels deeltjes als er twee-deeltjes druppels. Dit cijfer resultaten Q olie = 30 pl / min en Q aq = 9 pl / min, dezelfde stromingsomstandigheden als voor figuur 3b. Een vertegenwoordiger aanvullende video is online beschikbaar. Klik hier om aanvullende Movie 4 te bekijken .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ondanks de relatief hoge mate van bestellen, zullen niet alle druppels bevatten het juiste aantal deeltjes of cellen. Inkapselefficiëntie kan worden berekend als het aantal cellen of deeltjes die raken ingekapseld in druppels met de gewenste bezetting gedeeld door hun aantal. Deze ruwe data kunnen worden verkregen bij een geautomatiseerde high speed video-algoritme of van beeldvorming een monster van de verzamelde emulsie. Dit kan vergeleken worden met de fractie deeltjes Pk ingekapseld in een druppel met k deeltjes en de fractie van druppels D k zou bevatten k deeltjes. Uit figuur 3, zowel de enkele en dubbele deeltjes inkapseling efficiëntie beter presteren dan willekeurige inkapseling efficiëntie door meer dan een factor twee en in hoge mate het aantal druppels te verminderen met meer dan het gewenste aantal deeltjes Figuur 4 toont de noodzaak voor een goede concentratie voor een hoog rendement.; dat wil zeggen & lambd a;, een functie van zowel de deeltjes concentratie druppel volume moet gelijk of nabij het gewenste aantal cellen per druppel te kunnen ingekapselde deeltjes of cellen maximaliseren. Merk op dat een hogere concentratie van deeltjes of cellen is meestal een goede zaak voor de volledige bestelling zo dicht treinen hebben de neiging om zich te verspreiden in de tijd en leger regio's tussen de treinen te vullen. Anderzijds, als de concentratie te hoog is, kan het grote aantal deeltjes veroorzaken grensvlak instabiliteit die induceren jetting aan het mondstuk. In specifieke studies (zoals eencellige inkapseling bijvoorbeeld), kan het gunstiger meercellige druppels voorkomen ten koste van de invoering van een paar druppeltjes leeg, waardoor een iets lagere λ wordt gewenst. Dit geldt ook voor onderzoek gericht op interacties tussen twee cellen of tussen een cel en een deeltje, waarbij enkele deeltje of een cel druppeltjes zijn verdragen dan druppels met twee of meer van een soort cel of deeltje.

jove_content "> Het handhaven van een constante λ loop van de tijd is van cruciaal belang voor een consistente inkapseling. drijfvermogen bijpassende helpt bij het op lange termijn controle van de concentratie door het verminderen van de afwikkeling van cellen en deeltjes in de spuit en slangen. echter het drijfvermogen ook bijpassende resulteert in een hogere waterige viscositeit die kan vertraging te bestellen (wat resulteert in meer focussen kanaal eisen), verhoging van het kanaal drukval, en verander de debieten die nodig zijn voor druppel generatie. Een alternatief voor het drijfvermogen die passen in dit experiment is om fysiek kantelen de spuit pomp, zodat de spuit uitlaat wordt gewezen bijna verticaal omlaag (om de hechting van cellen of deeltjes minimalisering spuit inrichting). Hier wordt gebruikt 9,9 urn diameter microsferen met een deeltjesgrootte volumefractie van 1,3% (ongeveer 25 miljoen deeltjes per ml), maar gebruikt kantelen naar volumegehalten verhogen 2% van de gegevens in fig. 3. Een tweede alternatief is het mengen van de waterige vloeistof intermittently met een gesloten roestvrij stalen kogellagers (teflon gecoat voor het werken met cellen) met behulp van een kleine externe magneet. Lijn is echter nodig om te voorkomen dat het kogellager bezinken de spuit waar hij de ingang van de inlaat af te sluiten leidingen. Echter, deze alternatieven zijn meer arbeidsintensief en minder herhaalbare dan drijfvermogen matching, zodat het drijfvermogen matching het meest geschikt is voor grotere schaal experimenten zich op de lange termijnen. Terwijl inertiële bestellen vereist hoge Re en Re p te bedienen, wanneer de waterige en olie stromen worden hoger en hoger duwde, gestage druipend van druppels de beurt aan jetting 14 (zie figuur 2) en ongecontroleerde inkapseling resultaten. Voor cellen kleiner dan de 10 micrometer deeltjes hier gebruikt wordt, kunnen kleinere kanaal afmetingen nodig om voldoende Re p bereiken indien het debiet niet kan worden verhoogd zonder jetting. Een eigenaardigheid van jetting in microfluïdische systemen is dat hysterese-effecten kunnen optreden which bemoeilijken stoppen jetting door eenvoudig het verlagen van de waterige stroom eenmaal gebeurt op een punt waar het niet waargenomen. Op basis van experimentele resultaten, zou men het ontwikkelen van een dimensionaal of niet-dimensionale druipend aan jetting stroom kaart zoals die eerder voor co-axiale vloeiende sproeiers 14 en T-kruisingen 26-28 met extra contouren voor drop generatie tarief, cellen per druppel, en inkapselefficiëntie. Deze kaart zou een robuuste stappenplan waaruit de druppel generatie tarief kan worden voorspeld λ berekenen en dus zorgen voor een geschatte debiet voor water en olie stromen a priori.

Hoewel niet direct hier aangetoond zal extra vermindering oliedebiet Q olie van die in figuur 3b verder verhogen van het aantal deeltjes per druppel drie, vier, enzovoort. Om meer deeltjes per druppel te bereiken, moet ofwel Q olie te verlagen of de AQUexportgerichte bedrijven debiet Q aq moet toenemen. Even terzijde, hebben wij een online aanvullende MATLAB script die de inkapseling efficiëntie van het vastleggen van een willekeurig aantal deeltjes in druppels modellen. De gebruiker voert de gemiddelde deeltjesgrootte en deeltjesgrootte afstand afstand standaarddeviatie, dat de mate van ordening modellen. Voor de bestelde treinen, zal de standaarddeviatie klein zijn. Daarnaast is de gebruiker ingangen de gemiddelde druppelgrootte en druppelgrootte standaarddeviatie, die goed is voor de polydispersiteit van drop maten. Raadpleeg het script documentatie voor meer informatie.

Bij verhoging van de waterige stroom of te verkleinen oliedebiet het aantal deeltjes of cellen per druppel het risico van instabiele jetting toeneemt naarmate de respectievelijke stroomsnelheden bij extreme waarden te verhogen. Zo is het maximum aantal bereikt deeltjes / cellen per druppelzal afhangen van het apparaat geometrie en vloeistof eigenschappen. Aangezien deeltjes / cel concentratie en oliedebiet is het aantal deeltjes / cellen per druppel beperkt door bovengrenzen waterige debiet dat moet groot genoeg zijn voor het induceren bestellen maar moet klein genoeg zijn om onstabiele jetting (en beperken afschuiving spanningen op cellen levensvatbaarheid). Als alternatief, gegeven een waterige debiet waarmee bestellen optreedt, moet de olie debiet nog voldoende groot genoeg om te blijven in de druipende regime.

Merk op dat druppel generatie en de druipende om jetting overgang zijn zeer gevoelig voor oppervlakte-actieve stof concentratie. Hoge concentraties oppervlakte de viscositeit van de olie veranderen druppel parameters voor het genereren. Even terzijde, de schaarste aan op grote schaal beschikbaar biocompatibel oppervlakteactieve stoffen voor fluorocarbon olie vormt een grote uitdaging. Momenteel is een commercieel leverancier (Raindance Technologies) bestaat PFPE-PEG blokcopolymeer oppervlakteactieve 25 Maar studies tonen aan kleinschalige synthese technieken van een aantal oppervlakte-actieve groepen, zoals PFPE-HEG. 29,30 Alternatieven zoals lichte minerale olie zijn gebruikt in de biologische daling generatie toepassingen tot een breder scala van beschikbare oppervlakte-actieve stoffen, 24,31 toegang te krijgen maar let op dat de bijbehorende toename van de viscositeit in vergelijking met fluorocarbon olie verandert de druppel generatie parameters. Een recent overzicht beschrijft een 32 groot aantal gepubliceerde continue fase oliën en oppervlakteactieve stoffen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

JE is een uitvinder op een octrooi gebaseerd op de technologie gebruikt in dit manuscript.

Acknowledgements

Wij danken Raindance Technologies voor de steekproef van PFPE-PEG oppervlakte-actieve stof gebruikt in deze studie, en we danken de BioMEMS Resource Center (Mehmet Toner, directeur) voor de silicium wafer mal gebruikt om PDMS kanaal replica's te creëren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AutoCAD AutoDesk
Transparency Mask Fineline Imaging Inc.
SU-8 Photoresist MicroChem Corp. 2050
Dektak Profilometer Veeco Instruments, Inc.
Petri Dish BD Biosciences 351058
PDMS Silicone Elastomer Kit Dow Corning Sylgard 184, Material Number (240)4019862
Vacuum Desiccator Jencons 250-030
Vacuum Pump Alcatel Vacuum Technology 2010 C2
Vacuum Regulator Cole-Parmer EW-00910-10
Oven Thermo Fisher Scientific, Inc. Lindberg Blue M, OV800F
Biopsy Punch, 0.75 mm Harris Uni-Core 15072
Laboratory Corona Treater Electro-Technic Products Inc. BD-20AC, SKU 12051A
Glass Slides Gold Seal 3010
Aquapel PPG Industries Alternative Strategy
Polystyrene Microspheres, 9.9 μm Thermo Fisher Scientific, Inc. G1000
OptiPrep Sigma-Aldrich D1556 Not Demonstrated
Luer-Lok Syringes BD Biosciences 1 mL: 309628 3 mL: 309585
FC-40 Fluorocarbon Oil 3M Inc. Sigma Aldrich, F9755
PFPE-PEG Fluorosurfactant RainDance Technologies
Light Mineral Oil PTI Process Chemicals 08042-47-5 Alternative Strategy
Mineral Oil Surfactant Evonik Goldschmidt Corporation ABIL EM 90 Alternative Strategy
Tygon PVC Tubing Small Parts, Inc. TGY-010
30 Gauge Luer-Lok Syringe Needle, 1/2" Small Parts, Inc. NE-301PL-C
Inverted Microscope Carl Zeiss Imaging Axio Observer.Z1
High Speed Camera Vision Research Phantom V310
Syringe Pumps (2) Chemyx Inc. Nexus 3000
Silicone Oil Dow Corning 200 fluid, 10 cSt Optional for Emulsion Storage

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zagnoni, M., Lain, G. L. e, Cooper, J. M. Electrocoalescence mechanisms of microdroplets using localized electric fields in microfluidic channels. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 26, 14443-14449 (2010).
  2. Niu, X. Z., Gielen, F., Edel, J. B., deMello, A. J. A microdroplet dilutor for high-throughput screening. Nat. Chem. 3, 437-442 (2011).
  3. Vincent, M. E., Liu, W., Haney, E. B., Ismagilov, R. F. Microfluidic stochastic confinement enhances analysis of rare cells by isolating cells and creating high density environments for control of diffusible signals. Chemical Society reviews. 39, 974-984 (2010).
  4. Huebner, A. Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics. Chemical communications. 1218-1220 (2007).
  5. Love, J. C., Ronan, J. L., Grotenbreg, G. M., van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. A microengraving method for rapid selection of single cells producing antigen-specific antibodies. Nature biotechnology. 24, 703-707 (2006).
  6. Bradshaw, E. M. Concurrent detection of secreted products from human lymphocytes by microengraving: Cytokines and antigen-reactive antibodies. Clin. Immunol. 129, 10-18 (2008).
  7. Liu, W. S., Kim, H. J., Lucchetta, E. M., Du, W. B., Ismagilov, R. F. Isolation, incubation, and parallel functional testing and identification by FISH of rare microbial single-copy cells from multi-species mixtures using the combination of chemistrode and stochastic confinement. Lab on a chip. 9, 2153-2162 (2009).
  8. Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab on a chip. 8, 1265-1272 (2008).
  9. Koster, S. Drop-based microfluidic devices for encapsulation of single cells. Lab on a chip. 8, 1110-1115 (2008).
  10. Kelly, R. T., Page, J. S., Marginean, I., Tang, K., Smith, R. D. Dilution-free analysis from picoliter droplets by nano-electrospray ionization mass spectrometry. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 48, 6832-6835 (2009).
  11. Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biomedical materials. 5, 21001 (2010).
  12. Edd, J. F. Controlled encapsulation of single-cells into monodisperse picolitre drops. Lab on a chip. 8, 1262-1264 (2008).
  13. Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied Physics Letters. 82, 364 (2003).
  14. Utada, A., Fernandez-Nieves, A., Stone, H., Weitz, D. Dripping to Jetting Transitions in Coflowing Liquid Streams. Physical Review Letters. 99, (2007).
  15. Chabert, M., Viovy, J. L. Microfluidic high-throughput encapsulation and hydrodynamic self-sorting of single cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3191-3196 (2008).
  16. Segrí, G., Silberberg, A. Radial Particle Displacements in Poiseuille Flow of Suspensions. Nature. 189, 209-210 (1961).
  17. Carlo, D. D. i Inertial microfluidics. Lab on a chip. 9, 3038-3046 (2009).
  18. Carlo, D. D. i, Edd, J., Humphry, K., Stone, H., Toner, M. Particle Segregation and Dynamics in Confined Flows. Physical Review Letters. 102, (2009).
  19. Humphry, K. J., Kulkarni, P. M., Weitz, D. A., Morris, J. F., Stone, H. A. Axial and lateral particle ordering in finite Reynolds number channel flows. Physics of Fluids. 22, 081703 (2010).
  20. Lee, W., Amini, H., Stone, H. A., Carlo, D. D. i Dynamic self-assembly and control of microfluidic particle crystals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22413 (2010).
  21. Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane. Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).
  22. Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J. Vis. Exp. (8), e319 (2007).
  23. Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a chip. 6, 1548-1549 (2006).
  24. Hatch, A. C. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab on a chip. 3838-3845 (2011).
  25. Holtze, C. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a chip. 8, 1632-1639 (2008).
  26. Garstecki, P., Stone, H., Whitesides, G. Mechanism for Flow-Rate Controlled Breakup in Confined Geometries: A Route to Monodisperse Emulsions. Physical Review Letters. 94, (2005).
  27. Garstecki, P., Fuerstman, M. J., Stone, H. A., Whitesides, G. M. Formation of droplets and bubbles in a microfluidic T-junction-scaling and mechanism of break-up. Lab on a chip. 6, 437-446 (2006).
  28. Nie, Z. Emulsification in a microfluidic flow-focusing device: effect of the viscosities of the liquids. Microfluidics and Nanofluidics. (2008).
  29. Holt, D. J., Payne, R. J., Chow, W. Y., Abell, C. Fluorosurfactants for microdroplets: interfacial tension analysis. Journal of colloid and interface science. 350, 205-211 (2010).
  30. Holt, D. J., Payne, R. J., Abell, C. Synthesis of novel fluorous surfactants for microdroplet stabilisation in fluorous oil streams. Journal of Fluorine Chemistry. 131, 398-407 (2010).
  31. Hatch, A. C., Fisher, J. S., Pentoney, S. L., Yang, D. L., Lee, A. P. Tunable 3D droplet self-assembly for ultra-high-density digital micro-reactor arrays. Lab on a chip. 11, 2509-2517 (2011).
  32. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a chip. 12, 422-433 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics