Não-plasma Colagem de PDMS para Fabricação barato e de dispositivos microfluídicos

Biology
 

Summary

Neste vídeo mostramos como usar o dispositivo neurônio microfluídicos sem ligação plasma.

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Harris, J., Lee, H., Vahidi, B., Tu, C., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (9), e410, doi:10.3791/410 (2007).

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Abstract

Neste vídeo, que demonstram como usar o dispositivo neurônio microfluídicos sem ligação plasma. Em alguns casos pode ser desejável para dispositivos reversivelmente vínculo com a tampa de vidro Corning No. 1. Isto pode ser devido, talvez, para um aspirador de plasma não estar disponível. Em outros casos, pode ser desejável para remover o dispositivo a partir do vidro após a cultura de neurônios para certos tipos de microscopia ou para imunomarcação, embora não seja necessário remover o dispositivo para a imunocoloração desde os neurônios podem ser marcadas no dispositivo. Alguns pesquisadores, no entanto, ainda preferem remover o dispositivo. Neste caso, a ligação reversível do dispositivo para a tampa de vidro torna isso possível. Existem algumas desvantagens para não-plasma de ligação dos dispositivos em que não tão apertado de um selo é formado. Em alguns casos, os axônios podem crescer sob os sulcos, em vez de através deles. Além disso, como o vidro e PDMS são hidrofóbicos, os líquidos não são facilmente entrar no dispositivo tornando-se necessário, por vezes, à força da mídia e outros reagentes para o dispositivo. Líquidos entrará no dispositivo através de ação capilar, mas leva muito mais tempo, em comparação com dispositivos que foram coladas plasma. O limpador de plasma cria taxas temporárias hidrofílica sobre o vidro e um dispositivo que facilitam o fluxo de líquidos através do dispositivo após a ligação dentro de segundos. Para não-dispositivos de plasma ligada, o fluxo de líquidos através dos dispositivos leva alguns minutos. Também é importante notar que os dispositivos a serem utilizados com os não-plasma de ligação precisam ser esterilizados em primeiro lugar, enquanto que os dispositivos de plasma tratados não precisam ser esterilizados antes de usar, pois o limpador de plasma vai esterilizá-los.

Protocol

Preparar dispositivos microfluídicos para Neuron Cultura de Células

1) Limpe Corning No.1 24 milímetros X 40 milímetros lâminas de vidro

  • Sonicate as lâminas de vidro em uma sonicador banho-maria durante 30 minutos
  • Enxaguar as lâminas de vidro com EtOH 70%
  • Lavagem das lâminas três vezes com dH 2 O
  • Slides seco em uma capa de cultura de tecido por várias horas, preferencialmente durante a noite

Nota: Temos bandejas de metal especial que nós carregamos com os slides. Os slides são separados individualmente e colocados em ranhuras neste rack de metal. Podemos, então, colocá-las nas bandejas de metal em um prato de vidro que se enchem de água local, no sonicador banho de água e sonicado por 30 minutos. Lavagens subseqüentes serão realizadas neste prato.

2) Preparar os dispositivos PDMS

  • Recorte o molde PDMS do wafer de silício, furos no elenco PDSM e do bairro que
  • Limpe os dispositivos PDMS pelo primeiro sopro de gás inerte (argônio ou nitrogênio) através deles. Em seguida, use 3M Scotch 471 Marca fita para retirar todos os restos remanescentes

Nota: É importante manter os dispositivos de face para cima. Inicialmente, quando cortamos o PDMS longe do wafer de silício, o lado em contato com o wafer é o lado limpo: contém os canais microfluídicos. Tentamos ser tão cuidadoso quanto podemos para não danificar o dispositivo e mantenha a face limpa até estamos prontos para colagem plasma.

  • Dispositivos autoclave em recipientes de plástico
  • Após autoclavagem, limpa No. 1 lâminas de vidro Corning e plasma tratar de dispositivos usando um aspirador Harrick plasma da marca, www.harrickplasma.com
  • Colocar os dispositivos limpa lado de baixo na lâmina de vidro.

O dispositivo está ligado ao plasma lâmina de vidro.

3) Revestimento Dispositivos com Poly L-lisina (PLL)

  • PLL é adicionado a um poço em cada lado do dispositivo e permitiu a fluir através de dentro do poço próximo

=> 150 mL de PLL para os poços grandes e 30 μ l PLL para os poços menores. Ele não tem que ser exato, desde que os poços estão cheios.

Nota: Se você olhar para um dispositivo você verá 4 poços: a cada dois estão ligados. Você quer colocar o PLL em um bem de modo que ele irá fluir através do dispositivo no poço próximo.

  • Permitir que o PLL a fluir através do dispositivo por cerca de 10 minutos e depois adicionar mais PLL aos poços para preenchê-los
  • Coloque dispositivos que contêm PLL em uma incubadora a 37 ° C por um mínimo de 4 horas (overnight é preferível)
  • Vácuo o PLL excesso após o tratamento, mas tome cuidado para não sugar todo o líquido para fora do dispositivo

Nota: Você não quer introduzir bolhas de ar para os canais ou câmara. Apenas o vácuo PLL excesso nos poços.

  • Adicionar autoclavado dH 2 O a cada poço de cada lado do dispositivo, e permitir a fluir para o bem outras por ação capilar

A Figura 1 é um diagrama de um dispositivo micro. Observe como o Blue (Soma lado) está conectado ea Red (lado axonal) são ligados. Quando dizemos que colocar o PLL, água ou ou mídia, em um poço em cada lado do dispositivo, o que queremos dizer, por exemplo, é: Coloque 150 ul de autoclavado dH 2 O em um Poço Azul em seguida, coloque 150 mL de autoclavado dH 2 0 em um Red Well. A água (ou PLL, ou Media, ou células) irá fluir através do dispositivo para o bem outras correspondente.

Figura 1

Figura 1

Nota: Por favor note que, de agora em diante, quando eu digo "mídia local, as células, a água ou PLL nos poços TOP", refiro-me ao diagrama acima onde o Soma seria à esquerda e os axônios vai crescer para o direita.

  • Aspirar a água (mais uma vez tomando cuidado para não remover completamente todo o líquido do dispositivo), em seguida, adicione outro mL 150 de autoclavado dH 2 O para uma de cada bem ligado e deixe-a fluir através de correspondentes bem.
  • Coloque o dispositivo contendo dH 2 O em uma incubadora a 37 ° C por 1 hora, em seguida, repita a etapa de lavagem de novo. Lavar os dispositivos três vezes com dH 2 O de uma hora cada, que é o total.

Nota: Devido à possibilidade de que borato do PLL pode absorver no PDMS, alguns no laboratório de incubação Jeon recomendo os dispositivos durante a noite com autoclavado dH 2 O após um par de initial lavagens rápidas. Isso irá garantir que todas as borato livre arbítrio vaza das PDMS antes do carregamento de células. Se isso não for feito, pode haver uma liberação de borato na mídia ao longo do tempo, o que pode levar à toxicidade.

  • Adicionar Neural Mídia Basal (NBM), com os fatores necessários (Glutamax, B27, PenStrep) para os poços topo

Nota: Os dispositivos podem ser incubadas durante a noite e revestida com as células no dia seguinte, ou incubadas um mínimo de três horas com fatores NMB + antes do plaqueamento das células.

Preparar os neurônios Para Carregando nos dispositivos

Nós usamos 18 dias córtex de ratos velhos fetal que quer comprar de uma empresa chamada Bits cérebro ou que é preparado aqui no campus para nós. Nós preferimos pegar o tecido fresco.

  1. Obter uma fetal córtex cerebral (2 pedaços de tecido) armazenados em Hibernate E
  2. Tome 3 pipetas de vidro de comprimento e demiti-los cada um em tamanhos sucessivamente menores usando uma lâmpada de álcool
  3. remoção dos tecidos do Hibernate E com uma pipeta de vidro e coloque em 2 ml de Fatores NMB + em um tubo estéril ml 15.
  4. Trituração: Com uma pipeta de vidro do bulbo e córtex é passado para cima e para baixo cerca de 5 a 10 vezes. Então, a pipeta próximo menor é usado para pipeta cima e para baixo do tecido. Finalmente, o menor pipeta é usado para pipeta cima e para baixo do tecido. Nós gostamos de ter certeza de que não há pedaços visíveis.

    Nota: Recentemente, o Laboratório de Jeon começaram a comparar as células do tecido armazenado em Hibernate E às células que foram preparadas a partir do tecido inicialmente tratados com tripsina a 0,125% em 50% Ca + + livre e Mg + + buffer de dissecção livre. O consenso é que o tecido preparado com tripsina produzir células mais viável do que o tecido colocado inicialmente em Hibernate E. Se você NÃO vai usar o tecido imediatamente, então você precisa para armazenar o tecido em Hibernate E.

    Se você estiver indo para usar o tecido imediatamente e gostaria viabilidade aumentada, depois de tratar o tecido com tripsina antes da trituração mecânica da seguinte forma: 1) diluir 1 ml de tripsina 0,25% (Gibco, Invitrogen) com 1 ml de Ca + + livre Mg + + livre buffer de dissecção (Tripsina final = 0,125%) em um tubo de 15 ml (manter o frio do gelo), 2) de tecido lugar no buffer e imediatamente incubar a 37 ° C por 8 minutos, 3) adicionar 10 ml DMEM/10% FBS para parar o tripsina reação e continuar protocolo abaixo.

  5. Células Centrifugar a 1100 rpm por 1 minuto
  6. Media aspirado cuidadosamente fora o pellet celular
  7. Adicionar 1 ml de fatores NMB + ao sedimento e re-suspenso-lo por pipetagem cima e para baixo
  8. Passe as células re-suspenso por fluxo de gravidade através de um filtro para remover quaisquer grumos (BD célula Falcon 40 coador de nylon um)
  9. Contagem e células da placa:
    • Em um tubo de microcentrífuga, adicionar 60 mL + NMB fatores, 20 l da suspensão celular, e 20 l de azul de tripano em seguida, misture
    • Adicionar cerca de 10 ml desta solução para um hemocitômetro e contar as células vivas (não azul)
    • Ajuste a concentração de 2,5-4,5 x10 6 células / ml

      Nota: Em geral, obtemos uma concentração de cerca de 2,5-4,5 x 106 células / ml. dependendo do volume das células são ressuspendidas em (normalmente 1 ml + NBM B27/Glutamax/PenStrep percortex). Se o tecido foi preparado com tripsina, o rendimento será provavelmente maior.

O revestimento de Dispositivos

  1. Carga células (neurônios primário) em um poço do dispositivo
  2. ML placa 5 por dispositivo pequeno e 20 l por equipamento grande

    Nota: Você pode carregar 10 ml de células na parte superior do dispositivo e 10 ml na parte inferior do dispositivo (volume total de metade), ou diretamente todos os 20 mL de células no bem superior Somal (5 mL na Somal top bem para os dispositivos de pequeno porte).

  3. Incubar por 10 minutos em uma incubadora de 37 ° C para as células pode começar a anexar
  4. Adicionar mL aproximadamente 150/30 de fatores + NMB a cada poço, dependendo do tamanho do dispositivo

    Nota: Os volumes podem variar dependendo da espessura do PDMS. Tudo o que importa é que os poços estão cheios.

Em suplementar usando os dispositivos Sem Plasma Bonding

Sem tratamento de plasma, Christina Tu, um técnico, que faz sucesso a cada semana, sem plasma, diz apenas carregar as células imediatamente.

Lembre-se de remover a mídia de ambos os poços no lado soma (lado axônio não importa se você deixar a mídia in). É o fluxo de fluido que permite que as células a entrar no canal principal. Se você tiver a mídia nos poços, você não vai ter fluxo de fluido.

Discussion

Aqui demonstramos como usar o dispositivo neurônio microfluídicos sem a necessidade de um aspirador de plasma. Referimo-nos a essa ligação como não-plasma.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PDMS Reagent Dow Corning Sylgard 184 with curing agent Please consult Dow Corning to find a vendor near you
Cornig No. 1 Cover Glass Cover Glass Corning Corning No. X2935 244 Available through Fisher Scientific, Fish Catalog number 12-531D
B27 Reagent Invitrogen 17504-044 B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
Glutamax Reagent Invitrogen 35050-061 Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.
60 mm Petri Dish Tool Fisher Scientific 08-757-13A 60 mm polystyrene sterile petri dishes are used to house the device bound to glass.
Poly-L-Lysine Reagent Sigma-Aldrich P-1274
BD Falcon 50 ml Tube Tool BD Biosciences Falcon No. 352098 Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-49A
BD Falcon 15 ml tube Tool BD Biosciences Falcon No. 352097 Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, (4), 2128-2136 (2006).
  2. Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, (8), 599-605 (2005).

Comments

14 Comments

  1. can't view videos?? firefox latest plugins???

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 4, 2007 - 10:33 PM
  2. Hi Ron. I am sorry you are having trouble. To view videos, please make sure that you have the latest version of Flash installed. If you still have problems, please send us an email to support@jove.com with operating system and browser information.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 5, 2007 - 12:48 AM
  3. What protocol do you use when making the PLL solution? 5mg of PLL to 50ml water?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 7, 2008 - 2:47 PM
  4. Hi Lee T
    We dissolve the PLL in borate buffer
    1.²4 g of boric acid and 1.9 g of sodium tetraborate is added to 300 ml of nanopure water (final volume will be 400 ml) and stirred to disolve for about 30 minutes.  Next the pH is adjusted to pH 8.5.  ²00 mg of PLL is added and stirred until disolved.  The final volume is adjusted to 400 ml.  The PLL solution is then sterile filtered and aliquoted into sterile 50 ml tubes in a tissure cutlure hood.  Aliquots are stored at -²0C until use.
    Joseph Harris

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 7, 2008 - 5:57 PM
  5. Just wanted to let everyone know a company is forming to make, sell, and distribute the devices. Email xonamicrofluidics@gmail.com for more information.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 4, 2008 - 1:01 PM
  6. Hi there, it it possible to get a protocol for fixation and staining of neurons in microfluidic chambers? Which method is better for this purpose (fixation and staining), plasma- or non-plasma bonding? Is it possible to remove the microfluidic device without damaging the neurons or dŒs it have to stay on during the procedure? By the way: A really impressive method, fantastic! Looking forward to your answer. Best, Harry

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 6, 2008 - 2:32 PM
  7. Hello Harry Probably the best thing would be for you to check out our company website at http://xonamicrofluidics.com/ We have a protocol there available for download.  It gŒs over staining in the device. Also, if you would like to discuss staining in more detail or have any other questions feel free to email us xonamicrofluidics@gmail.com

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 10, 2008 - 4:46 AM
  8. Hi Harry just to follow up.. The device dŒs not have to be removed for staining. However, if you are interested in visualizing in the mid-region of the grooves then it might not stain very well with the device on.  If you only want to visualize neurons in the main channels or axons just entering or leaving the grooves then staining with the device on is just fine. If you want to get a good stain of the middle of the microgroove region then it is best to remove the device before staining.  This means non-plasma bonding will have to be done as plasma bonding is irreversible. Yes, removing the device can and dŒs damage the neurons.  However, done with care and after some practice it is possible to remove the device and keep most of the sample intact. Some researchers like to fix the cells in the device, place the device on ice for 5 minutes then carefully remove it.  Others just remove the device as carefully as possible prior to staining. Please visit our website http://xonamicrofluidics.com/ for our detailed protocol. Also feel free to email us xonamicrofluidics@gmail.com

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 10, 2008 - 4:55 AM
  9. Hello JŒ, thank you very much for your reply and support. The protocol on http://xonamicrofluidics.com/ which you are refering to is indeed very detailed and helpful. I am now curious to see how my experiments work out. :-) All the best and thanks again, Harry

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 11, 2008 - 5:59 PM
  10. This probably dŒsn't work for non-plasma PDMS-PDMS bonding... or, is there a way to treat one of the PDMS layers as glass?

    Reply
    Posted by: Bryn G.
    September 23, 2009 - 8:05 PM
  11. Hello,

    This was a very good video indeed. Could you please let me know how did you make the wells on the PDMS. They are not micronsized wells that we used to make by replicating form a potolithographed Silicon wafer. Did you use some kind of belt puncher? What is the exact product number and brand of the puncher? I use one to make mm sized well on the PDMS slam, however the edges are not good. Or did you use other technique to make such nicely sheped wells? If I want to make recangular or square shaped wells (² mm length/width and .5-1.0 mm height) on PDMS what could I do? I will appreciate your kind advices.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 31, 2012 - 6:39 PM
  12. Hello Taifur

    The wells are 8 mm in diameter. We have special punches machined to punch the wells. However, you can use 8 mm biopsy punches made by Sklar. VWR or Fisher Sci should have them.

    Reply
    Posted by: Joseph H.
    April 6, 2012 - 12:48 PM
  13. For the cells you receive in Hibernate E from Brain Bits, do you digest them with trypsin or even digest them at all prior to trituration. Why or why not?

    Thanks.

    Reply
    Posted by: Angela D.
    July 4, 2012 - 10:08 PM
  14. For the cells you receive in Hibernate E from Brain Bits, do you digest them with trypsin or even digest them at all prior to trituration. Why or why not?

    Thanks.

    Reply
    Posted by: Angela D.
    July 4, 2012 - 10:10 PM

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