No plasmáticos de unión de PDMS para la Fabricación de bajo costo de los dispositivos de microfluidos

Biology
 

Summary

En este video se muestra cómo utilizar el dispositivo de microfluidos neuronas sin la unión de plasma.

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Harris, J., Lee, H., Vahidi, B., Tu, C., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (9), e410, doi:10.3791/410 (2007).

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Abstract

En este video, que muestra cómo utilizar el dispositivo de microfluidos neuronas sin la unión de plasma. En algunos casos puede ser conveniente a los dispositivos de forma reversible de bonos para el vidrio Corning No. tapa 1. Esto puede ser debido, tal vez, a un limpiador de plasma que no están disponibles. En otros casos, puede ser deseable para quitar el dispositivo de la copa después de que el cultivo de neuronas de ciertos tipos de microscopio o de inmunotinción, aunque no es necesario remover el dispositivo para la tinción de las neuronas ya que se puede teñir en el dispositivo. Algunos investigadores, sin embargo, todavía prefieren a retirar el dispositivo. En este caso, la unión reversible del dispositivo a la cubierta de vidrio hace que sea posible. Hay algunas desventajas de no plasma la unión de los dispositivos en que no tan fuerte de un sello se forma. En algunos casos, los axones pueden crecer en las ranuras en vez de a través de ellos. Además, como el vidrio y PDMS son hidrofóbicos, los líquidos no fácilmente entrar en el dispositivo por lo que es necesario a veces para obligar a los medios de comunicación y otros reactivos en el dispositivo. Líquidos entrarán en el dispositivo a través de la acción capilar, pero tarda mucho más en comparación con los dispositivos que se han plasma en condiciones de servidumbre. El limpiador de plasma crea temporal cargos hidrofílico en el cristal y el dispositivo que facilite el flujo de líquidos a través del dispositivo después de la unión en cuestión de segundos. Para los que no plasma dispositivos vinculados, el flujo de líquido a través de los dispositivos de toma varios minutos. También es importante tener en cuenta que los dispositivos que se utilizan con las organizaciones no plasma la unión deben ser esterilizados en primer lugar, mientras que los dispositivos de plasma tratados no deben ser esterilizados antes de su uso debido a que el limpiador de plasma esterilizarlos.

Protocol

La preparación de dispositivos de microfluídica para el cultivo celular neuronal

1) Limpiar Corning N º 1 de 24 mm X 40 mm portaobjetos de vidrio

  • Sonicar el portaobjetos de vidrio en un baño de ultrasonido agua durante 30 minutos
  • Enjuague el portaobjetos de vidrio con un 70% EtOH
  • Lavar los portaobjetos tres veces con dH 2 O
  • Portaobjetos secos en una campana de cultivo de tejidos durante varias horas, preferiblemente durante la noche

Nota: Hemos bandejas especiales de metal que se carga con las diapositivas. Las diapositivas están separados de forma individual y se coloca en las ranuras de esta rejilla de metal. A continuación, puede colocar las bandejas de carga de metal en un recipiente de vidrio que se llenan de agua, lugar en el baño de ultrasonido de agua, y someter a ultrasonidos durante 30 minutos. Lavados posteriores se llevan a cabo en este plato.

2) Preparación de los dispositivos de PDMS

  • Cortar el molde de PDMS de la oblea de silicio, hacer agujeros en el reparto PDSM y cuarto que
  • Limpiar los dispositivos PDMS primero soplando gas inerte (argón o nitrógeno) a través de ellos. A continuación, utilice la marca 3M Scotch 471 cintas para despegar cualquier residuo restante

Nota: Es importante mantener los dispositivos boca arriba. Al principio, cuando cortamos el PDMS lejos de la oblea de silicio, la superficie en contacto con la oblea es el lado limpio: contiene los canales de microfluidos. Tratamos de ser lo más cuidadoso que nosotros, como puede para no dañar el dispositivo y mantener la cara de la limpieza hasta que estemos listos para la unión de plasma.

  • Dispositivos de autoclave en recipientes de plástico
  • Después del autoclave, limpia No. 1 portaobjetos de vidrio Corning y el tratamiento de plasma-dispositivos que utilizan una marca de limpiador de plasma Harrick, www.harrickplasma.com
  • Coloque los dispositivos de limpieza hacia abajo en el portaobjetos de vidrio.

El dispositivo está ahora en plasma unida a la lámina de vidrio.

3) Los dispositivos de recubrimiento con poli L-lisina (PLL)

  • PLL se agrega a un pozo en cada lado del dispositivo y permite que fluya a través de en el pozo siguiente

=> 150 ml de PLL para los grandes pozos y 30 μ l PLL para los pozos más pequeños. No tiene por qué ser exacta, siempre y cuando los pozos están llenos.

Nota: Si nos fijamos en un dispositivo que se va a ver cuatro pozos: cada dos están conectados. ¿Quieres poner el PLL en un pozo para que fluya a través del dispositivo en el pozo siguiente.

  • Deje que el PLL para el flujo a través del dispositivo durante unos 10 minutos y luego añadir más PLL a los pozos para llenarlos
  • Colocar los dispositivos que contienen PLL en una incubadora a 37 ° C durante un mínimo de 4 horas (una noche es preferible)
  • Aspire el exceso de PLL después del tratamiento, pero tenga cuidado de no aspirar todo el líquido fuera del dispositivo

Nota: No es aconsejable introducir burbujas de aire a los canales o de la cámara. Sólo vacío el exceso de PLL en los pozos.

  • Añadir autoclave dH 2 O a cada bien en cada lado del dispositivo y permitir que fluya hacia el otro pozo por capilaridad

La figura 1 es un diagrama de un dispositivo de microfluidos. Observe cómo el azul (Soma lado) está conectado y el rojo (lado axonal) están conectados. Cuando hablamos de poner el PLL, el agua o los medios de comunicación, en un pozo en cada lado del dispositivo, lo que queremos decir, por ejemplo, es la siguiente: Coloque 150 ul de autoclave dH 2 O en un Pozo Azul y coloque 150 ml de autoclave dH 2 0 en una Red Well. El agua (o PLL, o los medios de comunicación, o células) fluirá a través del dispositivo a la fuente correspondiente otros.

Figura 1

Figura 1

Nota: Tenga en cuenta que, a partir de ahora, cuando digo "los medios de comunicación el lugar, las células, el agua o el PLL en el TOP pozos", me refiero al diagrama de arriba, donde el Soma se encuentra a la izquierda y los axones crecerán a la derecha.

  • Aspirar el agua (de nuevo teniendo cuidado de no eliminar por completo todo el líquido desde el dispositivo), a continuación, añadir otra l 150 de autoclave dH 2 O a uno de cada bien conectados y permitir que fluya a través de la correspondiente así.
  • Coloque el dispositivo que contiene dH 2 O en una incubadora a 37 ° C durante 1 hora, y luego repetir la etapa de lavado de nuevo. Lavar los dispositivos de tres veces con dH 2 O durante una hora cada uno, que es el total.

Nota: Debido a la posibilidad de que el borato de la PLL se puede absorber en el PDMS, algunos en el Laboratorio de Jeon recomienda incubar los dispositivos durante la noche con autoclave dH 2 O después de un par de initial enjuagues rápida. Esto asegurará que todos los boratos se filtre fuera de la PDMS antes de la carga de las células. Si no se hace esto, puede haber una liberación de borato en los medios de comunicación a través del tiempo, lo que podría llevar a la citotoxicidad.

  • Añadir Neural medio basal (NBM), con los factores necesarios (glutamax, B27, Penstrep) a los pozos de alto

Nota: Los dispositivos pueden ser incubados durante la noche y recubierto de células al día siguiente, o se incuban con un mínimo de 3 horas con NMB + factores de las placas, las células.

La preparación de las neuronas de carga en los dispositivos

Utilizamos 18 días de edad corteza de rata fetal que, o bien comprar a una empresa llamada Bits del cerebro y de que se prepara aquí en el campus para nosotros. Nosotros preferimos obtener el tejido fresco.

  1. Obtener una corteza cerebral fetal (2 piezas de tejido) almacenados en Hibernate E
  2. Tomar 3 pipetas de vidrio largo y el fuego a cada uno en tamaños cada vez más pequeños con una lámpara de alcohol
  3. eliminar los tejidos de Hibernate E con una pipeta de vidrio y el lugar en 2 ml de NMB + Factores en un tubo estéril de 15 ml.
  4. La trituración: Con una pipeta de vidrio bombilla y la corteza se pasa arriba y hacia abajo alrededor de 5 a 10 veces. Entonces, la pipeta más pequeño siguiente se utiliza para pipeta y el tejido. Por último, la más pequeña pipeta se utiliza para la pipeta y el tejido. Nos gusta para asegurarse de que no hay trozos visibles.

    Nota: Recientemente, el Laboratorio de Jeon comenzó a comparar las células de los tejidos almacenados en Hibernate E a las células que se han preparado a partir de los tejidos tratados inicialmente con 0,125% de tripsina en el 50% de Ca + + libre y Mg + + buffer disección de forma gratuita. El consenso es que el tejido preparado con tripsina producir células más viable que el tejido situado inicialmente en Hibernate E. Si no se va a utilizar el tejido de inmediato, entonces usted necesita para almacenar los tejidos en Hibernate E.

    Si usted va a utilizar el tejido de inmediato y le gustaría una mayor viabilidad, a continuación, tratar el tejido con tripsina antes de la trituración mecánica de la siguiente manera: 1) se diluye 1 ml de tripsina 0,25% (Gibco, Invitrogen) con 1 ml de Ca + + libre de Mg + + gratis buffer disección (final tripsina = 0,125%) en un tubo de 15 ml (mantener frío el hielo), 2) los tejidos lugar en el buffer e incubar inmediatamente a 37 º C durante 8 minutos, 3) agregar 10 ml DMEM/10% de SFB para detener la tripsina reacción y seguir el protocolo a continuación.

  5. Las células se centrifugan a 1100 rpm durante 1 minuto
  6. Los medios de comunicación aspirado cuidadosamente de la bolita de células
  7. Añadir 1 ml de la NMB + factores de la pastilla y re-suspendido por pipeteando arriba y abajo
  8. Pase la suspensión de células re-por gravedad a través de un filtro para eliminar los grumos (BD Falcon células colador de nylon 40 um)
  9. Conde y células de la placa:
    • En un tubo de microcentrífuga, añadir 60 NMB l + factores, 20 l de suspensión celular, y 20 l de azul de tripano y mezclar
    • Añadir unos 10 l de esta solución a un hemocitómetro y contar las células vivas (no azules)
    • Ajuste la concentración de 2,5 a 4,5 x 10 6 células / ml

      Nota: Por lo general, obtener una concentración de aproximadamente 2,5 a 4,5 x 106 células / ml. dependiendo del volumen de las células se resuspenden en (normalmente 1 ml NBM + B27/Glutamax/PenStrep percortex). Si el tejido ha sido elaborado con la tripsina, la producción probablemente se incrementará.

Revestimiento Los dispositivos

  1. Las celdas de carga (neuronas primarias) en un pozo del dispositivo
  2. Placa de 5 l por dispositivo pequeño y 20 l por aparato grande

    Nota: Puede cargar 10 l de células en la parte superior del dispositivo y 10 l en la parte inferior del dispositivo (volumen total medio), o directamente a todos l 20 de las células en la parte superior y cromosómicas (5 l en la parte superior y cromosómicas para los dispositivos pequeños).

  3. Incubar durante 10 minutos en una incubadora a 37 ° C lo que las células pueden empezar a colocar
  4. Añadir l aproximadamente 150/30 de factores + NMB a cada pocillo, dependiendo del tamaño del dispositivo

    Nota: Los volúmenes pueden variar dependiendo del espesor de la PDMS. Todo lo que importa es que los pozos están llenos.

Suplementario Acerca del uso de los dispositivos sin vinculación Plasma

Sin el tratamiento de plasma, Christina Tu, un técnico, que lo hace con éxito todas las semanas sin plasma, dice que la carga sólo a las células de inmediato.

Recuerde que debe eliminar los medios de comunicación tanto de los pozos en el lado del soma (parte del axón no importa si deja los medios de comunicación). Es el flujo de fluido que permite a las células para entrar en el canal principal. Si usted tiene los medios de comunicación en los pozos, no obtendrá el flujo de fluidos.

Discussion

Aquí se demuestra cómo utilizar el dispositivo de microfluidos neuronas sin necesidad de un limpiador de plasma. Nos referimos a esta unión como no plasma.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PDMS Reagent Dow Corning Sylgard 184 with curing agent Please consult Dow Corning to find a vendor near you
Cornig No. 1 Cover Glass Cover Glass Corning Corning No. X2935 244 Available through Fisher Scientific, Fish Catalog number 12-531D
B27 Reagent Invitrogen 17504-044 B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
Glutamax Reagent Invitrogen 35050-061 Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.
60 mm Petri Dish Tool Fisher Scientific 08-757-13A 60 mm polystyrene sterile petri dishes are used to house the device bound to glass.
Poly-L-Lysine Reagent Sigma-Aldrich P-1274
BD Falcon 50 ml Tube Tool BD Biosciences Falcon No. 352098 Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-49A
BD Falcon 15 ml tube Tool BD Biosciences Falcon No. 352097 Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, (4), 2128-2136 (2006).
  2. Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, (8), 599-605 (2005).

Comments

14 Comments

  1. can't view videos?? firefox latest plugins???

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 4, 2007 - 10:33 PM
  2. Hi Ron. I am sorry you are having trouble. To view videos, please make sure that you have the latest version of Flash installed. If you still have problems, please send us an email to support@jove.com with operating system and browser information.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 5, 2007 - 12:48 AM
  3. What protocol do you use when making the PLL solution? 5mg of PLL to 50ml water?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 7, 2008 - 2:47 PM
  4. Hi Lee T
    We dissolve the PLL in borate buffer
    1.²4 g of boric acid and 1.9 g of sodium tetraborate is added to 300 ml of nanopure water (final volume will be 400 ml) and stirred to disolve for about 30 minutes.  Next the pH is adjusted to pH 8.5.  ²00 mg of PLL is added and stirred until disolved.  The final volume is adjusted to 400 ml.  The PLL solution is then sterile filtered and aliquoted into sterile 50 ml tubes in a tissure cutlure hood.  Aliquots are stored at -²0C until use.
    Joseph Harris

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 7, 2008 - 5:57 PM
  5. Just wanted to let everyone know a company is forming to make, sell, and distribute the devices. Email xonamicrofluidics@gmail.com for more information.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 4, 2008 - 1:01 PM
  6. Hi there, it it possible to get a protocol for fixation and staining of neurons in microfluidic chambers? Which method is better for this purpose (fixation and staining), plasma- or non-plasma bonding? Is it possible to remove the microfluidic device without damaging the neurons or dŒs it have to stay on during the procedure? By the way: A really impressive method, fantastic! Looking forward to your answer. Best, Harry

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 6, 2008 - 2:32 PM
  7. Hello Harry Probably the best thing would be for you to check out our company website at http://xonamicrofluidics.com/ We have a protocol there available for download.  It gŒs over staining in the device. Also, if you would like to discuss staining in more detail or have any other questions feel free to email us xonamicrofluidics@gmail.com

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 10, 2008 - 4:46 AM
  8. Hi Harry just to follow up.. The device dŒs not have to be removed for staining. However, if you are interested in visualizing in the mid-region of the grooves then it might not stain very well with the device on.  If you only want to visualize neurons in the main channels or axons just entering or leaving the grooves then staining with the device on is just fine. If you want to get a good stain of the middle of the microgroove region then it is best to remove the device before staining.  This means non-plasma bonding will have to be done as plasma bonding is irreversible. Yes, removing the device can and dŒs damage the neurons.  However, done with care and after some practice it is possible to remove the device and keep most of the sample intact. Some researchers like to fix the cells in the device, place the device on ice for 5 minutes then carefully remove it.  Others just remove the device as carefully as possible prior to staining. Please visit our website http://xonamicrofluidics.com/ for our detailed protocol. Also feel free to email us xonamicrofluidics@gmail.com

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 10, 2008 - 4:55 AM
  9. Hello JŒ, thank you very much for your reply and support. The protocol on http://xonamicrofluidics.com/ which you are refering to is indeed very detailed and helpful. I am now curious to see how my experiments work out. :-) All the best and thanks again, Harry

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 11, 2008 - 5:59 PM
  10. This probably dŒsn't work for non-plasma PDMS-PDMS bonding... or, is there a way to treat one of the PDMS layers as glass?

    Reply
    Posted by: Bryn G.
    September 23, 2009 - 8:05 PM
  11. Hello,

    This was a very good video indeed. Could you please let me know how did you make the wells on the PDMS. They are not micronsized wells that we used to make by replicating form a potolithographed Silicon wafer. Did you use some kind of belt puncher? What is the exact product number and brand of the puncher? I use one to make mm sized well on the PDMS slam, however the edges are not good. Or did you use other technique to make such nicely sheped wells? If I want to make recangular or square shaped wells (² mm length/width and .5-1.0 mm height) on PDMS what could I do? I will appreciate your kind advices.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 31, 2012 - 6:39 PM
  12. Hello Taifur

    The wells are 8 mm in diameter. We have special punches machined to punch the wells. However, you can use 8 mm biopsy punches made by Sklar. VWR or Fisher Sci should have them.

    Reply
    Posted by: Joseph H.
    April 6, 2012 - 12:48 PM
  13. For the cells you receive in Hibernate E from Brain Bits, do you digest them with trypsin or even digest them at all prior to trituration. Why or why not?

    Thanks.

    Reply
    Posted by: Angela D.
    July 4, 2012 - 10:08 PM
  14. For the cells you receive in Hibernate E from Brain Bits, do you digest them with trypsin or even digest them at all prior to trituration. Why or why not?

    Thanks.

    Reply
    Posted by: Angela D.
    July 4, 2012 - 10:10 PM

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