Non-Plasma-Bonding von PDMS für preiswerte Herstellung von Mikrofluidik-Geräte

Biology
 

Summary

In diesem Video zeigen wir, wie der Neuron Mikrofluidikvorrichtung ohne Plasma Bindung verwenden.

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Harris, J., Lee, H., Vahidi, B., Tu, C., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (9), e410, doi:10.3791/410 (2007).

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Abstract

In diesem Video zeigen wir, wie man das Neuron Mikrofluidikvorrichtung ohne Plasma Bindung verwenden. In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, reversibel Bindung Geräte mit dem Corning Nr. 1 Deckglas. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, vielleicht, um ein Plasma-Reiniger nicht zur Verfügung steht. In anderen Fällen kann es wünschenswert sein, das Gerät aus dem Glas zu entfernen, nachdem die Züchtung von Neuronen für bestimmte Arten der Mikroskopie oder Immunfärbung, obwohl es nicht notwendig ist, um das Gerät für Immunfärbung, da die Neuronen in das Gerät gefärbt werden können entfernen. Einige Forscher, aber immer noch lieber auf das Gerät zu entfernen. In diesem Fall macht reversible Bindung des Gerätes an das Deckglas, das möglich ist. Es gibt einige Nachteile auf Nicht-Plasma-Bindung der Geräte in die nicht so dicht an einer Dichtung gebildet wird. In einigen Fällen Axone kann unter den Rillen statt durch sie zu wachsen. Auch, weil das Glas und PDMS hydrophob sind, tun Flüssigkeiten nicht ohne weiteres in das Gerät eindringen macht es notwendig sein, um Medien und anderen Reagenzien in das Gerät zu erzwingen. Flüssigkeiten wird das Gerät durch Kapillarwirkung geben, aber es dauert wesentlich länger als im Vergleich zu Geräten, Plasma gebunden gewesen. Die Plasma-Reiniger temporäre hydrophile Ladungen auf der Glas-und Gerät, das den Durchfluss von Flüssigkeiten über das Gerät zu erleichtern nach der Verklebung innerhalb von Sekunden. Für Nicht-Plasma-Geräte gebunden, nimmt Flüssigkeit durch die Geräte mehrere Minuten dauern. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Geräte mit den Nicht-Plasma verwendet werden Verklebung müssen zuerst sterilisiert werden, während Plasma behandelt Geräte müssen sich nicht vor Anwendung sterilisiert werden soll, weil das Plasma Reiniger sie abzutöten ist.

Protocol

Vorbereitung Mikrofluidiksysteme Für Neuron Cell Culture

1) Reinigen Corning No.1 24 mm X 40 mm Glasplättchen

  • Mit Ultraschall die Glasträger in einem Wasserbad Sonicator für 30 Minuten
  • Spülen Sie das Glas-Objektträger mit 70% EtOH
  • Waschen Sie die Objektträger dreimal mit dH 2 O
  • Dry Folien in einer Gewebekultur Haube für mehrere Stunden, am besten über Nacht

Hinweis: Wir haben spezielle Metall-Schalen, die wir mit den Schlitten zu laden. Die Folien sind einzeln und getrennt platziert in die Schlitze in das Metallgestell. Wir können dann diese Metall-Be-Trays in einer Glasschale, dass wir mit Wasser, in das Wasser Ultraschallbad zu füllen, und beschallen für 30 Minuten. Nachfolgende Waschungen sind in diesem Gericht durchgeführt.

2) Vorbereitung der PDMS-Geräte

  • Schneiden Sie die PDMS Form aus dem Silizium-Wafer, Löcher stanzen in der PDSM gegossen und Quartal ist
  • Reinigen Sie die PDMS-Geräten, indem Sie zuerst weht Inertgas (Argon oder Stickstoff) über sie. Dann nutzen Sie 3M Scotch Brand Tape 471 zum Abheben alle Reste

Hinweis: Es ist wichtig, dass die Geräte nach oben. Anfangs, als wir die PDMS abgeschnitten von der Silizium-Wafer, ist die Seite in Kontakt mit dem Wafer der sauberen Seite: Sie enthält die mikrofluidischen Kanälen. Wir versuchen, so vorsichtig wie wir als nicht beschädigen kann, um das Gerät, und halten Sie die saubere Seite nach oben, bis wir bereit für Plasma-Bindung sind.

  • Autoclave Geräte in Kunststoff-Behältern
  • Nach dem Autoklavieren, saubere Nr. 1 Corning Glasträger und Plasma-treat-Geräte mit einem Harrick Marke Plasma-Reiniger, www.harrickplasma.com
  • Platzieren Sie die Geräte sauber nach unten auf die Glasplatte.

Das Gerät ist nun Plasma gebunden an das Glas gleiten.

3) Beschichtung Die Geräte mit Poly-L-Lysin (PLL)

  • PLL ist es, eine gut auf jeder Seite des Gerätes zugegeben und durch in den nächsten gut fließen

=> 150 ul PLL für den großen Brunnen und 30 μ l PLL für die kleineren Brunnen. Es muss nicht exakt sein, solange der Brunnen voll sind.

Hinweis: Wenn Sie an einem Gerät schauen, werden Sie 4 Brunnen sehen: jeweils zwei miteinander verbunden sind. Sie wollen die PLL in einem gut so, dass es durch das Gerät in den nächsten gut fließen gebracht.

  • Lassen Sie die PLL durch das Gerät für etwa 10 Minuten fließen und fügen Sie dann weitere PLL um den Brunnen, um sie aufzufüllen
  • Platzieren Sie die Geräte mit PLL in einem Brutschrank bei 37 ° C für mindestens 4 Stunden (über Nacht ist vorzuziehen)
  • Vacuum das überschüssige PLL nach der Behandlung, aber darauf achten, nicht die gesamte Flüssigkeit saugen aus dem Gerät

Hinweis: Sie wollen nicht, um Luftblasen zu den Kanälen oder Kammer einzuführen. Nur Vakuum das überschüssige PLL in die Vertiefungen geben.

  • Add autoklaviert dH 2 O in jede Vertiefung auf beiden Seiten des Gerätes, und lassen Sie die anderen auch durch Kapillarwirkung fließen

Abbildung 1 ist ein Diagramm eines mikrofluidischen Gerät. Beachten Sie, wie die blaue (Soma auf dieser Seite) angeschlossen ist und die Red (Axonal auf dieser Seite) verbunden sind. Wenn wir sagen, setzen die PLL, oder Wasser oder Medien, auf der einen sowie auf jeder Seite des Gerätes, was wir meinen, ist zum Beispiel: Platz 150 ul autoklaviertem dH 2 O in einem Blau Na dann statt 150 ul autoklaviert dH 2 0 in einem Red Well. Das Wasser (oder PLL, oder Media, oder Zellen) werden durch das Gerät mit dem anderen entsprechenden gut fließen.

Abbildung 1

Abbildung 1

Hinweis: Bitte beachten Sie, dass von nun an, wenn ich sage "Platz Medien, Zellen-, Wasser-oder PLL in die TOP Brunnen", I, um das Diagramm oben, wo der Soma würde auf der linken Seite und die Axone beziehe mich wird das Wachstum rechts.

  • Absaugen des Wassers (wieder darauf achten nicht vollständig entfernen Sie die Flüssigkeit aus dem Gerät), dann fügen Sie eine weitere 150 ul autoklaviert dH 2 O zu einer jeden angeschlossenen gut und lassen Sie ihn durchströmen, um den entsprechenden Schacht.
  • Stellen Sie das Gerät mit dH 2 O in einem Brutschrank bei 37 ° C für 1 Stunde, dann wiederholen Sie den Waschvorgang wieder. Waschen Sie die Geräte dreimal mit dH 2 O für jeweils eine Stunde, die die Summe ist.

Hinweis: Aufgrund der Möglichkeit, dass Borat von der PLL in die PDMS absorbieren, einige in der Jeon Lab empfehlen Inkubation der Geräte über Nacht mit autoklaviertem dH 2 O nach ein paar initial schnelle spült. Dadurch wird sichergestellt, dass alle freien Borat wird Lauge aus dem PDMS vor dem Laden der Zellen. Wenn dies nicht geschieht, kann es zu einer Freisetzung von Borat in den Medien über die Zeit, die Zytotoxizität führen könnte.

  • Add Neural Basal Media (NBM) mit den notwendigen Faktoren (Glutamax, B27, PenStrep) an die Spitze Brunnen

Hinweis: Die Geräte können über Nacht inkubiert und verchromt mit Zellen am nächsten Tag, oder inkubiert ein Minimum von 3 Stunden mit NMB + Faktoren vor dem Ausplattieren der Zellen.

Vorbereiten des Neurons zum Laden in die Geräte

Wir verwenden 18 Tage alten Fötus Rattencortex, dass wir entweder von einer Firma namens Brain-Bits oder das ist hier auf dem Campus für uns vorbereitet zu kaufen. Wir bevorzugen es, sich das Gewebe frisch.

  1. Erhalten 1 fetalen Hirnrinde (2 Stück Gewebe) in Hibernate E gespeichert
  2. Take 3 lange Glaspipetten und Feuer sie jeweils in immer kleinere Größen mit einem Alkohol-Lampe
  3. entfernen Gewebe von Hibernate E mit einer Glaspipette und in 2 ml NMB + Factors in einem sterilen 15 ml Tube.
  4. Trituration: Mit einer Glühbirne und Glaspipette der Kortex auf und ging hinunter zu 5 bis 10 mal. Dann wird die nächst kleinere Pipette verwendet werden, um Pipette auf und ab des Gewebes. Schließlich ist die kleinste Pipette verwendet werden, um Pipette auf und ab des Gewebes. Wir möchten sicherstellen, dass keine sichtbaren Brocken.

    Hinweis: Vor kurzem begann die Jeon Lab verglichen Zellen aus dem Gewebe in Hibernate E, um Zellen, die aus Gewebe zunächst mit 0,125% Trypsin in 50% behandelt wurden hergestellt gespeicherten Ca + + frei und Mg + + frei Dissektion Puffer. Der Konsens ist, dass Gewebe hergestellt unter Verwendung von Trypsin Ertrag mehr lebensfähige Zellen als Gewebe zunächst in Hibernate E. platziert Wenn Sie nicht gehen, um das Gewebe sofort verwenden, dann müssen Sie das Gewebe in Hibernate E. speichern

    Wenn Sie vorhaben, das Gewebe sofort einsatzbereit sind und würde höhere Rentabilität mögen, dann behandeln das Gewebe mit Trypsin vor der mechanischen Zerkleinerung wie folgt: 1) verdünnt 1 ml 0,25% Trypsin (Gibco, Invitrogen) mit 1 ml Ca + + freie Mg + + frei Dissektion Puffer (final Trypsin = 0,125%) in eine 15 ml Tube (keep eiskalt), 2) Platz Gewebe in Puffer und Inkubation sofort bei 37 ° C für 8 Minuten, 3) 10 ml DMEM/10% FBS bis zum Anschlag Trypsin-Reaktion und weiter-Protokoll unten.

  5. Centrifuge Zellen bei 1100 rpm für 1 Minute
  6. Aspirated Medien vorsichtig von der Zellpellet
  7. 1 ml der NMB + Faktoren auf die Pellet-und resuspendiert sie durch Auf-und Abpipettieren
  8. Pass den resuspendierten Zellen durch die Schwerkraft fließen durch einen Filter, um alle Klumpen zu entfernen (BD Falcon Zellsieb 40 um Nylon)
  9. Graf und Platte-Zellen:
    • In ein Mikrozentrifugenröhrchen, fügen Sie 60 ul NMB + Faktoren, 20 ul Zellsuspension und 20 ul Trypanblau dann mischen
    • Etwa 10 ul dieser Lösung auf eine Zählkammer und zählen die Live-Zellen (nicht blau)
    • Adjust Konzentration von 2,5 bis 4,5 x10 6 Zellen / ml

      Hinweis: Wir in der Regel erhalten eine Konzentration von etwa 2,5 bis 4,5 x 106 Zellen / ml. je nach Umfang werden die Zellen in (in der Regel 1 ml NBM + B27/Glutamax/PenStrep percortex) resuspendiert. Wenn das Gewebe mit Trypsin hergestellt wurde, wird die Ausbeute wahrscheinlich erhöht werden.

Plating Die Geräte

  1. Wägezellen (primären Neuronen) in einem Brunnen des Gerätes
  2. Plate 5 ul pro kleines Gerät und 20 ul pro big Gerät

    Hinweis: Sie können 10 ul der Zellen auf der Oberseite des Geräts und 10 ul auf der Unterseite des Geräts (die Hälfte Gesamtvolumen) zu laden, oder direkt alle 20 ul der Zellen in der oberen Somal gut (5 ul in der oberen Somal gut für die kleinen Geräte).

  3. Inkubieren für 10 Minuten bei 37 ° C Inkubator so Zellen beginnen zu befestigen
  4. Add etwa 150/30 ul NMB + Faktoren in jede Vertiefung je nach Gerätegröße

    Hinweis: Volumes kann je nach der Dicke des PDMS. Alles, was zählt ist, dass die Brunnen voll sind.

Zusätzliche On Mit die Geräte ohne Plasma Bonding

Ohne Plasmabehandlung, sagt Christina Tu, ein Techniker, der es erfolgreich jede Woche ohne Plasma, laden Sie einfach die Zellen sofort.

Denken Sie daran, die Medien aus beiden Brunnen auf dem Soma-Seite (Axon Seite keine Rolle, ob Sie die Medien in Urlaub) zu entfernen. Es ist die Strömung, die die Zellen zum Hauptkanal eingeben können. Wenn Sie Medien in den Vertiefungen haben, werden Sie nicht bekommen Strömung.

Discussion

Hier haben wir gezeigt, wie man das Neuron Mikrofluidikvorrichtung, ohne dass ein Plasma Cleaner zu verwenden. Wir bezeichnen dies als Nicht-Plasma-Bindung.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PDMS Reagent Dow Corning Sylgard 184 with curing agent Please consult Dow Corning to find a vendor near you
Cornig No. 1 Cover Glass Cover Glass Corning Corning No. X2935 244 Available through Fisher Scientific, Fish Catalog number 12-531D
B27 Reagent Invitrogen 17504-044 B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
Glutamax Reagent Invitrogen 35050-061 Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.
60 mm Petri Dish Tool Fisher Scientific 08-757-13A 60 mm polystyrene sterile petri dishes are used to house the device bound to glass.
Poly-L-Lysine Reagent Sigma-Aldrich P-1274
BD Falcon 50 ml Tube Tool BD Biosciences Falcon No. 352098 Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-49A
BD Falcon 15 ml tube Tool BD Biosciences Falcon No. 352097 Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, (4), 2128-2136 (2006).
  2. Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, (8), 599-605 (2005).

Comments

14 Comments

  1. can't view videos?? firefox latest plugins???

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 4, 2007 - 10:33 PM
  2. Hi Ron. I am sorry you are having trouble. To view videos, please make sure that you have the latest version of Flash installed. If you still have problems, please send us an email to support@jove.com with operating system and browser information.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 5, 2007 - 12:48 AM
  3. What protocol do you use when making the PLL solution? 5mg of PLL to 50ml water?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 7, 2008 - 2:47 PM
  4. Hi Lee T
    We dissolve the PLL in borate buffer
    1.²4 g of boric acid and 1.9 g of sodium tetraborate is added to 300 ml of nanopure water (final volume will be 400 ml) and stirred to disolve for about 30 minutes.  Next the pH is adjusted to pH 8.5.  ²00 mg of PLL is added and stirred until disolved.  The final volume is adjusted to 400 ml.  The PLL solution is then sterile filtered and aliquoted into sterile 50 ml tubes in a tissure cutlure hood.  Aliquots are stored at -²0C until use.
    Joseph Harris

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 7, 2008 - 5:57 PM
  5. Just wanted to let everyone know a company is forming to make, sell, and distribute the devices. Email xonamicrofluidics@gmail.com for more information.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 4, 2008 - 1:01 PM
  6. Hi there, it it possible to get a protocol for fixation and staining of neurons in microfluidic chambers? Which method is better for this purpose (fixation and staining), plasma- or non-plasma bonding? Is it possible to remove the microfluidic device without damaging the neurons or dŒs it have to stay on during the procedure? By the way: A really impressive method, fantastic! Looking forward to your answer. Best, Harry

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 6, 2008 - 2:32 PM
  7. Hello Harry Probably the best thing would be for you to check out our company website at http://xonamicrofluidics.com/ We have a protocol there available for download.  It gŒs over staining in the device. Also, if you would like to discuss staining in more detail or have any other questions feel free to email us xonamicrofluidics@gmail.com

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 10, 2008 - 4:46 AM
  8. Hi Harry just to follow up.. The device dŒs not have to be removed for staining. However, if you are interested in visualizing in the mid-region of the grooves then it might not stain very well with the device on.  If you only want to visualize neurons in the main channels or axons just entering or leaving the grooves then staining with the device on is just fine. If you want to get a good stain of the middle of the microgroove region then it is best to remove the device before staining.  This means non-plasma bonding will have to be done as plasma bonding is irreversible. Yes, removing the device can and dŒs damage the neurons.  However, done with care and after some practice it is possible to remove the device and keep most of the sample intact. Some researchers like to fix the cells in the device, place the device on ice for 5 minutes then carefully remove it.  Others just remove the device as carefully as possible prior to staining. Please visit our website http://xonamicrofluidics.com/ for our detailed protocol. Also feel free to email us xonamicrofluidics@gmail.com

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 10, 2008 - 4:55 AM
  9. Hello JŒ, thank you very much for your reply and support. The protocol on http://xonamicrofluidics.com/ which you are refering to is indeed very detailed and helpful. I am now curious to see how my experiments work out. :-) All the best and thanks again, Harry

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 11, 2008 - 5:59 PM
  10. This probably dŒsn't work for non-plasma PDMS-PDMS bonding... or, is there a way to treat one of the PDMS layers as glass?

    Reply
    Posted by: Bryn G.
    September 23, 2009 - 8:05 PM
  11. Hello,

    This was a very good video indeed. Could you please let me know how did you make the wells on the PDMS. They are not micronsized wells that we used to make by replicating form a potolithographed Silicon wafer. Did you use some kind of belt puncher? What is the exact product number and brand of the puncher? I use one to make mm sized well on the PDMS slam, however the edges are not good. Or did you use other technique to make such nicely sheped wells? If I want to make recangular or square shaped wells (² mm length/width and .5-1.0 mm height) on PDMS what could I do? I will appreciate your kind advices.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 31, 2012 - 6:39 PM
  12. Hello Taifur

    The wells are 8 mm in diameter. We have special punches machined to punch the wells. However, you can use 8 mm biopsy punches made by Sklar. VWR or Fisher Sci should have them.

    Reply
    Posted by: Joseph H.
    April 6, 2012 - 12:48 PM
  13. For the cells you receive in Hibernate E from Brain Bits, do you digest them with trypsin or even digest them at all prior to trituration. Why or why not?

    Thanks.

    Reply
    Posted by: Angela D.
    July 4, 2012 - 10:08 PM
  14. For the cells you receive in Hibernate E from Brain Bits, do you digest them with trypsin or even digest them at all prior to trituration. Why or why not?

    Thanks.

    Reply
    Posted by: Angela D.
    July 4, 2012 - 10:10 PM

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