Non plasmatici Incollaggio di PDMS Economico per la Fabbricazione di dispositivi microfluidici

Biology
 

Summary

In questo video ci dimostra come utilizzare il dispositivo a microfluidi neurone senza legame plasma.

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Harris, J., Lee, H., Vahidi, B., Tu, C., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (9), e410, doi:10.3791/410 (2007).

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Abstract

In questo video ci dimostra come utilizzare il dispositivo a microfluidi neurone senza legame plasma. In alcuni casi può essere desiderabile ai dispositivi reversibilmente legame con il n ° Corning 1 bicchiere di copertura. Questo potrebbe essere dovuto, forse, di un detergente plasma non essere disponibile. In altri casi, può essere desiderabile per rimuovere il dispositivo dal vetro dopo la coltura di neuroni per alcuni tipi di microscopia o per immunostaining, anche se non è necessario rimuovere il dispositivo per immunostaining poiché i neuroni possono essere macchiati nel dispositivo. Alcuni ricercatori, tuttavia, preferiscono ancora per rimuovere il dispositivo. In questo caso, il legame reversibile del dispositivo al vetro di copertura lo rende possibile. Ci sono alcuni svantaggi non plasmatici legame dei dispositivi che si forma non così stretti di un sigillo. In alcuni casi, gli assoni possono crescere sotto i solchi piuttosto che attraverso di loro. Inoltre, poiché il vetro e PDMS sono idrofobiche, i liquidi non facilmente inserire il dispositivo che rende necessario a volte la forza dei media e altri reagenti nel dispositivo. Liquidi entrerà nel dispositivo tramite un'azione capillare, ma ci vuole molto più tempo rispetto a dispositivi che sono stati incollati al plasma. Il pulitore plasma crea temporaneo accuse idrofilo sul vetro e dispositivi che facilitano il flusso di liquidi attraverso il dispositivo dopo l'incollaggio in pochi secondi. Per i dispositivi legati non al plasma, il flusso di liquido attraverso i dispositivi richiede diversi minuti. E 'anche importante notare che i dispositivi da utilizzare con i plasma di incollaggio devono essere sterilizzati prima, mentre i dispositivi trattati al plasma non hanno bisogno di essere sterilizzati prima dell'uso, perché il più pulito al plasma li sterilizzare.

Protocol

Preparazione dei dispositivi Microfluidic per colture cellulari Neuron

1) Pulire Corning No.1 24 mm X 40 diapositive mm di vetro

  • Sonicare i vetrini in un sonicatore bagnomaria per 30 minuti
  • Sciacquare i vetrini con il 70% EtOH
  • Lavare i vetrini tre volte con dH 2 O
  • Diapositive a secco in una cappa di coltura per alcune ore, preferibilmente durante la notte

Nota: Abbiamo vassoi di metallo speciale che si carica con le diapositive. I vetrini sono separati individualmente e messi in slot in questo rack di metallo. Possiamo quindi posizionare questi vassoi di metallo di carico in un piatto di vetro che si riempiono di acqua, posto nel bagno sonicatore acqua e ultrasuoni per 30 minuti. Lavaggi successivi si svolgono in questo piatto.

2) Preparazione dei dispositivi PDMS

  • Tagliare lo stampo PDMS dal wafer di silicio, buchi nel cast PDSM e quarto lo
  • Pulire i dispositivi di PDMS in primo luogo che soffia gas inerte (argon o azoto) attraverso di loro. Quindi utilizzare Marca 3M Scotch 471 nastro per sollevare i detriti rimanenti

Nota: è importante mantenere i dispositivi a faccia in su. Inizialmente, quando abbiamo tagliato il PDMS lontano dal wafer di silicio, lato a contatto con l'ostia è il lato pulito: contiene i canali microfluidica. Cerchiamo di essere attenti come siamo in grado di non danneggiare il dispositivo, e mantenere la faccia pulita verso l'alto finché non siamo pronti per l'incollaggio di plasma.

  • Dispositivi di autoclave in contenitori di plastica
  • Dopo la sterilizzazione in autoclave, pulita n. 1 vetrini Corning e plasma-treat dispositivi utilizzando un detergente marchio Harrick plasma, www.harrickplasma.com
  • Posizionare i dispositivi puliti lato negativo sul vetrino.

Il dispositivo è ora al plasma legato al vetrino.

3) Rivestimento Periferiche con poli L-lisina (PLL)

  • PLL è aggiunto a un bene su ogni lato del dispositivo e ha permesso di fluire attraverso nel pozzo prossimo

=> 150 ml di PLL per i pozzi di grandi dimensioni e 30 μ l PLL per i pozzi più piccoli. Non ha, per l'esattezza fino a quando i pozzi sono pieni.

Nota: Se si guarda un dispositivo vedrete 4 pozzi: ogni due sono collegati. Volete mettere il PLL in un pozzo in modo che il flusso attraverso il dispositivo nel pozzo successivo.

  • Lasciare che il PLL a fluire attraverso il dispositivo per circa 10 minuti e poi aggiungere più PLL per i pozzi di riempirle
  • Posizionare i dispositivi contenenti PLL in un incubatore a 37 ° C per un minimo di 4 ore (durante la notte è preferibile)
  • Vuoto fuori l'eccesso PLL dopo il trattamento, ma attenzione a non aspirare tutto il liquido dal dispositivo

Nota: Se non si desidera introdurre bolle d'aria ai canali o da camera. Solo il vuoto in eccesso PLL nei pozzetti.

  • Aggiungi autoclave dH 2 O ad ogni bene su entrambi i lati del dispositivo, e permette di scorrere alla ben altro per azione capillare

La figura 1 è un diagramma di un dispositivo a microfluidi. Notate come il Blue (Soma lato) è collegata e il Rosso (lato assonale) sono collegati. Quando si dice mettere il PLL, o l'acqua o del supporto, su un bene su ogni lato del dispositivo, che cosa si intende, ad esempio, è: Place 150 ul di autoclave dH 2 O in un blu Ebbene posto 150 ml di dH autoclavato 2 0 in un unico Rosso Bene. L'acqua (o PLL, o Media o Celle) fluirà attraverso il dispositivo alla ben altri corrispondenti.

Figura 1

Figura 1

Nota: Si prega di notare che, d'ora in poi, quando dico "media luogo, le cellule, l'acqua o PLL nella TOP pozzi", mi riferisco allo schema di sopra, dove il Soma sarebbe a sinistra e gli assoni crescerà al a destra.

  • Aspirare l'acqua (ancora una volta facendo attenzione a non rimuovere completamente tutto il liquido dal dispositivo), quindi aggiungere altri 150 ml di autoclave dH 2 O a uno dei collegati ogni bene e permettono di fluire attraverso i corrispondenti bene.
  • Posizionare il dispositivo contenente dH 2 O in un incubatore a 37 ° C per 1 ora, quindi ripetere la fase di lavaggio di nuovo. Lavare i dispositivi di tre volte con dH 2 O per un'ora ciascuno, che è il totale.

Nota: A causa della possibilità che borato dal PLL in grado di assorbire in PDMS, alcuni nel laboratorio di Jeon consigliamo incubando i dispositivi di una notte con autoclave dH 2 O dopo un paio di initial risciacqui veloce. Questo farà sì che tutte le borato libero arbitrio leach fuori del PDMS prima del carico delle cellule. Se questo non viene fatto, ci può essere un rilascio di borato nei media nel corso del tempo, che potrebbe portare a citotossicità.

  • Aggiungi neurali media basale (NBM) con i fattori necessari (glutamax, B27, PenStrep) per i pozzi in alto

Nota: I dispositivi possono essere incubato per una notte e placcato con le cellule il giorno dopo, o incubate un minimo di 3 ore con NMB fattori + prima placcatura le cellule.

Preparare i neuroni da caricare nel Dispositivi

Utilizziamo 18 giorni corteccia vecchio ratto fetale che ci sia acquistare da una società denominata Bit cervello o che è preparato qui nel campus per noi. Noi preferiamo per ottenere il tessuto fresco.

  1. Ottenere 1 corteccia cerebrale del feto (2 pezzi di tessuto) conservati in Hibernate E
  2. Prendete 3 pipette di vetro lunghe e fuoco ogni loro in dimensioni sempre più piccoli utilizzando una lampada ad alcool
  3. rimuovere i tessuti da Hibernate E con una pipetta di vetro e posto in 2 ml di NMB Fattori + in un tubo sterile 15 ml.
  4. Triturazione: Usando una pipetta di vetro a bulbo e la corteccia viene passato su e giù per circa 5 a 10 volte. Poi, la pipetta prossimo più piccolo viene usato per pipetta su e giù per il tessuto. Infine, la più piccola pipetta viene usato per pipetta su e giù per il tessuto. Ci piace fare in modo che non ci siano pezzi visibili.

    Nota: Recentemente, il Laboratorio Jeon ha iniziato a confronto le cellule dal tessuto conservati in Hibernate e alle cellule che sono stati preparati da tessuto inizialmente trattati con tripsina 0,125% nel 50% Ca + + libero e Mg + + libero buffer di dissezione. Il consenso è che il tessuto preparato con tripsina resa cellule più vitali rispetto al tessuto messo inizialmente in Hibernate E. Se non si ha intenzione di utilizzare il tessuto subito, allora avete bisogno di conservare il tessuto in Hibernate E.

    Se avete intenzione di utilizzare il tessuto subito e vorrei vitalità maggiore, poi trattare il tessuto con tripsina prima della triturazione meccanica come segue: 1) diluire 1 ml 0,25% tripsina (Gibco, Invitrogen) con 1 ml di Ca + + libero Mg + + gratis buffer di dissezione (finale tripsina = 0,125%) in una provetta da 15 ml (mantenere freddo ghiaccio), 2) tessuto posto nel buffer e incubare immediatamente a 37 ° C per 8 minuti, 3) aggiungere 10 ml DMEM/10% FBS per fermare il tripsina reazione e continuare il protocollo di seguito.

  5. Cellule Centrifugare a 1100 rpm per 1 minuto
  6. Mezzi di comunicazione aspirato accuratamente fuori il pellet
  7. Aggiungere 1 ml di NMB fattori + al pellet e ri-sospesa pipettando su e giù
  8. Passare il risospese cellule flusso per gravità attraverso un filtro per eliminare eventuali grumi (BD Falcon cellula filtro di nylon 40 um)
  9. Conte e la piastra di cellule:
    • In una provetta per microcentrifuga, aggiungere 60 microlitri NMB + fattori, 20 l di sospensione cellulare, e 20 ml di blu tripano poi mescolare
    • Aggiungere circa 10 ml di questa soluzione in un emocitometro e contare le cellule vive (non blu)
    • Regolare la concentrazione di 2,5-4,5 x10 6 cellule / ml

      Nota: In genere ottiene una concentrazione di circa 2,5-4,5 x 106 cellule / ml. a seconda del volume le cellule sono risospese in (di solito da 1 ml + B27/Glutamax/PenStrep percortex NBM). Se il tessuto è stato preparato con tripsina, la resa sarà probabilmente aumentato.

La placcatura Dispositivi

  1. Celle di carico (neuroni primari) in un pozzetto del dispositivo
  2. Tavola 5 microlitri per dispositivo piccolo e 20 l per dispositivo grande

    Nota: è possibile carico 10 l di cellule sulla parte superiore del dispositivo e 10 microlitri sul fondo del dispositivo (la metà del volume totale), oppure direttamente tutti i 20 l di cellule nel ben superiore cromosomiche (5 microlitri nel cromosomiche alto ben per i dispositivi di piccole dimensioni).

  3. Incubare per 10 minuti a 37 ° C in modo da incubatore cellule possono cominciare a collegare
  4. Aggiungi microlitri circa 150/30 di fattori + NMB in ciascun pozzetto a seconda delle dimensioni dispositivo

    Nota: I volumi possono variare a seconda dello spessore del PDMS. Tutto ciò che importa è che i pozzi sono pieni.

Supplementare Uso le periferiche senza Plasma Incollaggio

Senza il trattamento al plasma, Christina Tu, un tecnico, che lo fa con successo ogni settimana senza plasma, dice a caricare solo le cellule subito.

Ricordarsi di rimuovere il supporto da entrambi i pozzetti sul lato soma (lato assone non importa se si lascia la media). E 'il flusso del fluido che permette alle cellule di entrare nel canale principale. Se si dispone di mezzi di comunicazione nei pozzi, non sarà possibile ottenere il flusso del fluido.

Discussion

Qui abbiamo dimostrato come utilizzare il dispositivo a microfluidi neurone senza bisogno di un pulitore di plasma. Ci riferiamo a questo legame che non plasmatici.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PDMS Reagent Dow Corning Sylgard 184 with curing agent Please consult Dow Corning to find a vendor near you
Cornig No. 1 Cover Glass Cover Glass Corning Corning No. X2935 244 Available through Fisher Scientific, Fish Catalog number 12-531D
B27 Reagent Invitrogen 17504-044 B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
Glutamax Reagent Invitrogen 35050-061 Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.
60 mm Petri Dish Tool Fisher Scientific 08-757-13A 60 mm polystyrene sterile petri dishes are used to house the device bound to glass.
Poly-L-Lysine Reagent Sigma-Aldrich P-1274
BD Falcon 50 ml Tube Tool BD Biosciences Falcon No. 352098 Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-49A
BD Falcon 15 ml tube Tool BD Biosciences Falcon No. 352097 Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, (4), 2128-2136 (2006).
  2. Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, (8), 599-605 (2005).

Comments

14 Comments

  1. can't view videos?? firefox latest plugins???

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 4, 2007 - 10:33 PM
  2. Hi Ron. I am sorry you are having trouble. To view videos, please make sure that you have the latest version of Flash installed. If you still have problems, please send us an email to support@jove.com with operating system and browser information.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 5, 2007 - 12:48 AM
  3. What protocol do you use when making the PLL solution? 5mg of PLL to 50ml water?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 7, 2008 - 2:47 PM
  4. Hi Lee T
    We dissolve the PLL in borate buffer
    1.²4 g of boric acid and 1.9 g of sodium tetraborate is added to 300 ml of nanopure water (final volume will be 400 ml) and stirred to disolve for about 30 minutes.  Next the pH is adjusted to pH 8.5.  ²00 mg of PLL is added and stirred until disolved.  The final volume is adjusted to 400 ml.  The PLL solution is then sterile filtered and aliquoted into sterile 50 ml tubes in a tissure cutlure hood.  Aliquots are stored at -²0C until use.
    Joseph Harris

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 7, 2008 - 5:57 PM
  5. Just wanted to let everyone know a company is forming to make, sell, and distribute the devices. Email xonamicrofluidics@gmail.com for more information.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 4, 2008 - 1:01 PM
  6. Hi there, it it possible to get a protocol for fixation and staining of neurons in microfluidic chambers? Which method is better for this purpose (fixation and staining), plasma- or non-plasma bonding? Is it possible to remove the microfluidic device without damaging the neurons or dŒs it have to stay on during the procedure? By the way: A really impressive method, fantastic! Looking forward to your answer. Best, Harry

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 6, 2008 - 2:32 PM
  7. Hello Harry Probably the best thing would be for you to check out our company website at http://xonamicrofluidics.com/ We have a protocol there available for download.  It gŒs over staining in the device. Also, if you would like to discuss staining in more detail or have any other questions feel free to email us xonamicrofluidics@gmail.com

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 10, 2008 - 4:46 AM
  8. Hi Harry just to follow up.. The device dŒs not have to be removed for staining. However, if you are interested in visualizing in the mid-region of the grooves then it might not stain very well with the device on.  If you only want to visualize neurons in the main channels or axons just entering or leaving the grooves then staining with the device on is just fine. If you want to get a good stain of the middle of the microgroove region then it is best to remove the device before staining.  This means non-plasma bonding will have to be done as plasma bonding is irreversible. Yes, removing the device can and dŒs damage the neurons.  However, done with care and after some practice it is possible to remove the device and keep most of the sample intact. Some researchers like to fix the cells in the device, place the device on ice for 5 minutes then carefully remove it.  Others just remove the device as carefully as possible prior to staining. Please visit our website http://xonamicrofluidics.com/ for our detailed protocol. Also feel free to email us xonamicrofluidics@gmail.com

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 10, 2008 - 4:55 AM
  9. Hello JŒ, thank you very much for your reply and support. The protocol on http://xonamicrofluidics.com/ which you are refering to is indeed very detailed and helpful. I am now curious to see how my experiments work out. :-) All the best and thanks again, Harry

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 11, 2008 - 5:59 PM
  10. This probably dŒsn't work for non-plasma PDMS-PDMS bonding... or, is there a way to treat one of the PDMS layers as glass?

    Reply
    Posted by: Bryn G.
    September 23, 2009 - 8:05 PM
  11. Hello,

    This was a very good video indeed. Could you please let me know how did you make the wells on the PDMS. They are not micronsized wells that we used to make by replicating form a potolithographed Silicon wafer. Did you use some kind of belt puncher? What is the exact product number and brand of the puncher? I use one to make mm sized well on the PDMS slam, however the edges are not good. Or did you use other technique to make such nicely sheped wells? If I want to make recangular or square shaped wells (² mm length/width and .5-1.0 mm height) on PDMS what could I do? I will appreciate your kind advices.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 31, 2012 - 6:39 PM
  12. Hello Taifur

    The wells are 8 mm in diameter. We have special punches machined to punch the wells. However, you can use 8 mm biopsy punches made by Sklar. VWR or Fisher Sci should have them.

    Reply
    Posted by: Joseph H.
    April 6, 2012 - 12:48 PM
  13. For the cells you receive in Hibernate E from Brain Bits, do you digest them with trypsin or even digest them at all prior to trituration. Why or why not?

    Thanks.

    Reply
    Posted by: Angela D.
    July 4, 2012 - 10:08 PM
  14. For the cells you receive in Hibernate E from Brain Bits, do you digest them with trypsin or even digest them at all prior to trituration. Why or why not?

    Thanks.

    Reply
    Posted by: Angela D.
    July 4, 2012 - 10:10 PM

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