Ucuz mikroakışkan Cihazlar İmalat PDMS Non-plazma Yapışma

Biology
 

Summary

Bu video plazma bağı olmayan nöron mikroakışkan cihazın nasıl kullanılacağını göstermektedir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Harris, J., Lee, H., Vahidi, B., Tu, C., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (9), e410, doi:10.3791/410 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bu video, plazma bağı olmayan nöron mikroakışkan cihazın nasıl kullanılacağını göstermektedir. Bazı durumlarda Corning No 1 kapak cam geri dönüşümlü bond cihazlar istenebilir. Bu plazma temizleyici kullanılabilir değil, belki de bağlı olabilir. Diğer durumlarda, bu nöronlar cihaz lekeli olabilir çünkü immün aygıtı kaldırmak için gerekli olmasa da, mikroskopi veya immün için belirli türleri için kültür nöronların sonra cam aygıtı kaldırmak için arzu olabilir. Bazı araştırmacılar, ancak hala aygıtı kaldırmak için tercih ediyor. Bu durumda, cihazın kapağı cam reversibl bağlanma mümkün kılar. Olmayan, bir mühür gibi sıkı değil oluşur cihazların plazma bağı bazı dezavantajları vardır. Bazı durumlarda aksonlar ziyade onların aracılığıyla oluk altında büyür. Ayrıca, cam ve PDMS hidrofobik olduğu için, sıvıların kolaylıkla medya ve diğer reaktiflerin cihazın içine zorlamak için zaman zaman gerekli cihaz girmek yok. Sıvılar cihaz kapiller eylem yoluyla girecek ama önemli ölçüde daha uzun plazma gümrüklü cihazlara kıyasla sürüyor. Plazma temizleyici, cam ve cihaz sonra cihaz üzerinden saniyeler içinde yapıştırma sıvıların akışını kolaylaştırmak geçici hidrofilik ücretleri oluşturur. Cihazları ile sıvı akış non-plazma bağlı cihazlar için, birkaç dakika sürer. Cihazları plazma temizleyici sterilize edecektir, çünkü plazma tedavi cihazlar kullanımdan önce sterilize edilecek gerekmez iken, önce sterilize edilecek bağ olmayan plazma ile kullanılmak üzere olduğunu da not etmek önemlidir.

Protocol

Nöron Hücre Kültürü için mikroakışkan Cihazlar hazırlanması

1) Temiz Corning No.1 24 mm X 40 mm cam slaytlar

  • 30 dakika boyunca bir su banyosu sonikatör cam slaytlar sonikasyon
  • Cam slaytlar,% 70 EtOH ile durulayın
  • Yıkama dH 2 O ile üç kez slaytlar
  • Tercihen bir gecede, birkaç saat için bir doku kültürü davlumbaz, Kuru slaytlar

Not: Biz özel metal tepsiler slaytlar yük var. Slaytları tek tek ayrılmış ve bu metal raf yuvalarına yerleştirilir. Daha sonra bir cam tabak, su, su banyosu sonikatör yer ile doldurun bu metal yükleme tepsisi yerleştirin ve 30 dakika sonikasyon. Sonraki yıkar bu yemeğin yürütülmektedir.

2) PDMS cihazları hazırlanması

  • PDSM döküm ve çeyrek bu silikon gofret PDMS kalıp kesip, delgeç
  • PDMS cihazlar onları genelinde ilk ve inert gaz (argon veya Azot) üfleyerek temizleyin. Daha sonra kalan tüm enkaz kaldırmak için 3M Scotch Marka 471 bandı kullanın

Not: cihazların yüzü yukarı tutmak için önemlidir. Başlangıçta, silikon gofret uzak PDMS kesildiğinde, gofret ile temas tarafında temiz tarafında: mikroakışkan kanallarını içerir. Biz biz de cihaza zarar verebilir ve plazma yapıştırılması için hazır olana kadar temiz yüzleri yetişmek için olabildiğince dikkatli olmaya çalışıyorum.

  • Plastik kaplar Otoklav cihazlar
  • Otoklav, temiz, No: 1 Corning cam slaytlar ve harrick marka plazma temizleyici, plazma tedavi cihazları sonra www.harrickplasma.com
  • Cihazları cam slayt tarafı aşağı temiz bir yerde.

Cihaz şimdi cam slayt gümrüklü plazma.

3) Kaplama Poli L-Lizin (PLL) ile Cihazlar

  • PLL cihazın her iki tarafında iyi eklenir ve bir sonraki kuyuya akmasına izin verilir

=> 150 ul büyük küçük kuyuları için kuyu ve 30 μ l PLL PLL. Bu sürece kuyuları tam olarak tam olarak bulunmamış.

Not: Bir aygıt bakarsanız 4 kuyu göreceksiniz: her iki bağlanır. Siz de bu yüzden sonraki kuyuya cihaz üzerinden akacak bir PLL koymak istiyorum.

  • PLL yaklaşık 10 dakika boyunca cihaz üzerinden akış ve daha sonra bunları doldurmak için kuyu daha PLL eklemek için izin ver
  • (Gece ​​tercih edilir) 37 ° C'de en az 4 saat için bir kuluçka PLL içeren cihazlar yerleştirin
  • Tedavi sonrası aşırı PLL Vakum, ancak cihazın tüm sıvı emmek için dikkatli olun

Not: kanalları ya da odasına hava kabarcıkları tanıtmak istemiyorum. Sadece kuyularda aşırı PLL vakum.

  • Cihazın her iki tarafında her bir kuyu için otoklava dH 2 O ve kılcal eylem diğer iyi akmasına izin

Şekil 1 mikroakışkan bir cihazın bir diyagram. Mavi (Soma tarafı) nasıl bağlandığına dikkat edin ve Kızıl (Aksonal tarafı) bağlanır. Cihazın her iki tarafında iyi bir PLL, ya su ya da medya, demekle, ne demek istediğimizi, örneğin: Yeri otoklava dH biri Blue Peki o yerde 150 ul otoklava dH 2 O 150 ul Peki bir Kırmızı içine 2 0. Su (ya da PLL, Medya, veya Hücreler) cihaz üzerinden diğer ilgili iyi akacaktır.

Şekil 1

Şekil 1

Not: Lütfen artık, diyorum "TOP kuyularda medya, hücreleri, su veya PLL", Soma, soldaki nerede olurdu Yukarıdaki diyagram ve Aksonlar kastediyorum, not büyüyecek hakkını saklı tutar.

  • Su (daha dikkatli olmak tam olarak tüm sıvı cihazdan çıkarmak için değil) aspire, sonra otoklava dH 2 O başka bir 150 ul de bağlı her birine ekleyin ve iyi karşılık akmasına izin verin .
  • 37 ° dH 2 O içeren bir kuluçka cihaz yerleştirin ° C 1 saat sonra tekrar yıkama adımı tekrarlayın. DH 2 O cihazları, üç kez yıkayın toplam bir saat, her biri .

Not: PLL borat Jeon Lab i bir çift sonra otoklava dH 2 O gecede cihazlar kuluçka tavsiye PDMS emebilir olasılığı nedeniylenitial hızlı durular. Bu, tüm serbest borat önce hücre yükleme PDMS liç olacağını garanti eder. Bu yapılmadığı takdirde, medya içine borat bir açıklaması, sitotoksisiteye neden olabilir zaman içinde olabilir.

  • Üst kuyuları için gerekli faktörleri (glutamax, B27, PenStrep) Sinir Bazal Ortam (NBM)

Not: cihazlar inkübe, gece boyunca ve ertesi gün hücreleri ile kaplı veya hücreleri kaplama önce NMB + faktörler ile en az 3 saat inkübe edilebilir.

Nöronlar Into Aygıtlar yüklenmesi için hazırlanması

Biz 18 gün ya Beyin Bit kampüs ya da bizim için burada hazırlanan adında bir şirket satın eski fetal sıçan korteks kullanın. Biz taze doku almak için tercih ederler.

  1. Hazırda Bekleme E saklanan 1 fetal beynin korteks (2 adet doku) edinmek
  2. Alkol lamba kullanarak 3 uzun cam pipetler alın ve gittikçe daha küçük boyutlarda her yangın
  3. NMB + Faktörler 2 ml 15 ml steril bir tüp içinde bir cam pipet ve yer Hazırda Bekleme E dokuların çıkarın.
  4. Öğütme: korteks yaklaşık 5 ile 10 kat aşağı yukarı geçti ve bir ampul ve cam pipet kullanarak . Ardından, sonraki küçük pipet doku aşağı yukarı pipet ve kullanılır. Son olarak, küçük pipet doku aşağı yukarı pipet ve kullanılır. Biz hiçbir görünür parçaları olmadığından emin olmak istiyorum.

    Not: Son zamanlarda, Jeon Lab, başlangıçta% 50,% 0.125 tripsin ile tedavi Doku hazırlanan hücreler Hazırda Bekleme E saklanan doku hücreleri karşılaştırarak başladı Ca + + ve Mg + + ücretsiz diseksiyonu tampon. Konsensus tripsin verim doku hemen kullanmak için DEĞİLDİR Hazırda Bekleme E. başlangıçta yerleştirilen doku daha canlı hücreler kullanarak hazırlanan doku, daha sonra Hazırda Bekleme E. doku saklamak gerekir

    Eğer hemen doku kullanmak için gidiyoruz vardır ve artan canlılığı istiyorsanız Eğer aşağıdaki gibi, daha sonra mekanik öğütme önce tripsin ile doku tedavisi: 1) 1 ml Ca + + ücretsiz Mg + + ücretsiz 1 ml% 0.25 tripsin (Gibco, Invitrogen) sulandırmak diseksiyonu tampon içine 15 ml tüp (buz tutmaya) (son tripsin =% 0.125), 2) yer tampon doku ve 8 dakika 37 ° C az hemen inkübe 3) durdurmak için 10 ml% DMEM/10 FBS eklemek tripsin reaksiyon ve aşağıda protokol devam.

  5. 1 dakika için 1100 rpm'de Santrifüj hücreleri
  6. Kapalı hücre pelletini dikkatle aspire medya
  7. NMB + faktörler kadar pipetleme pelet ve yeniden askıya 1 ml ve aşağı
  8. (BD Falcon hücre süzgecinden 40 um naylon) herhangi bir kümeleri kaldırmak için bir filtre üzerinden yerçekimi akışı ile yeniden askıya hücreleri Pass
  9. Sayımı ve plaka hücreleri:
    • Bir mikrofuge'de tüpe, 60 ul NMB + faktörler, hücre süspansiyonu ul, 20 ve 20 ul tripan mavi karışımı
    • Bu çözüm yaklaşık 10 ul bir hemasitometre ekleyin ve canlı hücrelerin sayısı (mavi)
    • Konsantrasyonu 2.5 ayarlama - 4,5 x10 6 hücre / ml

      Not: Biz genellikle yaklaşık 2,5 'lik bir konsantrasyon elde - 4.5 x 106 hücre / ml. hacmine bağlı olarak hücrelerin (normalde 1 ml NBM + B27/Glutamax/PenStrep percortex) yeniden süspanse. Doku tripsin ile hazırlanmış ise, verim muhtemelen artacaktır.

Cihazlar Kaplama

  1. Birine cihazın Yük hücreleri (primer nöronlar)
  2. Plaka küçük bir cihaz başına 5 ul ve büyük cihaz başına 20 ul

    Not: cihazın üst ve alt cihazın (yarım toplam hacmi) 10 ul 10 ul hücre yükü, ya da üst warfarin iyi hücrelerin doğrudan 20 ul (5 ul de üst warfarin Küçük cihazlar için).

  3. 10 dakika 37 ° C inkübatör inkübe hücreleri eklemek başlayabilirsiniz
  4. NMB + faktörlerin iyi cihaz boyutuna bağlı olarak her biri için yaklaşık 150 / 30 ul

    Not: Hacimler PDMS kalınlığına bağlı olarak değişebilir. Tüm bu konularda kuyu tam olmasıdır.

Plazma Yapıştırma olmadan Cihazlar Açık Ek

Plazma tedavisi olmadan, plazma olmaksızın her hafta başarıyla Christina Tu, bir teknisyen, sadece hücreler hemen yüklemek için söylüyor.

Soma tarafında iki kuyu (medya bırakırsanız akson tarafı önemli değil) medya kaldırmak unutmayın. Bu hücrelerin ana kanal girmek için izin sıvı akış. Kuyuların medya varsa, sıvı akışını almazsınız.

Discussion

Burada plazma temizleyici gerek kalmadan nöron mikroakışkan cihaz nasıl kullanılacağını gösterdi. Biz bu gibi non-plazma bağı bakın.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PDMS Reagent Dow Corning Sylgard 184 with curing agent Please consult Dow Corning to find a vendor near you
Cornig No. 1 Cover Glass Cover Glass Corning Corning No. X2935 244 Available through Fisher Scientific, Fish Catalog number 12-531D
B27 Reagent Invitrogen 17504-044 B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
Glutamax Reagent Invitrogen 35050-061 Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.
60 mm Petri Dish Tool Fisher Scientific 08-757-13A 60 mm polystyrene sterile petri dishes are used to house the device bound to glass.
Poly-L-Lysine Reagent Sigma-Aldrich P-1274
BD Falcon 50 ml Tube Tool BD Biosciences Falcon No. 352098 Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-49A
BD Falcon 15 ml tube Tool BD Biosciences Falcon No. 352097 Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, (4), 2128-2136 (2006).
  2. Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, (8), 599-605 (2005).

Comments

14 Comments

  1. can't view videos?? firefox latest plugins???

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 4, 2007 - 10:33 PM
  2. Hi Ron. I am sorry you are having trouble. To view videos, please make sure that you have the latest version of Flash installed. If you still have problems, please send us an email to support@jove.com with operating system and browser information.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 5, 2007 - 12:48 AM
  3. What protocol do you use when making the PLL solution? 5mg of PLL to 50ml water?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 7, 2008 - 2:47 PM
  4. Hi Lee T
    We dissolve the PLL in borate buffer
    1.²4 g of boric acid and 1.9 g of sodium tetraborate is added to 300 ml of nanopure water (final volume will be 400 ml) and stirred to disolve for about 30 minutes.  Next the pH is adjusted to pH 8.5.  ²00 mg of PLL is added and stirred until disolved.  The final volume is adjusted to 400 ml.  The PLL solution is then sterile filtered and aliquoted into sterile 50 ml tubes in a tissure cutlure hood.  Aliquots are stored at -²0C until use.
    Joseph Harris

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 7, 2008 - 5:57 PM
  5. Just wanted to let everyone know a company is forming to make, sell, and distribute the devices. Email xonamicrofluidics@gmail.com for more information.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 4, 2008 - 1:01 PM
  6. Hi there, it it possible to get a protocol for fixation and staining of neurons in microfluidic chambers? Which method is better for this purpose (fixation and staining), plasma- or non-plasma bonding? Is it possible to remove the microfluidic device without damaging the neurons or dŒs it have to stay on during the procedure? By the way: A really impressive method, fantastic! Looking forward to your answer. Best, Harry

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 6, 2008 - 2:32 PM
  7. Hello Harry Probably the best thing would be for you to check out our company website at http://xonamicrofluidics.com/ We have a protocol there available for download.  It gŒs over staining in the device. Also, if you would like to discuss staining in more detail or have any other questions feel free to email us xonamicrofluidics@gmail.com

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 10, 2008 - 4:46 AM
  8. Hi Harry just to follow up.. The device dŒs not have to be removed for staining. However, if you are interested in visualizing in the mid-region of the grooves then it might not stain very well with the device on.  If you only want to visualize neurons in the main channels or axons just entering or leaving the grooves then staining with the device on is just fine. If you want to get a good stain of the middle of the microgroove region then it is best to remove the device before staining.  This means non-plasma bonding will have to be done as plasma bonding is irreversible. Yes, removing the device can and dŒs damage the neurons.  However, done with care and after some practice it is possible to remove the device and keep most of the sample intact. Some researchers like to fix the cells in the device, place the device on ice for 5 minutes then carefully remove it.  Others just remove the device as carefully as possible prior to staining. Please visit our website http://xonamicrofluidics.com/ for our detailed protocol. Also feel free to email us xonamicrofluidics@gmail.com

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 10, 2008 - 4:55 AM
  9. Hello JŒ, thank you very much for your reply and support. The protocol on http://xonamicrofluidics.com/ which you are refering to is indeed very detailed and helpful. I am now curious to see how my experiments work out. :-) All the best and thanks again, Harry

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 11, 2008 - 5:59 PM
  10. This probably dŒsn't work for non-plasma PDMS-PDMS bonding... or, is there a way to treat one of the PDMS layers as glass?

    Reply
    Posted by: Bryn G.
    September 23, 2009 - 8:05 PM
  11. Hello,

    This was a very good video indeed. Could you please let me know how did you make the wells on the PDMS. They are not micronsized wells that we used to make by replicating form a potolithographed Silicon wafer. Did you use some kind of belt puncher? What is the exact product number and brand of the puncher? I use one to make mm sized well on the PDMS slam, however the edges are not good. Or did you use other technique to make such nicely sheped wells? If I want to make recangular or square shaped wells (² mm length/width and .5-1.0 mm height) on PDMS what could I do? I will appreciate your kind advices.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 31, 2012 - 6:39 PM
  12. Hello Taifur

    The wells are 8 mm in diameter. We have special punches machined to punch the wells. However, you can use 8 mm biopsy punches made by Sklar. VWR or Fisher Sci should have them.

    Reply
    Posted by: Joseph H.
    April 6, 2012 - 12:48 PM
  13. For the cells you receive in Hibernate E from Brain Bits, do you digest them with trypsin or even digest them at all prior to trituration. Why or why not?

    Thanks.

    Reply
    Posted by: Angela D.
    July 4, 2012 - 10:08 PM
  14. For the cells you receive in Hibernate E from Brain Bits, do you digest them with trypsin or even digest them at all prior to trituration. Why or why not?

    Thanks.

    Reply
    Posted by: Angela D.
    July 4, 2012 - 10:10 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics