تجهيز الدماغ الأولية للفحوصات الأنسجة السرطانية والخلايا الجذعية تدفق الفرز

Published 9/25/2012
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

تحديد خلايا ورم في المخ بدء (BTICs)، وخلايا نادرة داخل الورم غير متجانسة تمتلك خصائص الخلايا الجذعية، ويقدم رؤى جديدة في الدماغ البشري المرضية الورم. صقلنا ظروف محددة لإثراء الثقافة لBTICs، والتي نستخدمها بشكل روتيني التدفق الخلوي لإثراء هؤلاء السكان. يمكن في وقت لاحق الذاتي تجديد المقايسات وتحليل نص واحد بواسطة PCR-RT الخلية سيتم تنفيذها على هذه الخلايا المعزولة.

Cite this Article

Copy Citation

Venugopal, C., McFarlane, N. M., Nolte, S., Manoranjan, B., Singh, S. K. Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting. J. Vis. Exp. (67), e4111, doi:10.3791/4111 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وتتألف عادة من خلايا أورام المخ المختلفة التي تعبر عن شكليا مجموعة متنوعة من علامات النسب العصبية. سوى جزء صغير نسبيا من الخلايا في الورم مع خصائص الخلايا الجذعية، ووصف الخلايا السرطانية الدماغ بدء (BTICs)، تمتلك القدرة على التفريق على طول الأنساب متعددة، صاحبة تجديد، والشروع في الأورام في الجسم الحي. طبقنا شروط الثقافة في الأصل تستخدم لطبيعية الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) لمجموعة متنوعة من الأورام الدماغ البشري، ووجدت أن هذه الطريقة الثقافة يختار خصيصا لالجذعية مثل السكان. مصل خالية المتوسطة (NSC) يسمح للحفاظ على حالة الخلايا الجذعية غير المتمايزة، وإضافة bFGF وEGF يسمح لانتشار قوة متعددة، وتجديد الذات، وقابلة للتوسيع tumorspheres.

لمزيد من تميز كل السكان الورم BTIC، نقيم علامات سطح الخلية بواسطة التدفق الخلوي. ونحن قد ترتب أيضا السكان من الاهتمام لcharacteriz أكثر تحديداأوجه. يتم تنفيذ الذاتي تجديد المقايسات على BTICs واحد مصنفة في 96 لوحات جيدة، وتشكيل tumorspheres بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية يدل على وجود ساق أو خلية السلف. ويمكن أيضا أعداد الخلايا متعددة من السكان خاصة في الآبار يمكن فرز مختلفة للحد من تحليل التخفيف، لتحليل الذاتي تجديد القدرات. يمكننا أيضا دراسة التعبير الجيني الفرق بين السكان خلية معينة باستخدام خلية واحدة RT-PCR.

البروتوكولات التالية تصف إجراءاتنا لتفارق وزراعة العينات الأولية لتخصيب الإنسان للسكان BTIC، فضلا عن تفكك tumorspheres. كما تشمل بروتوكولات لتلطيخ للتحليل التدفق الخلوي أو الفرز، المقايسات الذاتي تجديد، وخلية واحدة RT-PCR.

Introduction

أورام المخ هي من بين السرطانات الأكثر عدوانية وغير المتجانسة المعروف لدى البشر. على الرغم من أن تم تسهيل الكشف والتشخيص في وقت سابق عن طريق التكنولوجيا الحديثة العصبية التصوير، ونحن لا تزال تفتقر إلى العلاجات العلاجية لعلاج أورام المخ كثيرة، ولا سيما لتلك، ونشر الغازية أو تلك التي تقع في عمق الدماغ.

أورام المخ تمثل السبب الرئيسي للوفيات السرطان في الأطفال نظرا لطبيعتها العدوانية للغاية وغير قابل للشفاء كثير من الأحيان. ورم أرومي دبقي (GBM)، والأكثر شيوعا ورم في المخ الأولية في البالغين، هي واحدة من السرطانات الأكثر عدوانية الإنسان، يخشى على التكهن به بشكل موحد قاتلة 1. هذا الورم الخبيث للغاية نجمي (WHO الصف 4) يحدث عادة في البالغين نصفي الكرة المخية، ويمكن أن يحدث أيضا عند الأطفال الصغار والرضع. نموها السريع وغير الارتشاحي، وميزات المرضية التشخيص وتشمل تعدد الأشكال النووية، وانتشار الاوعية الدموية الدقيقة، ونخر 2،3. لأدولTS مع GBM تشخيصها حديثا، ونادرا ما يمتد بقاء متوسط ​​أكثر من 12 شهرا مع استجابات الفقراء عموما لجميع الطرائق العلاجية. لاحظنا أن هناك العديد من أوجه التشابه الوظيفية والوراثية المشتركة من قبل الخلايا الجذعية الجسدية والخلايا السرطانية، والتي غالبا ما dysregulated المسارات الجزيئية التي تنظم نمو الدماغ الطبيعي في السرطان. في تطبيق نماذج بيولوجيا الخلايا الجذعية لدراسة أورام المخ، كنا أول من الباحثين تحديد مستقبلي وتنقية جزء من السكان من الخلايا من GBMS الإنسان التي عرضت خصائص الخلايا الجذعية من، انتشار التجديد الذاتي، والتمايز في المختبر 4 و في فيفو 5. طبقنا شروط الثقافة والمقايسات المستخدمة في الأصل لوصف العادي الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) 6،7 في المختبر لعدة أورام الدماغ لدى الأطفال والكبار، وإثراء لهذه الخلايا الجذعية مثل الفرز من قبل الخلية للعلامة السلف سطح الخلية العصبية CD133 8 ،9. وCD133 + ورم في المخ جزء الواردة الخلايا التي كان لها تردد أعلى بكثير من بدء الورم من الكسر-CD133-SCID في NOD الماوس العقول 5،10. هذه المنشأة رسميا أن مجموعة فرعية فقط من الخلايا النادرة ورم في المخ مع خصائص الخلايا الجذعية هي ورم الشروع، مما اكسبها اسم "خلايا ورم في المخ بدء" أو "BTICs". تحديد رواية BTICs يقدم رؤى جديدة في تكون الأورام الدماغ البشري، وإعطاء دعم قوي للخلية الجذعية السرطانية فرضية 10-13 كأساس لكثير من الأورام الصلبة، ويحدد هدفا لمزيد من رواية الخلوية علاجات السرطان فعالة 14-20. العلاجات التي تركز على الجزء الأكبر من قتل الورم قد يغيب عن الجذعية نادرة مثل الكسر، والسماح للورم أن تستمر في النمو. العلاجات التي تركز على قتل الخلايا الجذعية السرطانية قد توفر أفضل العلاج والتشخيص للمرضى المصابين بأورام الدماغ.

من أجل دراسة السكان BTIC، قد حسنت نحن لدينا cultuإعادة البروتوكولات لتحديد على وجه التحديد بالنسبة للسكان داخل الخلية البشرية أورام المخ التي تمتلك خصائص الخلايا الجذعية. مصل خالية، الخلايا الجذعية العصبية (NSC) متوسطة يسمح للحفاظ على حالة الخلايا الجذعية غير المتمايزة، وإضافة عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF)، عامل نمو البشرة (EGF)، وعامل مثبط اللوكيميا (LIF) يسمح لل انتشار قوة متعددة، وتجديد الذات، وقابلة للتوسيع tumorspheres الإنسان. هنا، نحن تصف أساليب المشاركة في معالجة أورام الدماغ الأولية والمتوسطة في زراعة لهم NSC لإثراء للسكان BTIC. لقد دعا نظامنا نموذج تجريبي "عزلة المريض BTIC" للتأكيد على حقيقة أن الحد الأدنى فقط مثقف هذه الخلايا الجذعية تحت خلية لتحديد الظروف للسكان الخلايا الجذعية. يوصف أيضا immunolabelling اللاحقة للسكان BTIC لمفتاح علامات الخلايا الجذعية مثل CD133 CD15 وتحليل وتدفق الخلوي. ثم نناقش تحليل تخفيف الحد،الذي يساعد في دراسة إمكانية تجديد الذاتي BTICs. وأخيرا، فإننا استكشاف تحليل التعبير الجيني من هذه الخلايا النادرة عن طريق الفرز الخلايا واحدة على الشرائح AmpliGrid وأداء خلية واحدة RT-PCR. هذه التقنيات تنطبق أيضا على أورام المخ الأخرى مثل بطاني عصبي، والاورام الدبقية نخاعي للأطفال.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ثقافة الأنسجة استئصال ورم من الدماغ

  1. أضف 200 ميكرولتر Liberase إذابة (روش العلوم التطبيقية) إلى 15 مل من السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF-أنظر الجدول 1) والمكان الى 37 درجة C حمام مائي. Liberase TM هي مزيج من الأنزيمات المحللة للبروتين يستخدم لفصل عينات الأنسجة الابتدائية، وكذلك tumorspheres مثقف. على عكس التربسين EDTA-، وطريقة Liberase يحافظ على CD133 المستضد السطحي. لعينة الأنسجة من حوالي 0.5 سم ونحن استخدام 200 ميكرولتر من Liberase. إذا كانت الأنسجة أصغر، ونحن استخدام 100 UL.
  2. جلب محلول كلوريد الأمونيوم (تقنيات الخلايا الجذعية) إلى درجة حرارة الغرفة. محلول كلوريد الأمونيوم lyses بلطف خلايا الدم الحمراء مع تأثير ضئيل على الخلايا الأخرى. أنه لا يحتوي على مثبت.
  3. في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية العقيمة، إضافة 5 مل من عينة ACSF لدوامة، حاوية لشطف الأنسجة، ثم قبالة ماصة. هذه الخطوة يساعد على إزالة خلايا الدم الحمراء (RBC).
  4. نقل الدماغ أنسجة الورم إلى 100 مم العقيمة دي بتريش.
  5. باستخدام مقص أو المشارط وغرامة ملقط، تفصيل الأنسجة لاتساق الطين.
  6. جمع العينة باستخدام ماصة 10 مل العادية أو ملقط وشظايا نقل في أنبوب يحتوي على ACSF قبل تحسنت مع Liberase.
  7. يوم حاضنة شاكر (30 دورة في الدقيقة) وتعيين إلى 37 ° C، لمدة 15 دقيقة.
  8. تصفية المحللة الأنسجة الى 70 ميكرومتر مصفاة الخلية في أنبوب 50 مل الصقر.
  9. تدور الترشيح لأسفل في 280 x ج لمدة 5 دقائق.
  10. إزالة طاف بعناية وتقييم حجم ولون الخلية الناتجة بيليه: الكريات التي هي الوردي أو الأحمر تشير إلى تزايد أعداد خلايا الدم الحمراء.
  11. إعادة تعليق بيليه في برنامج تلفزيوني 1 مل.
  12. إضافة كمية مناسبة من محلول كلوريد الأمونيوم (4-12 مل) على أساس حجم التلوث والأحمر بيليه الخلية (الحل كلوريد الأمونيوم هو لطيف جدا وزيادة كميات غير ضارة إلى خلايا أخرى من خلايا الدم الحمراء).
  13. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  14. تدور الخلايافي 280 XG أسفل لمدة 5 دقائق.
  15. يغسل مرة واحدة مع 10 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة.
  16. resuspend في 5 مل المتوسطة NSC كاملة (الجدول 2) ونقل إلى منخفضة للغاية ملزم لوحة 60 ملم زراعة الأنسجة (كورنينج). نستخدم منخفضة للغاية لوحات الثقافة ملزم مع الأسطح هيدروجيل المستعبدين تساهميا التي هي ماء، واتهم محايد، للحد من الخلية بوساطة المرفق التمايز.

في الأيام الأولي في الثقافة، لا تقم بتغيير وسائل الإعلام: زيادة الرصيد فقط مع وسائل الاعلام مل 1-2 حسب الحاجة، ثم متابعة لمراقبة وسائل الإعلام والثقافة، وتغيير لون عند وسائل الإعلام يصبح أصفر قليلا.

2. Tumorsphere التفكك لقياس التدفق الخلوي

  1. تقييم tumorspheres تحت المجهر: إذا كان حجم المجال هو> 100 ميكرون، كما ينصح التفكك أكبر المجالات قد تصبح نخرية في المركز.
  2. نقل الثقافة إلى أنبوب 15 مل المخروطية.
  3. إضافة 2-3 مل العقيمة PBS لشطف لوحة جيدا وإضافة إلى أنبوب مخروطي الشكل.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 280 x ج لمدة 5 دقائق.
  5. إزالة طاف و resuspend في 1 - 2 مل العقيمة PBS.
  6. إضافة 10 ميكرولتر Liberase.
  7. احتضان في 37 ° C حمام الماء لمدة 3 دقائق. إزالة التعليق وتقييم بصريا، إذا كتل متعددة ينظر، يسحن بلطف باستخدام ماصة ميكرولتر 1000 تلميح.
  8. إذا استمرت التثاقل، لا تزال الحضانة ل1-2 دقيقة إضافية.
  9. غسل الخلايا عن طريق إضافة 5 مل العقيمة PBS الطرد المركزي في 280 وx ج لمدة 5 دقائق.
  10. إزالة طاف و resuspend في 500-1،000 ميكرولتر PBS العقيمة EDTA ملي +2.
  11. تقييم عدد الخلايا وقدرتها على البقاء باستخدام التريبان الأزرق.
  12. ضبط عدد خلايا إلى 1 مل / مليون في ملي EDTA PBS +2.

3. تلوين السطح

  1. نقل 100 ميكرولتر من خلية التعليق 1x10 6 / مل لكل اختبار لأنابيب تدفق 12x75 ملم.
  2. إضافة كمية مناسبة من الأجسام المضادة. وينبغي أن تستخدم ضوابط نمط إسوي المتطابقة لكلالأجسام المضادة (انظر الجدول 3).
  3. احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد.
  4. إضافة 2 مل PBS +2 ملم EDTA لكل أنبوب تدفق.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 4 صب، وصمة عار دقيقة.
  6. إعادة تعليق بيليه في 300 ميكرولتر PBS EDTA ملي +2.
  7. إضافة 10 ميكرولتر صبغة الجدوى 7AAD إلى كل أنبوب واحتضان ما لا يقل عن 15 دقيقة على الجليد.
  8. تحليل التدفق الخلوي من قبل.

4. تدفق اقتناء الخلوي والتحليل

خصوصيات اقتناء وتحليل تدفق البيانات هي أداة تعتمد على. يتم تشغيل العينات سلبية ممثل وإعدادات أداة المنشأة لإعادة توجيه (حجم) والجانبية (التفاصيل) مبعثر. هذا النمط يسمح مبعثر المستخدم النهائي لعرض كافة الخلايا في العينة، بما في ذلك الحطام. ويوجه عادة المنطقة حول الخلايا المثيرة للاهتمام. ثم وضعت (الشكل 4A) إعدادات لجميع أجهزة الكشف عن مضان اللازمة لوضع الخلايا السلبية في العقد الأول من AFluorescence شدة المؤامرة. عندما يتم استخدام أكثر من صبغة أو ملون تألقي، يجب تشغيل الضوابط الملون واحدة لإنشاء القيم تعويض اللون (الطرح بالتدخل الانبعاثات مضان). عند تشغيل الخلايا الحية، صبغة حيوية مثل AAD-7 (7 أمينية أكتينوميسين D - 488/emission الإثارة 655) وتستخدم والمنطقة الثانية الانتباه إلى استبعاد الخلايا الميتة (الشكل 4B). يتم تطبيق كل من هذه المناطق إلى أي مزيد من التحليل للعينات.

5. تجديد الفحص الذاتي

الفحص المفتاح الذي تم تيسيره إلى حد كبير نتيجة للنمو المجال نسيلي هو الاختبار في المختبر الذاتي تجديد القدرات، والتخفيف مقايسة الحد. Tumorspheres هي فصل وزعت في التخفيفات وصولا الى خلية واحدة لكل بئر، ويتم حساب معدل تكوين المجال لاحقة أكثر من 7 أيام في الثقافة. في يوم 7، ويتم احتساب النسبة المئوية للآبار التي لا تحتوي على المجالات لكل خلية كثافة الطلاء (F 0) وتآمرضد عدد من الخلايا لكل بئر (X). يتم تحديد عدد من الخلايا المطلوبة لتشكيل واحدة على الأقل في كل tumorsphere جيدا من النقطة التي يتقاطع الخط مع مستوى 0.37 (F 0 = E-X). في توزيع بواسون من الخلايا، F 0 = 0.37 يتوافق مع التخفيف من خلية واحدة لكل بئر، حتى هذا الحساب (37٪ تتقاطع) يعكس وتيرة الخلايا الجذعية في مولد الرمع السكان خلية كاملة (الشكل 5).

6. واحدة خلية RT-PCR

يتم تصنيف الخلايا واحدة من مجموعات سكانية مختلفة من MoFlo بيكمان كولتر XDP على مواقع التفاعل على الشريحة AmpliGrid (بيكمان كولتر القط # AG480F). يتم تنفيذ واحد الخلية RT-PCR باستخدام AmpliGrid واحدة خطوة واحدة RT-PCR النظام (بيكمان كولتر القط # OAX04515) وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. لفترة وجيزة، وتودع خلية واحدة في كل موقع من رد فعل شريحة AmpliGrid، وجود خلية واحدة في كلموقع رد الفعل أكده المجهري. يتم تنفيذ النسخ العكسي (RT) مباشرة بعد الفرز لمنع العينة من خطر. ويتم إعداد هذا المزيج ماجستير RT جديدة، وفقا لتعليمات طقم (الجدول 4). كنا 0.03 ميكرولتر من الاشعال 25 ميكرومتر عشوائية (Promega) في رد فعل؛ يتم إضافة 1 ميكرولتر من مزيج الرئيسي إلى مركز كل موقع رد الفعل. وهي مغلفة على الفور مع هذا 5 ميكرولتر من حل الختم (بيكمان كولتر القط # OAX04503). باستخدام AmpliSpeed ​​cycler الشريحة (بيكمان كولتر، القط # OAX04101)، وحضنت الشرائح عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، و 42 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، و 55 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. بعد إضافة النسخ العكسي، 3 ميكرولتر من الدناز / ريبونوكلياز خالية المياه إلى كل موقع رد الفعل، والخليط كله نقل إلى أنبوب PCR (1 أنبوب / الموقع). في لوحة PCR، يتم استخدام وحدة تخزين رد فعل 10 ميكرولتر لPCR الكمي: 8 ميكرولتر مزيج الرئيسي qPCR (5 ميكرولتر Sybr الأخضر (كوانتا)، 1 ميكرولتر المياه، 1 ميكرولتر من 10 ميكرومتر إلى الأمام وعكس مزيج التمهيدي)، بالإضافة إلى 2 &مو؛ لتر من الخليط RT. يتبع 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، 45 ° C دورات 95 ل30 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 60 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 60 ثانية،: في الوقت الحقيقي الكمي، يتم تشغيل العينات على cycler BioRad باستخدام البرنامج التالي من 10 دقيقة عند 72 ° C وتحليل منحنى ذوبان. تم تحديد القيم ط م باستخدام مرصد Opticon 3 (BioRad). ويمكن تقييم ثلاثة جينات في كل خلية، بما في ذلك GAPDH باسم الجينات التدبير المنزلي. وتطبيع التعبير الجيني في التعبير GAPDH، وفقا ل2-ΔCt. ويمكن استخدام ما لا يقل عن واحد من اثني عشر خلايا من السكان من نفس النوع نفس البيولوجية يعيد للتعويض عن عدم وجود التقنية مكررات.

7. ممثل النتائج

ويظهر الشكل 1 التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) فحص المريض مع ممثل GBM. ويتم الحصول على عينات من المرضى ورم في المخ توافق على الفور بعد الجراحة، كما وافق عليه هاميلتون العلوم الصحية / S ماكماستر الصحةciences مجلس أخلاقيات البحوث. ويرد جزء من كل عينة إلى أمراض الأعصاب للتشخيص السريري الروتيني. تتم معالجة العينة المتبقية كما هو موضح في الشكل 2. الخلايا السرطانية، مطلية كاملة مرة واحدة في وسائل الإعلام الخلايا الجذعية العصبية مع عوامل النمو، كما هو موضح شكل tumorspheres في الشكل 3.

وصفت الخلايا العصبية ورم مع علامات سطح الخلية الجذعية CD133 CD15 وتحليلها من قبل والتدفق الخلوي كما هو مبين في الشكل 4.

واحد من الخلايا المختلفة لسكان مثل CD15 + / + CD133، CD15 + /-CD133، CD15-/CD133 +، CD15-/CD133- بعد ذلك يتم فرز 96 في لوحات جيدة (الشكل 5A) أو إلى شرائح AmpliGrid (الشكل 6A).

في لوحة 96 أيضا، يمكن أن الخلايا التي تمتلك واحدة الذاتي تجديد القدرات (مثل CD133 + الخلايا)، (الشكل 5B)، تشكل tumorspheres (الشكل 5C) بعد incubation. يمكن رسم رسم بياني الذاتي تجديد (الشكل 5D) عن طريق حساب عدد من المجالات شكلت لكل بئر. خلايا مفردة مصنفة في موقع رد الفعل من الشريحة Ampligrid (الشكل 6A). يمكن للخلايا الحمض النووي الريبي المستخرج من احد كتب عكس باستخدام AmpliSpeed ​​Advalytix (الشكل 6B). يتم استخدام [كدنا] تم الحصول عليها لأداء في الوقت الحقيقي RT-PCR (الشكل 6C).

الشكل 1
الشكل 1. صورة الرنين المغناطيسي (MRI) لGBM المريض. التصوير بالرنين المغناطيسي للدماغ من فتاة عمرها 16 عاما مع تاريخ لمدة شهر من الصداع وتاريخ أسبوع واحد من الخمول والقيء وعدم وضوح بصرية. تسلسل FLAIR المحوري يظهر كبيرة ثنائية في نصف الكرة الغربي ("فراشة") GBM.

الشكل 2
الشكل 2. الدماغ معالجة الورم. عينات من ورم في المخ obtaINED من توافق المرضى بعد الجراحة مباشرة. هم فصل ميكانيكيا كما هو موضح (أ) ويتم بعد ذلك فصل إنزيمي في ACSF مع Liberase من احتضان في حاضنة دورة في الدقيقة 30 هزاز في C ° 37 لمدة 15 دقيقة (ب).

الشكل 3
الشكل 3. السكان BTIC تشكيل tumorspheres في الثقافة. فصل خلايا ورم في المخ العصبية كاملة مطلي في وسائل الإعلام الخلايا الجذعية مع عوامل النمو تشكيل tumorspheres.

الشكل 4
الشكل 4. تحليل تدفق السكان cytometric BTIC (أ) إلى الأمام مقابل خصائص مبعثر الجانب تقديم صورة من جميع الخلايا، بما في ذلك الحطام (ب) يتم استبعاد الخلايا التي وصمة عار مع بقاء الصبغة 7-AAD من التحليل. (ج) يتم تحديد موقف الأرباع الإحصائية باستخدام عناصر تحكم نمط إسوي المناسب (د) خلايا ورم ملطخة أماه سطحrkers CD15-PE وCD133 APC. (د) Moflo فارز الخلية XDP. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 5
الشكل 5. الحد تحليل التخفيف من BTICs يكشف اعتمادهم على تجديد القدرات. (أ) يتم تصنيف الخلايا من التخفيفات متفاوتة في 96 بئرا تحتوي على 200 ميكرولتر من خلية إلى NSC (ب) واحد لكل بئر. (ج) بعد فترة حضانة لمدة 7 أيام، يتم تشكيل tumorsphere. مورفولوجية tumorspheres الثانوية لانه مطابق للtumorspheres الأولية. يمكن (د) يتم حساب متوسط ​​القيم X-اعتراض من الحد تحليل التخفيف لكل ورم النوع الفرعي للكشف عن عدد من الخلايا المطلوبة لتشكيل واحدة على الأقل tumorsphere لكل بئر.

الشكل 6
الشكل 6. تحليل الجينات التعبير من خلية واحدة BTICمن الممكن استخدام الخلايا واحدة RT-PCR التكنولوجيا. (أ) يمكن فرز الخلايا واحدة من السكان BTIC على الشرائح AmpliGrid. (ب) يتم تنفيذ التوليف [كدنا] على خلايا واحد على الشرائح باستخدام AmpliGrid AmpliSpeed ​​Advalytix. (ج) يتم تنفيذ الكمية PCR الوقت الحقيقي على [كدنا] توليفها من الخلايا BTIC واحد.

2M كلوريد الصوديوم 62 مل
1M بوكل 5 مل
1M MgCl 2 3،2 مل
155 مم 3 NaHCO 169 مل
1M الجلوكوز 10 مل
108 مم CaCl 2 0.9256 مل
Purelab الترا H 2 0 749.84 مل

الجدول 1 السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) - 1000 مل.

وسائل الاعلام الأسهم بصل 500 مل
01:01 DMEM: F12 480 مل
N2 الملحق 5 مل
1M HEPES 5 مل
جلوكوز 3،0 ز
N-أسيتيل (60 ميكروغرام / مل) 1 مل
العصبية عامل بقاء-1 (NSF-1) 10 مل

الجدول 2. وسائل الاعلام العصبية الخلايا الجذعية.

وسائل الإعلام NSC كاملة (مصنوعة الطازجة قبل استخدامها):
وسائل الإعلام NSC القاعدية + 20 نانوغرام / مل EGF (عامل نمو البشرة) + 20 نانوغرام / مل bFGF (عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية) + 10 نانوغرام / مل LIF (عامل مثبط اللوكيميا) * + 10 ميكرولتر / مل للمضادات الحيوية مضاد فطري

* عامل مثبط اللوكيميا (LIF): هذا كاشف من ميليبور يحتوي على خلوى انترلوكين فئة 6، العلاقات العامةotein الذي يكبت تمايز الخلايا الجذعية عفوية تعزيز الصيانة على المدى الطويل من الثقافات الخلايا الجذعية.

الأجسام المضادة المورد / CAT # ميكرولتر / الاختبار (في 100 ميكرولتر)
CD133 / 2 APC (293C3) Miltenyi Biotec/130-090-854 5
IgG2b APC (نمط إسوي التحكم) Miltenyi Biotec/130-092-217 5
CD15PE بيكمان Coulter/IM1954U 5
IgG2a PE (نمط إسوي التحكم) بيكمان Coulter/A09141 5
7AAD بيكمان Coulter/A07704 10

الجدول 3. الأجسام المضادة للتدفق.

عنصر حجم (1 رد فعل) حجم (48 رد فعل)
2X واحدة رد فعل العازلة RT الخليوي 0،50 ميكروليتر 30،0 ميكرولتر
ريبونوكلياز المانع (10 U / ميكرولتر) 0،02 ميكروليتر 1،2 ميكروليتر
5X واحدة خلية RT محسن 0،15 ميكروليتر 9،00 ميكروليتر
واحد ميكس خلية RT إنزيم 0،04 ميكروليتر 2،4 ميكروليتر
Advablue (OAX04227) ميكرولتر 0.1 6،00 ميكروليتر
نوكلياز مجانا الماء تشكل إلى 1 ميكرولتر جعل ما يصل إلى 60 ميكروليتر

الجدول 4. تكوين مزيج الرئيسي لRT RTPCR خلية واحدة (القط # OAX04515).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخلايا الجذعية السرطانية فرضية 10، على أساس العمل في سرطان الدم 21، 11 و سرطان الثدي سرطان الدماغ 4،5، تشير إلى أن نسبة صغيرة فقط من الخلايا نسبيا في الورم، ووصف الخلايا الجذعية السرطانية، تمتلك القدرة على الانتشار على نطاق واسع والنفس التجديد. معظم الخلايا السرطانية تفقد القدرة على التكاثر وتجديد الذات لأنها تفرق في الخلايا التي تصبح التوقيع المظهري للورم. سوف العثور على الخلايا الرئيسية في الدماغ ورم السكان التي تكون قادرة على الحفاظ على الورم تعطي نظرة ثاقبة في آلية تكون الأورام في الدماغ، وسوف تسمح لنا تعود إلى الخلية الأصلية.

وتعرف الخلايا الجذعية وظيفيا كخلايا الذاتي تجديد الذي يحمل نسب متعددة التمايز 22-24. ويزرع ورم في المخ الأولية الأنسجة تحت ظروف الثقافة التي تحبذ نمو الخلايا الجذعية، التي أنشئت سابقا لعزل الخلايا الجذعية العصبية كما tumorspheres 6،26. بغض النظر عن النوع الفرعي المرضية، في غضون 24 إلى 48 ساعة من الثقافة الأولية، وأورام الدماغ الأكثر تسفر عن جزء قليل من الخلايا التي تظهر النمو في مجموعات neurosphere مثل المستمدة clonally، أو tumorspheres. وبالتالي نحن قادرون على إثراء للسكان BTIC من المريض أنسجة ورم في المخ.

وقد سمح ظهور خلية الفلورسنت متعددة المعلمة تنشيط فرز 27 و تكنولوجيا الأجسام المضادة وحيدة النسيلة 28 لتنقية الخلايا الجذعية السرطانية يعتمد على علامات سطح الخلية. باستخدام علامات الخلايا الجذعية مثل CD133 CD15 و، كنا قادرين على فرز مستقبلي للسكان محددة الخلايا الجذعية مثل ودراسة اعتمادهم على تجديد القدرات عن طريق إجراء فحوصات تخفيف الحد. A caveaوقدم طن من التجديد الذاتي من المقايسات دراسة حديثة تبين أن في المختبر الذاتي تجديد لا ترتبط دائما مع تشكيل الورم في نماذج الماوس 29. ومع ذلك أظهرت مؤخرا أن عملنا في المقايسات الذاتي تجديد المختبر لا ترتبط بقاء المريض، مما يجعل هذه المقايسات قيمة في الدراسة الجارية البيولوجيا BTIC 30.

العمل مع الأنسجة البشرية الأساسية تحديات تقنية كثيرة. يجب أن يتم تنفيذ معالجة الأنسجة بلطف جدا للحفاظ على سلامة الخلايا المعزولة. كمية Liberase المستخدمة ووقت الحضانة أمر بالغ الأهمية. يمكن أن يكون الأمثل الفرز تدفق الخلايا لزيادة بعد فرز الجدوى باستخدام فتحات مختلفة والضغوط. نجد أن خلايانا يفضلون أن يتم فرز من خلال فوهة 100μm في 30 رطل لكل بوصة مربعة من الضغط غمد. قد يكون الترتيب على مواقع Ampligrid رد الفعل يكون من الصعب بعض الشيء الشريحة: من المهم أن تؤكد وجود الخلية التي أودعتها المجهري.

31. وتتألف عادة من خلايا أورام المخ المختلفة التي تعبر عن شكليا مجموعة متنوعة من علامات النسب العصبية. وقد أسفرت دراسة أورام المخ عن طريق التشريح المرضي التقليدية فقط كمية محدودة من معرفة سلوك السريرية للورم. وعلى الرغم من إحراز تقدم كبير في فهم التغيرات الجينية الجزيئية لبعض أورام المخ 3،32-34، وخاصة الاورام الدبقية medulloblastomas الخبيثة، وبعض هذه التعديلات التي تم تحديدها بدأت الآن لتوجيه العلاج، فإنه ليس من الواضح ما إذا كان الورم جميع الخلايا تعادل في قدرتها على الحفاظ على نمو الورم. تحليل الجينات الرئيسية المشاركة في مسارات الإشارات في السكان ورم في المخ أمر بالغ الأهمية لتعزيز فهمنا لآليات الشاذة التي تؤدي إلى تشكيل ورم في المخ. حتى في ما يبدو متجانسةنسيج عقل، وخلايا يثبت ليكون فريدا في قدراتهم المحتملة. تحليل مستويات التعبير نص والبروتين في الخلايا واحدة تكشف عن أن هناك خلية كبيرة خلايا الاختلاف سواء في حالة الراحة وعند تعرضها للمؤثرات 35-39. لذلك، سوف تحليل جميع السكان من الخلايا لا تكشف عن سلوك خلية واحدة. ويعتبر QRT-PCR ليكون المعيار الذهبي لالكمي مرنا 40-41. في هذه الدراسة، أن نبرهن الفرز المحتملين من الخلايا الفردية من السكان متميزة على الشرائح AmpliGrid. باستخدام خلية واحدة RT-PCR، ونحن قادرون على أداء الجينات تحليل التعبير على خلية واحدة من السكان غير متجانسة، وبالتالي تقييم الأهمية البيولوجية للخلية محددة ضمن السكان مختلطة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل معهد أبحاث السرطان أونتاريو (OICR)، ومؤسسة تيري فوكس والرابطة الأمريكية لجراحي الأعصاب.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1:1 DMEM:F12 Invitrogen 11320-082
N2 supplement Invitrogen 17502-048
1M HEPES Wisent Inc. 330-050-EL
Glucose Invitrogen 15023-021
N-acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165-25g
Neural survival factor -1 (NSF-1) Lonza Clonetics CC-4323
Epidermal growth factor (EGF) Sigma-Aldrich E9644
Basic fibroblast growth factor (bFGF) Invitrogen PHG0261
Leukemia inhibitory factor (LIF) EMD Millipore LIF1010
Antibiotic/mycotic Wisent Inc. 450-115-EL
Liberase TM Roche Group 05 401 119 001
Ammonium chloride solution Stem Cell Technologies 07850

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ohgaki, H., Kleihues, P. Epidemiology and etiology of gliomas. Acta Neuropathol. 109, 93 (2005).
  2. Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma. 10, 319 (2010).
  3. Wechsler-Reya, R., Scott, M. P. The developmental biology of brain tumors. Annu. Rev. Neurosci. 24, 385 (2001).
  4. Singh, S. K. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Res. 63, 5821 (2003).
  5. Singh, S. K. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396 (2004).
  6. Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev. Biol. 175, 1 (1996).
  7. Tropepe, V. Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev. Biol. 208, 166 (1999).
  8. Yin, A. H. AC133, a novel marker for human hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 90, 5002 (1997).
  9. Yu, Y., Flint, A., Dvorin, E. L., Bischoff, J. AC133-2, a novel isoform of human AC133 stem cell antigen. J. Biol. Chem. 277, 20711 (2002).
  10. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414, 105 (2001).
  11. Al-Hajj, M. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 3983 (2003).
  12. Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat. Med. 3, 730 (1997).
  13. Matsui, W. Characterization of clonogenic multiple myeloma cells. Blood. 103, 2332 (2004).
  14. Bao, S. Targeting cancer stem cells through L1CAM suppresses glioma growth. Cancer Res. 68, 6043 (2008).
  15. Bao, S. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444, 756 (2006).
  16. Bao, S. Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor. Cancer Res. 66, 7843 (2006).
  17. Beier, D. Temozolomide preferentially depletes cancer stem cells in glioblastoma. Cancer Res. 68, 5706 (2008).
  18. Piccirillo, S. G. Distinct pools of cancer stem-like cells coexist within human glioblastomas and display different tumorigenicity and independent genomic evolution. Oncogene. 28, 1807 (2009).
  19. Piccirillo, S. G. morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature. 444, 761 (2006).
  20. Rich, J. N., Bao, S. Chemotherapy and cancer stem cells. Cell Stem Cell. 1, 353 (2007).
  21. Lapidot, T. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367, 645 (1994).
  22. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414, 105 (2001).
  23. Fuchs, E., Segre, J. A. Stem cells: a new lease on life. Cell. 100, 143 (2000).
  24. Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157 (2000).
  25. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707 (1992).
  26. Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes. J. Neurosci. 12, 4565 (1992).
  27. Hulett, H. R., Bonner, W. A., Barrett, J., Herzenberg, L. A. Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence. Science. 166, 747 (1969).
  28. Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495 (1975).
  29. Barrett, L. E. Self-renewal does not predict tumor growth potential in mouse models of high-grade glioma. Cancer Cell. 21, 11 (2012).
  30. Venugopal, C. Bmi1 marks intermediate precursors during differentiation of human brain tumor initiating cells. Stem Cell Res. 8, 141 (2012).
  31. Gerlinger, M. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883 (2012).
  32. Gilbertson, R. J. Medulloblastoma: signalling a change in treatment. Lancet. Oncol. 5, 209 (2004).
  33. Zhu, Y., Parada, L. F. The molecular and genetic basis of neurological tumours. Nat. Rev. Cancer. 2, 616 (2002).
  34. Maher, E. A. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15, 1311 (2001).
  35. Blake, W. J., KAErn, M., Cantor, C. R., Collins, J. J. Noise in eukaryotic gene expression. Nature. 422, 633 (2003).
  36. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297, 1183 (2002).
  37. Maheshri, N., O'Shea, E. K. Living with noisy genes: how cells function reliably with inherent variability in gene expression. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 413 (2007).
  38. Raj, A. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4, e309 (2006).
  39. Ross, I. L., Browne, C. M., Hume, D. A. Transcription of individual genes in eukaryotic cells occurs randomly and infrequently. Immunol. Cell Biol. 72, 177 (1994).
  40. Kubista, M. The real-time polymerase chain reaction. Mol. Aspects Med. 27, 95 (2006).
  41. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat. Protoc. 1, 1559 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats