प्राथमिक ब्रेन ट्यूमर ऊतक के स्टेम सेल assays और फ्लो छंटनी के लिए प्रसंस्करण

Medicine

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Summary

मस्तिष्क ट्यूमर की शुरुआत कोशिकाओं (BTICs), एक विषम ट्यूमर रखने स्टेम सेल के गुण के भीतर दुर्लभ कोशिकाओं की पहचान मानव मस्तिष्क ट्यूमर रोगजनन में नए अंतर्दृष्टि प्रदान करता है. हम विशिष्ट संस्कृति शर्तों परिष्कृत किया है BTICs के लिए समृद्ध है, और हम नियमित प्रवाह cytometry का उपयोग करने के लिए आगे इन आबादियों को समृद्ध. आत्म नवीकरण और प्रतिलिपि विश्लेषण assays एकल कक्ष RT-पीसीआर द्वारा बाद में इन अलग कक्षों पर प्रदर्शन किया जा सकता है.

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Venugopal, C., McFarlane, N. M., Nolte, S., Manoranjan, B., Singh, S. K. Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting. J. Vis. Exp. (67), e4111, doi:10.3791/4111 (2012).

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Abstract

ब्रेन ट्यूमर आम तौर पर कि तंत्रिका वंश मार्करों के एक किस्म व्यक्त morphologically विविध कोशिकाओं के शामिल हैं. केवल ट्यूमर कोशिकाओं के स्टेम सेल के गुण के साथ अपेक्षाकृत छोटे, अंश करार दिया मस्तिष्क ट्यूमर की शुरुआत कोशिकाओं (BTICs), कई प्रजातियों के साथ अंतर, आत्म नवीकरण, और vivo में ट्यूमर आरंभ करने की क्षमता के अधिकारी. हम संस्कृति मूल रूप से सामान्य मानव मस्तिष्क ट्यूमर का एक किस्म तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) के लिए इस्तेमाल किया और पाया कि इस संस्कृति विधि विशेष रूप से स्टेम जैसे आबादी के लिए चयन की स्थिति लागू होता है. सीरम मुक्त मध्यम (एनएससी) एक undifferentiated स्टेम सेल राज्य के रखरखाव के लिए अनुमति देता है, और bFGF और EGF के अलावा बहु शक्तिशाली, स्वयं renewing के प्रसार और विस्तार tumorspheres के लिए अनुमति देता है.

आगे प्रत्येक ट्यूमर BTIC जनसंख्या विशेषताएँ, हम प्रवाह cytometry द्वारा कोशिका की सतह मार्करों का मूल्यांकन. हम भी अधिक विशिष्ट characteriz के लिए ब्याज की आबादी को हल कर सकते हैंसमझना. आत्म नवीकरण assays एक साथ 96 प्लेटों में हल BTICs पर प्रदर्शन कर रहे हैं, 37 पर ऊष्मायन के बाद tumorspheres के गठन डिग्री सेल्सियस एक स्टेम या पूर्वज सेल की उपस्थिति का संकेत है. एक विशेष जनसंख्या के एकाधिक सेल नंबर भी कमजोर पड़ने विश्लेषण को सीमित करने के लिए अलग कुओं में हल किया जा, आत्म नवीकरण क्षमता का विश्लेषण. हम भी एक विशेष सेल की आबादी के भीतर एकल कक्ष RT-पीसीआर का उपयोग करके अंतर जीन की अभिव्यक्ति का अध्ययन कर सकते हैं.

निम्नलिखित प्रोटोकॉल हदबंदी और प्राथमिक मानव नमूनों के संवर्धन BTIC आबादी, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से लिए tumorspheres की हदबंदी को समृद्ध करने के लिए हमारे प्रक्रियाओं का वर्णन. भी शामिल हैं प्रवाह cytometry विश्लेषण या छँटाई, आत्म नवीकरण assays, और एकल कक्ष RT-पीसीआर के लिए धुंधला करने के लिए प्रोटोकॉल.

Introduction

ब्रेन ट्यूमर के सबसे आक्रामक और विषम मनुष्यों में जाना जाता है कैंसर के बीच हैं. हालांकि उनके पहले पता लगाने और निदान आधुनिक प्रौद्योगिकी न्यूरो इमेजिंग द्वारा मदद की है, हम अभी भी कई मस्तिष्क ट्यूमर के लिए उपचारात्मक चिकित्सा फैलाना, आक्रामक या मस्तिष्क में गहरी स्थित उन लोगों के लिए विशेष रूप से कमी है.

ब्रेन ट्यूमर उनके बेहद आक्रामक और अक्सर लाइलाज प्रकृति के कारण बच्चों में कैंसर मृत्यु दर का प्रमुख कारण का प्रतिनिधित्व करते हैं. Glioblastoma (जीबीएम), सबसे आम वयस्कों में प्राथमिक मस्तिष्क ट्यूमर, एक सबसे आक्रामक मानव कैंसर, अपनी समान रूप से घातक 1 रोग का निदान के लिए डर था की है. यह अत्यधिक घातक astrocytic ट्यूमर (डब्ल्यूएचओ ग्रेड 4) आमतौर पर वयस्कों के मस्तिष्क गोलार्द्धों में होता है, और भी युवा बच्चों और शिशुओं में हो सकता है. इसके विकास तेजी से और infiltrative है, और नैदानिक ​​रोग सुविधाओं परमाणु pleomorphism, microvascular प्रसार, और 2,3 परिगलन शामिल हैं. Adul के लिएटीएस नव निदान जीबीएम साथ, बीच का अस्तित्व शायद ही कभी 12 1 महीने से परे सभी चिकित्सकीय तौर तरीकों के लिए आम तौर पर गरीब प्रतिक्रियाओं के साथ फैली हुई है. हमने देखा है कि वहाँ कई कार्यात्मक और आनुवंशिक दैहिक स्टेम कोशिकाओं और कैंसर कोशिकाओं द्वारा साझा समानताएं हैं, और है कि आणविक मार्ग है कि सामान्य मस्तिष्क के विकास को विनियमित अक्सर कैंसर में dysregulated हैं. ब्रेन ट्यूमर का अध्ययन करने के लिए स्टेम कोशिका जीव विज्ञान मानदंड लागू करने में, हम पहले करने के लिए भावी की पहचान करने के लिए और मानव GBMs जो प्रसार, आत्म नवीकरण के स्टेम सेल के गुण का प्रदर्शन से कोशिकाओं के एक subpopulation शुद्ध शोधकर्ताओं थे, और 4 में इन विट्रो में और भेदभाव 5 vivo. हम संस्कृति शर्तों और assays मूल रूप में इन विट्रो 6,7 सामान्य तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) कई बाल चिकित्सा और वयस्क मस्तिष्क ट्यूमर के लिए चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया लागू, और सेल द्वारा इन स्टेम कोशिकाओं की तरह के लिए समृद्ध तंत्रिका पूर्वज सेल सतह मार्कर के लिए छंटाई 8 CD133 ,9. CD133 + मस्तिष्क ट्यूमर अंश निहित कोशिकाओं कि CD133 अंश से इशारा-SCID माउस दिमाग 5,10 में ट्यूमर दीक्षा का एक बहुत उच्च आवृत्ति था. यह औपचारिक रूप से स्थापित है कि केवल स्टेम सेल के गुण के साथ मस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं के एक दुर्लभ सबसेट ट्यूमर का आरंभ करते हैं, उन्हें कमाई का नाम "मस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं की शुरुआत" या "BTICs" हैं. उपन्यास BTICs की पहचान मानव मस्तिष्क tumorigenesis में नए अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, कई ठोस ट्यूमर के लिए आधार के रूप में कैंसर स्टेम सेल 10-13 परिकल्पना के लिए मजबूत समर्थन दे रही है, और अधिक प्रभावी कैंसर 14-20 उपचार के लिए एक उपन्यास सेलुलर लक्ष्य स्थापित. चिकित्सा कि ट्यूमर का थोक हत्या पर ध्यान केंद्रित दुर्लभ स्टेम जैसे अंश याद, ट्यूमर विकसित करने के लिए जारी रखने के लिए अनुमति दे सकते हैं. चिकित्सा कि कैंसर स्टेम सेल को मारने पर ध्यान केंद्रित करने और मस्तिष्क ट्यूमर के साथ रोगियों के लिए बेहतर उपचार रोग का निदान प्रदान कर सकता है.

आदेश में BTIC आबादी का अध्ययन करने के लिए, हम हमारे cultu परिष्कृत किया हैफिर प्रोटोकॉल के लिए विशेष रूप से मानव मस्तिष्क ट्यूमर के भीतर सेल आबादी है कि स्टेम सेल के गुण के अधिकारी के लिए चयन के लिए. सीरम मुक्त, तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी), मध्यम एक undifferentiated स्टेम सेल राज्य के रखरखाव के लिए अनुमति देता है और बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF), epidermal वृद्धि कारक (EGF), और लेकिमिया निरोधात्मक कारक (lif) के अलावा के लिए अनुमति देता है बहु शक्तिशाली, स्वयं renewing, और विस्तार योग्य मानव tumorspheres के प्रसार. यहाँ, हम प्राथमिक मस्तिष्क ट्यूमर और उन्हें एनएससी BTIC आबादी के लिए समृद्ध मध्यम में संवर्धन के प्रसंस्करण में शामिल विधियों का वर्णन हम हमारे प्रयोगात्मक मॉडल प्रणाली "BTIC रोगी आइसोलेट्स" तथ्य यह है कि इन कोशिकाओं केवल न्यूनतम स्टेम तहत संवर्धित कर रहे हैं पर जोर बुलाया है. सेल स्टेम सेल आबादी के लिए चयन करने की स्थिति. CD133 और CD15 और प्रवाह cytometry विश्लेषण के रूप में महत्वपूर्ण स्टेम सेल मार्कर के लिए BTIC आबादी के बाद immunolabelling भी वर्णित है. हम तो सीमित कमजोर पड़ने विश्लेषण पर चर्चा,जो आत्म नवीकरण BTICs की क्षमता का अध्ययन करने में मदद करता है. अंत में, हम AmpliGrid स्लाइड पर एकल कक्षों छंटाई और एकल कक्ष RT-पीसीआर प्रदर्शन द्वारा इन दुर्लभ कोशिकाओं के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण का पता लगाने. इन तकनीकों में भी कर रहे हैं medulloblastoma ependymoma, और बाल चिकित्सा gliomas जैसे अन्य मस्तिष्क ट्यूमर के लिए लागू है.

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Protocol

1. ब्रेन ट्यूमर के ऊतक के संस्कृति

  1. कृत्रिम सीएसएफ के 15 मिलीलीटर (aCSF देखना तालिका 1) और 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जगह के लिए 200 μl thawed Liberase (Roche एप्लाइड साइंस) जोड़ें. Proteolytic प्राथमिक ऊतकों के नमूनों, सुसंस्कृत tumorspheres के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अलग कर देना करने के लिए प्रयोग किया जाता एंजाइमों की Liberase टीएम एक मिश्रण है. ट्रिप्सिन-EDTA विपरीत, Liberase विधि सतह प्रतिजन CD133 को बरकरार रखता है. 0.5 के बारे में 3 सेमी की एक ऊतक का नमूना के लिए, हम Liberase के 200 μl का उपयोग करें. यदि ऊतक छोटी है, हम 100 उल का उपयोग करें.
  2. अमोनियम क्लोराइड समाधान (स्टेम सेल प्रौद्योगिकी) कमरे के तापमान को लाओ. अमोनियम क्लोराइड समाधान धीरे अन्य कोशिकाओं पर न्यूनतम प्रभाव के साथ लाल रक्त कोशिकाओं lyses. यह एक लगानेवाला शामिल नहीं है.
  3. बाँझ जैविक सुरक्षा कैबिनेट में, नमूना कंटेनर ज़ुल्फ़, aCSF की 5 मिलीग्राम जोड़ने के लिए ऊतक कुल्ला, फिर बंद विंदुक. इस कदम के लिए लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) को दूर करने में मदद करता है.
  4. एक बाँझ 100 मिमी पेट्री di मस्तिष्क ट्यूमर ऊतक स्थानांतरणश.
  5. ठीक कैंची या नलियां और संदंश का प्रयोग, गारा स्थिरता के लिए ऊतक विसमूहन.
  6. नमूना लीजिए ट्यूब Liberase के साथ पूर्व गर्म aCSF युक्त में एक नियमित रूप से 10 मिलीलीटर विंदुक या संदंश और हस्तांतरण टुकड़े का उपयोग.
  7. इनक्यूबेटर हिलनेवाला (30 rpm) पर रखें और 37 करने के लिए सेट डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट के लिए.
  8. एक 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में 70 सुक्ष्ममापी सेल झरनी के माध्यम से ऊतक lysate फ़िल्टर.
  9. छानना 5 मिनट के लिए 280 XG में नीचे स्पिन.
  10. तैरनेवाला सावधानी से निकालें और परिणामस्वरूप सेल गोली का आकार और रंग का मूल्यांकन: गुलाबी या लाल गुटिकाओं जो लाल रक्त कोशिकाओं की बढ़ती संख्या से संकेत मिलता है.
  11. 1 मिलीलीटर पीबीएस में Resuspend गोली.
  12. अमोनियम क्लोराइड (4-12 मिलीग्राम) गोली आकार और लाल सेल संदूषण पर आधारित समाधान का एक उचित मात्रा जोड़ें (अमोनियम क्लोराइड समाधान बहुत कोमल और मात्रा में वृद्धि हुई लाल कोशिकाओं की तुलना में अन्य कोशिकाओं के लिए हानिकारक नहीं हैं).
  13. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  14. स्पिन कोशिकाओंनीचे 5 मिनट के लिए 280 XG पर.
  15. बाँझ पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ एक बार धो लें.
  16. 5 मिलीलीटर एनएससी पूरा मध्यम (2 तालिका) और एक अल्ट्रा कम बंधन 60 मिमी टिशू कल्चर प्लेट (Corning) हस्तांतरण में Resuspend. हम covalently बंधुआ hydrogel सतहों है कि हाइड्रोफिलिक और neutrally आरोप लगाया है, सेल भेदभाव लगाव की मध्यस्थता को कम करने के लिए कर रहे हैं के साथ अल्ट्रा कम बाध्यकारी संस्कृति प्लेटों का उपयोग करें.

संस्कृति में शुरुआती दिनों के लिए, मीडिया को नहीं बदल सकता हूँ: टॉप - अप के 1-2 मिलीलीटर मीडिया के रूप में की जरूरत के साथ ही है, तो संस्कृति और परिवर्तन मीडिया का निरीक्षण करने के लिए जारी जब मीडिया का रंग थोड़ा पीला हो जाता है.

2. फ्लो के लिए Tumorsphere पृथक्करण

  1. माइक्रोस्कोप के तहत tumorspheres मूल्यांकन: अगर क्षेत्र आकार> 100 सुक्ष्ममापी है, हदबंदी बड़े क्षेत्रों के रूप में केंद्र में परिगलित हो सकता है की सिफारिश की है.
  2. 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब संस्कृति स्थानांतरण.
  3. 2-3 मिलीलीटर बाँझ पी जोड़ेंबी एस थाली कुल्ला करने के लिए अच्छी तरह से और शंक्वाकार ट्यूब जोड़ें.
  4. 5 मिनट के लिए 280 XG अपकेंद्रित्र.
  5. 1 में सतह पर तैरनेवाला और resuspend निकालें - 2 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस.
  6. 10 μl Liberase जोड़ें.
  7. 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेते हैं. निकालें और नेत्रहीन का मूल्यांकन निलंबन, अगर कई clumps देखा, धीरे महीन चुर्ण बनाना 1,000 μl विंदुक टिप का उपयोग.
  8. यदि clumping बनी रहती है, तो लिए एक अतिरिक्त 1-2 मिनट के लिए ऊष्मायन जारी.
  9. 5 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस जोड़ने और 5 मिनट के लिए 280 XG पर centrifuging द्वारा कोशिकाओं को धो लें.
  10. 500-1,000 μl बाँझ पीबीएस 2 मिमी EDTA में सतह पर तैरनेवाला और resuspend निकालें.
  11. सेल नंबर और trypan नीले का उपयोग व्यवहार्यता का आकलन करें.
  12. 1 लाख से पीबीएस +2 मिमी EDTA में मिलीग्राम / सेल गिनती समायोजित करें.

3. भूतल धुंधला

  1. 12x75 मिमी प्रवाह ट्यूबों 1x10 6 मिलीग्राम / परीक्षण प्रति सेल निलंबन के 100 μl स्थानांतरण.
  2. एंटीबॉडी का उचित मात्रा में जोड़ें. मेल खाने निर्धारण नियंत्रण प्रत्येक के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिएप्रतिरक्षी (3 तालिका देखें).
  3. बर्फ पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
  4. प्रत्येक प्रवाह ट्यूब के लिए 2 मिलीलीटर पीबीएस 2 मिमी EDTA जोड़ें.
  5. 4 मिनट छानना, और दाग के लिए 200 XG अपकेंद्रित्र.
  6. 300 μl पीबीएस 2 मिमी EDTA में Resuspend गोली.
  7. प्रत्येक ट्यूब 10 μl 7AAD व्यवहार्यता डाई जोडें और बर्फ पर कम से कम 15 मिनट के लिए सेते हैं.
  8. प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण.

4. फ्लो अधिग्रहण और विश्लेषण

अधिग्रहण और प्रवाह डेटा के विश्लेषण के विशेष साधन पर निर्भर कर रहे हैं. प्रतिनिधि नकारात्मक नमूनों को चला रहे हैं और साधन सेटिंग्स फॉरवर्ड (आकार) और (granularity) साइड तितर बितर के लिए स्थापित. इस तितर बितर पैटर्न अंत उपयोगकर्ता के नमूने में सभी कोशिकाओं को देखने के लिए मलबे सहित, की अनुमति देता है. क्षेत्र आमतौर पर ब्याज की कोशिकाओं के चारों ओर खींचा है. सेटिंग्स (4a चित्रा) तो सभी प्रतिदीप्ति डिटेक्टरों वायुसेना के पहले दशक के भीतर नकारात्मक कोशिकाओं की स्थिति की आवश्यकता के लिए स्थापित कर रहे हैंluorescence तीव्रता साजिश. जब एक से अधिक डाई या fluorochrome प्रयोग किया जाता है, एकल दाग को नियंत्रित करने के लिए रंग मुआवजा मूल्यों (प्रतिदीप्ति उत्सर्जन हस्तक्षेप के घटाव) स्थापित करने के लिए चलाया जाना चाहिए. प्रयोग किया जाता है और एक दूसरे क्षेत्र मृत कोशिकाओं (4b चित्रा) को बाहर करने के लिए तैयार - जब जीवित कोशिकाओं, (655 488/emission उत्तेजना 7-एमिनो actinomycin डी) 7 AAD के रूप में इस तरह के एक व्यवहार्यता डाई चल रहा है. इन दोनों क्षेत्रों के नमूने के किसी भी आगे के विश्लेषण के लिए लागू कर रहे हैं.

5. आत्म नवीकरण परख

कुंजी परख कि बहुत clonal क्षेत्र विकास द्वारा सुविधा है आत्म नवीकरण क्षमता, सीमित कमजोर पड़ने परख के परीक्षण में इन विट्रो है. Tumorspheres dissociated और dilutions में अच्छी तरह से प्रति एक एकल कोशिका से नीचे वितरित कर रहे हैं, और संस्कृति में 7 दिन में बाद में क्षेत्र के गठन की दर की गणना है. 7 दिन, प्रत्येक सेल चढ़ाना घनत्व के लिए क्षेत्रों (0 F) युक्त नहीं कुओं का प्रतिशत की गणना है और प्लॉट किए जाते हैंअच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं की संख्या (x) के खिलाफ. हर अच्छी तरह से कम से कम एक tumorsphere बनाने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या जो बिंदु पर लाइन स्तर 0.37 (एफ 0 = e-x) पार से निर्धारित होता है. कोशिकाओं के एक पॉसों वितरण में, F = 0 अच्छी तरह से प्रति एक सेल के कमजोर पड़ने के लिए 0.37 से मेल खाती है, इसलिए कि इस गणना (37% एक दूसरे को काटना) पूरे सेल आबादी (5 चित्रा) में किसी क्लोन से उत्पन्न होने वाला अथवा उससे बना हुआ स्टेम कोशिकाओं की आवृत्ति को दर्शाता है.

6. एकल सेल RT-पीसीआर

विभिन्न आबादी से एकल कोशिकाओं Beckman कल्टर MoFlo XDP द्वारा एक AmpliGrid स्लाइड (Beckman कल्टर बिल्ली AG480F #) पर प्रतिक्रिया साइटों पर क्रमबद्ध हैं. एकल कक्ष RT-पीसीआर निर्माता विनिर्देशों के अनुसार AmpliGrid सिंगल एक कदम RT-पीसीआर प्रणाली (Beckman कल्टर बिल्ली OAX04515 #) का उपयोग किया जाता है. संक्षेप में, एक एकल कोशिका एक AmpliGrid स्लाइड के प्रत्येक प्रतिक्रिया साइट में जमा किया जाता है, प्रत्येक में एक एकल कोशिका की उपस्थितिप्रतिक्रिया साइट माइक्रोस्कोपी द्वारा पुष्टि की. रिवर्स प्रतिलेखन (आर टी) तुरंत करने के लिए समझौता किया जा रहा से नमूना को रोकने की छंटाई के बाद किया जाता है. आरटी मास्टर मिश्रण ताजा किट निर्देश (4 तालिका) के अनुसार तैयार किया जाता है. हम प्रतिक्रिया प्रति 25 सुक्ष्ममापी यादृच्छिक प्राइमरों (PROMEGA) 0.03 μl, मास्टर मिश्रण का 1 μl प्रत्येक प्रतिक्रिया साइट के केंद्र के लिए जोड़ा है. यह तुरंत 5 μl सील समाधान (Beckman कल्टर बिल्ली OAX04503 #) के साथ लेपित है. एक AmpliSpeed ​​स्लाइड cycler (Beckman कल्टर, # cat OAX04101) का उपयोग करते हुए, स्लाइड 25 में incubated ° ° 10 मिनट, और 55 के लिए 10 मिनट, 42 के लिए सी सी ° C 45 मिनट के लिए. रिवर्स प्रतिलेखन, DNase / RNase मुक्त पानी की 3 μl के बाद प्रत्येक प्रतिक्रिया साइट के लिए जोड़ा है, और पूरे मिश्रण एक पीसीआर ट्यूब (1 / ट्यूब साइट) स्थानांतरित. 8 μl qPCR मास्टर (5 μl SYBR (क्वांटा) ग्रीन, 1 μl पानी, 10 सुक्ष्ममापी आगे और रिवर्स प्राइमर मिश्रण 1 μl) मिश्रण प्लस 2 और एक पीसीआर थाली में, 10 μl की एक प्रतिक्रिया मात्रा मात्रात्मक पीसीआर के लिए प्रयोग किया जाता हैम्यू, आरटी मिश्रण के एल. वास्तविक समय मात्रा का ठहराव के लिए, नमूने एक BioRad cycler पर चलाए जा रहे हैं निम्नलिखित प्रोग्राम का उपयोग: 60 सेकंड, 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 60 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के लिए 10 मिनट, 30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 45 चक्र, 60 डिग्री सेल्सियस पीछा किया, 72 मिनट में 10 डिग्री सेल्सियस और पिघलने वक्र विश्लेषण. सीटी मूल्यों OPTICON मॉनिटर 3 (BioRad) का उपयोग निर्धारित किया गया है. तीन जीन सेल प्रति मूल्यांकन किया जा सकता है, एक गृह व्यवस्था जीन के रूप में GAPDH सहित,. जीन अभिव्यक्ति GAPDH अभिव्यक्ति के में normalized है 2-ΔCt अनुसार,. एक ही तरह से एक ही जनसंख्या का कम से कम एक दर्जन एकल कक्षों के रूप में जैविक तकनीकी replicates की कमी के लिए क्षतिपूर्ति replicates इस्तेमाल किया जा सकता है.

7. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1 जीबीएम साथ एक प्रतिनिधि रोगी के एक चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग स्कैन (एमआरआई) से पता चलता है. ब्रेन ट्यूमर के नमूने तुरंत सर्जरी के बाद सहमति रोगियों से प्राप्त कर रहे हैं, हैमिल्टन स्वास्थ्य विज्ञान / McMaster स्वास्थ्य एस के रूप में मंजूरी दे दीciences अनुसंधान नैतिकता बोर्ड. प्रत्येक नमूना का एक हिस्सा नियमित नैदानिक ​​निदान के लिए neuropathologist करने के लिए दिया जाता है. शेष नमूना के रूप में चित्रा 2 में दिखाया कार्रवाई की है. ट्यूमर कोशिकाओं, एक बार वृद्धि कारकों, प्रपत्र tumorspheres के साथ पूरा तंत्रिका स्टेम सेल मीडिया में चढ़ाया के रूप में 3 चित्र में दिखाया गया है.

ट्यूमर कोशिकाओं तंत्रिका स्टेम सेल सतह CD133 और CD15 मार्कर के साथ चिह्नित कर रहे हैं और प्रवाह cytometry से विश्लेषण के रूप में 4 चित्र में दिखाया गया है.

उदाहरण के लिए, CD15 + / CD133 के लिए विभिन्न आबादी से एकल कोशिकाओं CD15 + + / - CD133, CD15-/CD133 +, CD15-/CD133- रहे हैं तो 96 अच्छी तरह प्लेट (चित्रा 5a) में या AmpliGrid स्लाइड्स (6a चित्रा) में क्रमबद्ध हैं.

96 अच्छी तरह से थाली में, एकल कक्षों जो आत्म नवीकरण क्षमता (उदाहरण के CD133 कोशिकाओं +), (चित्रा 5 ब) के अधिकारी, tumorspheres के बाद incu (चित्रा 5c) फार्म कर सकते हैंbation. एक ग्राफ अच्छी तरह से प्रति गठित क्षेत्रों की संख्या की गणना के द्वारा आत्म नवीकरण (5d चित्रा) प्लॉट किए जाते हैं कर सकते हैं. एकल कक्षों Ampligrid स्लाइड (6a चित्रा) की प्रतिक्रिया साइट में हल. एकल कक्षों से निकाले शाही सेना रिवर्स Advalytix AmpliSpeed ​​(चित्रा 6b) का उपयोग करते हुए लिखित कर सकते हैं. प्राप्त सीडीएनए वास्तविक समय आरटी पीसीआर (6c चित्रा) का प्रदर्शन करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. एक रोगी जीबीएम की चुंबकीय अनुनाद (एमआरआई) छवि सिरदर्द का एक महीने के लंबे इतिहास और सुस्ती, उल्टी और दृश्य धुंधला का एक एक सप्ताह के इतिहास के साथ एक 16 साल पुराने लड़की के मस्तिष्क का एमआरआई स्कैन. Axial स्वभाव अनुक्रम एक बड़ी द्वि - hemispheric जीबीएम ("तितली") से पता चलता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. ब्रेन ट्यूमर प्रसंस्करण ब्रेन ट्यूमर के नमूने हैं obtaतुरंत सर्जरी के बाद रोगियों को सहमति से ined. वे यंत्रवत् dissociated के रूप में दिखाया गया है (एक) कर रहे हैं और फिर enzymatically Liberase साथ aCSF में 15 मिनट (ख) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 30 rpm कमाल की इनक्यूबेटर में incubating द्वारा अलग कर रहे हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3. BTIC आबादी संस्कृति में फार्म tumorspheres dissociated मस्तिष्क ट्यूमर वृद्धि कारकों के साथ पूरी तरह से तंत्रिका स्टेम सेल मीडिया में मढ़वाया कोशिकाओं tumorspheres फार्म.

चित्रा 4
चित्रा 4. फ्लो BTIC आबादी के cytometric विश्लेषण (एक) आगे ओर तितर बितर गुण बनाम (ख) कोशिकाओं जो व्यवहार्यता 7-AAD डाई के साथ दाग विश्लेषण से बाहर रखा जाता है मलबे सहित सभी कक्षों, की एक छवि प्रदान करते हैं. (ग) सांख्यिकीय quadrants की स्थिति उचित निर्धारण नियंत्रण का उपयोग कर (घ) ट्यूमर कोशिकाओं के दाग सतह माँ के साथ निर्धारित किया जाता हैCD15 पीई और CD133 APC rkers. (घ) Moflo XDP सेल सॉर्टर. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 5
चित्रा 5. BTICs के कमजोर पड़ने विश्लेषण सीमित उनके आत्म नवीकरण क्षमता का पता चलता है (एक) अलग dilutions की कोशिकाओं 96 (ख) अच्छी तरह से प्रति एक एकल कोशिका से एनएससी के 200 μl युक्त कुओं में हल कर रहे हैं. (ग) एक 7 दिन ऊष्मायन अवधि के बाद, एक tumorsphere बनाई है. माध्यमिक tumorspheres की आकारिकी प्राथमिक tumorspheres के लिए समान है. (घ) मतलब x-अवरोधन मूल्यों करने के लिए कम से कम एक प्रति tumorsphere में अच्छी तरह से बनाने के लिए आवश्यक है कोशिकाओं की संख्या प्रकट करने के लिए हर ट्यूमर उप के लिए कमजोर पड़ने विश्लेषण को सीमित करने से गणना की जा सकती है.

चित्रा 6
6 चित्रा. जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण एक एकल BTIC सेल केसंभव एकल कक्ष RT-पीसीआर तकनीक का उपयोग कर (क) एक BTIC जनसंख्या से सिंगल कोशिकाओं AmpliGrid स्लाइड पर हल किया जा सकता है. (ख) सीडीएनए संश्लेषण AmpliGrid Advalytix AmpliSpeed ​​का उपयोग स्लाइड पर एकल कक्षों पर किया जाता है. (ग) मात्रात्मक रीयलटाइम पीसीआर एकल BTIC कोशिकाओं से संश्लेषित सीडीएनए पर किया जाता है.

2M NaCl 62 मिलीलीटर
1M KCl 5 मिलीग्राम
1M 2 MgCl 3.2 मिलीलीटर
155 मिमी 3 NaHCO 169 मिलीलीटर
1M ग्लूकोज 10 मिलीलीटर
108 मिमी 2 CACL 0.९,२५६ मिलीलीटर
Purelab अल्ट्रा 2 0 एच 749.84 मिलीलीटर

1 टेबल कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (aCSF) - 1000 मिलीलीटर.

स्टॉक बेसल मीडिया 500 मिलीलीटर
01:01 DMEM: F12 480 मिलीलीटर
N2 पूरक 5 मिलीग्राम
1M HEPES 5 मिलीग्राम
ग्लूकोज 3.0 छ
एन एसिटाइलसिस्टीन (60 ग्राम / एमएल) 1 मिलीग्राम
तंत्रिका अस्तित्व कारक 1 (NSF-1) 10 मिलीलीटर

तालिका 2 तंत्रिका स्टेम सेल मीडिया.

एनएससी पूरा मीडिया (बनाया पहले ताजा उपयोग करने के लिए):
एनएससी बेसल मीडिया + 20 एनजी / एमएल EGF (epidermal वृद्धि कारक) + 20 एनजी / मिलीलीटर bFGF (बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक) + 10 एनजी / एमएल LIF (लेकिमिया निरोधात्मक कारक) * 10 + μl / मिलीलीटर एंटीबायोटिक कवकनाशी

* लेकिमिया निरोधात्मक कारक (lif): Millipore से यह अभिकर्मक एक इंटरल्यूकिन 6 वर्ग cytokine, एक जनसंपर्कotein जो स्टेम कोशिकाओं को स्टेम सेल संस्कृतियों की लंबी अवधि के रखरखाव को बढ़ावा देने का सहज भेदभाव को दबा.

एंटीबॉडी प्रदायक / कैट # / μl परीक्षण (100 μl में)
CD133 / 2 APC (293C3) Biotec/130-090-854 Miltenyi 5
IgG2b APC (निर्धारण नियंत्रण) Miltenyi Biotec/130-092-217 5
CD15PE Beckman Coulter/IM1954U 5
IgG2a पीई (निर्धारण नियंत्रण) Beckman Coulter/A09141 5
7AAD Beckman Coulter/A07704 10

तालिका 3 फ्लो एंटीबॉडी.

घटक वॉल्यूम (1 प्रतिक्रिया) वॉल्यूम (48 प्रतिक्रिया)
एकल कक्ष RT प्रतिक्रिया बफर 2x 0.50 μl 30.0 μl
RNase अवरोध (10 यू μl /) 0.02 μl 1.2 μl
5X एकल कक्ष RT बढ़ाने 0.15 μl 9.00 μl
एकल कक्ष RT एनजाइम मिक्स 0.04 μl 2.4 μl
Advablue (OAX04227) 0.1 μl 6.00 μl
Nuclease मुफ्त पानी 1 μl बनाने 60 μl बनाने

तालिका 4 आरटी एकल कक्ष RTPCR (बिल्ली OAX04515 #) के लिए मास्टर मिश्रण की संरचना.

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Discussion

कैंसर स्टेम सेल 10 परिकल्पना, लेकिमिया 21 में काम के आधार पर, स्तन कैंसर 11 और मस्तिष्क कैंसर 4,5, पता चलता है कि केवल ट्यूमर कोशिकाओं के अपेक्षाकृत छोटे अंश, कैंसर स्टेम कोशिकाओं करार दिया, एक करने के लिए बड़े पैमाने पर पैदा करना और स्वयं की क्षमता होती है नवीनीकरण के. ट्यूमर कोशिकाओं के अधिकांश पैदा करना और आत्म नवीकरण के रूप में वे कोशिकाओं कि ट्यूमर के प्ररूपी हस्ताक्षर बन में अंतर करने की क्षमता खो देते हैं. मस्तिष्क ट्यूमर आबादी है कि ट्यूमर को बनाए रखने में सक्षम हैं में प्रमुख कोशिकाओं ढूँढना मस्तिष्क tumorigenesis के तंत्र में अंतर्दृष्टि दे और हमें वापस मूल के सेल का पता लगाने के लिए अनुमति देगा.

स्टेम सेल कार्यात्मक स्वयं renewing कोशिकाओं है कि बहु - वंश भेदभाव 22-24 प्रदर्शन के रूप में परिभाषित कर रहे हैं. प्राथमिक मस्तिष्क ट्यूमर ऊतक संस्कृति की स्थिति है कि स्टेम सेल के विकास के पक्ष के तहत हो रहा है, पहले tumorspheres के रूप में तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के अलगाव के लिए स्थापित 6,26 के प्रसार लाती है. रोग उप प्रकार के बावजूद, प्राथमिक संस्कृति के 24 से 48 घंटे के भीतर, सबसे मस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं है कि विकास clonally व्युत्पन्न neurosphere तरह समूहों, या tumorspheres में को प्रदर्शित की एक अल्पसंख्यक अंश उपज. इस प्रकार हम BTIC आबादी के लिए रोगी के मस्तिष्क ट्यूमर ऊतकों से समृद्ध करने में सक्षम हैं.

कोशिका की सतह मार्करों के आधार पर कैंसर स्टेम कोशिकाओं की शुद्धि के लिए मल्टी पैरामीटर फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई 27 और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 28 प्रौद्योगिकी के आगमन के लिए अनुमति दी गई है. ऐसे CD133 और CD15 के रूप में स्टेम सेल मार्कर का उपयोग करके, हम करने के लिए भावी विशिष्ट स्टेम सेल की तरह आबादी के लिए हल करने के लिए और सीमित कमजोर पड़ने assays प्रदर्शन करके उनके आत्म नवीकरण क्षमता का अध्ययन करने में सक्षम किया गया है. एक caveaआत्म नवीकरण assays टी दिखा रहा है कि इन विट्रो में आत्म नवीकरण हमेशा माउस 29 मॉडल में ट्यूमर के गठन के साथ नहीं सहसंबंधी करता है हाल ही में एक अध्ययन के द्वारा पेश किया गया था. हालांकि हमारे हाल ही में काम दिखाया गया है कि इन विट्रो assays में आत्म नवीकरण रोगी अस्तित्व के साथ सहसंबंधी है, इन BTIC 30 जीव विज्ञान के चल रहे अध्ययन के लिए मूल्यवान assays प्रतिपादन.

प्राथमिक मानव ऊतकों के साथ कार्य करने के लिए कई तकनीकी चुनौतियों प्रस्तुत करता है. ऊतक प्रसंस्करण बहुत धीरे से किया जाना चाहिए अलग कक्षों की व्यवहार्यता की रक्षा. Liberase की राशि का इस्तेमाल किया और गर्मी के समय महत्वपूर्ण है. कोशिकाओं के प्रवाह छँटाई करने के लिए अलग नलिका और दबाव का उपयोग करके सॉर्ट व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. हम पाते हैं कि हमारी कोशिकाओं को म्यान दबाव के 30 साई में एक 100μm नोजल के माध्यम से हल किया जाना पसंद करते हैं. Ampligrid स्लाइड प्रतिक्रियाशील साइटों पर छंटनी कुछ मुश्किल हो सकता है: यह माइक्रोस्कोपी द्वारा जमा सेल की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है.

31 उपचारों के लिए चल रही खोज में सबसे बड़ी चुनौतियों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है. ब्रेन ट्यूमर आम तौर पर कि तंत्रिका वंश मार्करों के एक किस्म व्यक्त morphologically विविध कोशिकाओं के शामिल हैं. मस्तिष्क ट्यूमर के पारंपरिक ऊतकविकृतिविज्ञानी अध्ययन केवल ट्यूमर के नैदानिक ​​व्यवहार के ज्ञान के एक सीमित राशि झुकेंगे. हालांकि प्रमुख अग्रिमों कुछ मस्तिष्क ट्यूमर 3,32-34, विशेष रूप से medulloblastomas और घातक gliomas, और इन की पहचान परिवर्तन के कुछ अब उपचार गाइड की शुरुआत कर रहे हैं के आणविक आनुवंशिक परिवर्तन की समझ में बनाया गया है, यह स्पष्ट नहीं है कि ट्यूमर सभी कोशिकाओं को उनके ट्यूमर के विकास को बनाए रखने की क्षमता में बराबर हैं. कुंजी मस्तिष्क ट्यूमर आबादी में संकेत दे रास्ते में शामिल जीन का विश्लेषण न्यायपालिका मस्तिष्क ट्यूमर के गठन के लिए अग्रणी तंत्र के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है. यहां तक ​​कि एक प्रतीत होता है homoge मेंnous ऊतकों, कोशिकाओं को उनके संभावित क्षमता में अद्वितीय साबित हो. प्रतिलेख और प्रोटीन एकल कक्षों में अभिव्यक्ति के स्तर के विश्लेषण से पता चलता है कि दोनों आराम राज्य में और जब 35-39 stimuli करने के लिए संपर्क में एक बड़े बदलाव सेल सेल है. इसलिए, कक्षों की पूरी आबादी का विश्लेषण एक एकल कोशिका के व्यवहार प्रकट नहीं होगा. qRT-पीसीआर mRNA 40-41 मात्रा का ठहराव के लिए सोने के मानक माना जाता है. इस अध्ययन में, हम AmpliGrid स्लाइड पर अलग आबादियों से व्यक्ति की कोशिकाओं के भावी छँटाई प्रदर्शित करता है. एकल कक्ष RT-पीसीआर का उपयोग करना है, हम एक विषम जनसंख्या से एक एकल कक्ष पर जीन की अभिव्यक्ति विश्लेषण करते हैं, इस प्रकार एक मिश्रित आबादी के भीतर चयनित सेल की जैविक महत्व का मूल्यांकन करने में सक्षम हैं.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

इस काम के ओंटारियो इंस्टीट्यूट ऑफ कैंसर रिसर्च (OICR), टेरी फॉक्स फाउंडेशन और न्यूरोलॉजिकल सर्जन के अमेरिकन एसोसिएशन द्वारा वित्त पोषित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1:1 DMEM:F12 Invitrogen 11320-082
N2 supplement Invitrogen 17502-048
1M HEPES Wisent Inc. 330-050-EL
Glucose Invitrogen 15023-021
N-acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165-25g
Neural survival factor -1 (NSF-1) Lonza Clonetics CC-4323
Epidermal growth factor (EGF) Sigma-Aldrich E9644
Basic fibroblast growth factor (bFGF) Invitrogen PHG0261
Leukemia inhibitory factor (LIF) EMD Millipore LIF1010
Antibiotic/mycotic Wisent Inc. 450-115-EL
Liberase TM Roche Group 05 401 119 001
Ammonium chloride solution Stem Cell Technologies 07850

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