정렬 줄기 세포 Assays 및 흐름에 대한 기본 뇌 종양 조직의 처리

Medicine

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Summary

뇌 종양 세포 시작 (BTICs), 이기종 종양이 가진 줄기 세포의 속성 내에있는 희귀 한 세포의 식별은 인간의 뇌 종양의 pathogenesis에 새로운 통찰력을 제공합니다. 우리는 BTICs에 풍부하게 특정 문화 조건을 정제 한, 우리는 정기적으로 더 이러한 인구 풍부 유동 세포 계측법을 사용합니다. 단일 셀 RT-PCR에 의한 자기 갱신 assays 및 성적표 분석은 이후 이러한 절연 셀에 수행 할 수 있습니다.

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Venugopal, C., McFarlane, N. M., Nolte, S., Manoranjan, B., Singh, S. K. Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting. J. Vis. Exp. (67), e4111, doi:10.3791/4111 (2012).

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Abstract

뇌 종양은 일반적으로 신경 계통 마커의 다양한 표현 morphologically 다양한 세포로 구성되어 있습니다. 줄기 세포 특성을 가진 종양의 세포 만 상대적으로 작은 부분, 칭했다 뇌 종양 세포 시작 (BTICs)는 여러 lineages 따라 차별화 자기 갱신, 그리고 생체에 종양을 시작할 수있는 능력을 가지고 있습니다. 우리는 원래 인간의 뇌 종양의 다양한 일반 신경 줄기 세포 (NSCs)에 사용이 문화 방법은 특히 줄기처럼 인구에 대한 선택을 발견 문화 조건을 적용했습니다. 혈청 무료 매체 (NSC)는 undifferentiated 줄기 세포 상태의 유지를위한 수 있으며, bFGF와 EGF의 추가는 멀티 강력한, 자기 갱신의 확산, 그리고 확장 tumorspheres 할 수 있습니다.

추가로 각 종양의 BTIC 인구 특성화하기 위해, 우리는 유동 세포 계측법에 의해 세포 표면 마커를 평가합니다. 우리는 또한보다 구체적인 characteriz에 대한 관심 인구를 정​​렬 할 수도 있습니다ation. 자기 갱신 assays는 96도 판으로 정렬 한 BTICs에서 수행되며, 37 부화에 따라 tumorspheres의 형성은 ° C는 막대 또는 전구 세포의 존재를 나타냅니다. 특정 인구의 다수의 전화 번호도 자기 갱신 능력을 분석하기 위해 희석 분석을 제한에 대해 서로 다른 우물으로 정렬 할 수 있습니다. 우리는 또한 단일 셀 RT-PCR을 사용하여 특정 세포 인구에서 차동 유전자 발현을 연구 할 수 있습니다.

다음 프로토콜 BTIC 인구뿐만 아니라 tumorspheres의 분리에 대해 풍부하게하기 위해 기본 인간의 샘플 분리 및 배양을위한 우리의 절차를 설명합니다. 또한 유동 세포 계측법 분석이나 정렬, 자기 갱신 assays, 단일 셀 RT-PCR에 얼룩을위한 프로토콜입니다 포함되어 있습니다.

Introduction

뇌 종양은 인간에 알려진 것 중 가장 공격적이고 이기종 암 등이 있습니다. 자신의 이전 감지 및 진단 현대적인 신경 영상 기술에 의해 촉진 된 있지만, 우리는 여전히 특히 확산, 침해들 또는 뇌 깊숙히 자리 분들을 위해, 많은 뇌 종양에 대한 치료 요법을 부족합니다.

뇌 종양은 매우 공격적이고 종종 불치의 특성으로 인해 아동 암 사망률의 주요 원인을 나타냅니다. Glioblastoma (GBM), 성인에서 가장 흔한 주요 뇌 종양은 그 균일하게 치명적인 예후 (豫后) 1 두려웠 가장 공격적인 인간 암의 하나입니다. 이 높은 악성 astrocytic 종양 (WHO가 4 학년) 일반적으로 성인의 대뇌 반구에서 발생하며 어린이와 유아에 발생할 수 있습니다. 의 성장은 신속하고 infiltrative이며, 진단 병리학 기능은 핵 pleomorphism, microvascular 확산 및 괴사 2,3가 포함되어 있습니다. adul에 대한TS 새로 진단 GBM과 함께 평균 생존은 거의 모든 치료 modalities에 일반적으로 가난한 응답과 함께, 12 개월 1 이상으로 확장하지 않습니다. 우리는 체세포의 줄기 세포와 암 세포에 의해 공유 많은 기능과 유전자 유사성이 있다는 것을 지적하고, 정상적인 뇌 발달을 조절 분자 경로는 종종 암으로 dysregulated됩니다. 뇌 종양의 연구에 줄기 세포 생물학의 패러다임을 적용에서, 우리는 prospectively 식별과 확산, 자기 갱신의 줄기 세포 특성을 전시 인간 GBMs 세포 subpopulation을 정화하는 최초의 연구했고, 체외 4과의 차별화 생체 5. 우리는 원래 여러 소아 및 성인 뇌 종양에 체외 6,7에서 정상적인 신경 줄기 세포 (NSCs)를 특징하는 데 사용 문화 조건과 assays을 적용하고, CD133 8 신경 전구 세포 표면 마커에 대한 정렬 셀하여이 줄기 같은 세포에 풍부 ,9. CD133 + 뇌 종양 비율 NOD-SCID 마우스 머리 5,10에서 CD133-분율보다 종양 개시의 훨씬 더 높은 주파수를 가지고 세포가 포함되어 있습니다. 이 공식적으로 줄기 세포 특성을 가진 뇌 종양 세포 만 드문 일부는 종양 - 시작의 이름 "뇌 종양 세포를 시작"을 수입 또는 "BTICs '이라는 설립했다. BTICs의 소설 식별는 많은 고체 종양에 대한 기준으로 암 줄기 세포 가설 10-13에 대한 강력한 지원을 제공 인간의 뇌 tumorigenesis에 새로운 통찰력을 제공하고보다 효과적인 암 치료 14-20를위한 새로운 휴대 목표를 설정합니다. 종양의 대부분을 죽이고에 초점이 종양 성장을 계속 할 수 있도록 희귀 한 줄기와 같은 일부를 놓칠 수 있다는 요법. 암 줄기 세포를 죽이는에 초점이 뇌 종양 환자에게 더 나은 치료 및 예후 (豫 后)를 제공 할 수 있다는 요법.

BTIC 인구를 공부하기 위해, 우리는 우리의 cultu를 수정특히 줄기 세포 특성을 가지고 인간의 뇌 종양 내의 세포 집단을 위해 선택할 수있는 프로토콜을 다시. 세럼 - 무료 신경 줄기 매체가 undifferentiated 줄기 세포 상태의 유지를위한 수 셀 (NSC) 및 기본 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF), 표피 성장 인자 (EGF) 및 백혈병 억제 인자를 추가합니다 (난생)을 할 수 있습니다 멀티 강력한, 자기 갱신과 확장 인간 tumorspheres의 확산. 여기, 우리는 기본 뇌 종양과 BTIC 인구에 풍부하게하기 위해 NSC 매체에서 배양를 처리에 관련된 방법을 설명합니다. 우리 실험 모델 시스템을 이러한 세포 만이 최소한 줄기에서 배양 있다는 사실을 강조하기 위해 "BTIC 환자 격리"라고했습니다 줄기 세포 집단을위한 선택 셀 조건은. 등 CD133과 CD15 및 유동 세포 계측법 분석 등의 주요 줄기 세포 마커에 대한 BTIC 인구 이후에 immunolabelling도 설명되어 있습니다. 우리는 제한 희석 분석을 논의이는 BTICs의 자기 갱신 잠재력을 공부에 에이즈. 마지막으로, 우리는 AmpliGrid 슬라이드에 하나의 세포를 정렬 및 단일 셀 RT-PCR을 수행하여 이러한 희귀 한 세포의 유전자 발현 분석을 탐험 해보세요. 이 기술은 또한 medulloblastoma, ependymoma 및 소아 gliomas 같은 다른 뇌 종양에 적용됩니다.

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Protocol

1. 뇌 종양 조직의 문화

  1. 37 ° C의 물을 욕조에 15 인조 CSF의 ML (aCSF - 참조 표 1)과 장소에 200 μl 해동 Liberase (로슈 응용 과학)을 추가합니다. Liberase TM는 기본 조직 샘플뿐만 아니라 교양 tumorspheres을 떼어 놓다하는 데 사용 proteolytic 효소의 혼합입니다. 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과는 달리, Liberase 방법은 표면 항원 CD133을 보존합니다. 약 0.5 cm 3의 조직 샘플의 경우, 우리는 Liberase 200 μl를 사용합니다. 조직이 작 으면, 우리는 100 UL을 사용합니다.
  2. 객실 온도 염화 암모늄 용액 (줄기 세포 기술)를 가져와. 염화 암모늄 솔루션은 부드럽게 다른 세포에 최소한의 영향으로 적혈구를 lyses. 이 정착액 포함되어 있지 않습니다.
  3. 무균 생물 안전 캐비닛에서 해제 피펫 후, 조직을 씻어하기 위해 표본 용기, 소용돌이에 aCSF의 5 ML을 추가합니다. 이 단계는 적혈구 (RBC)를 제거하는 데 도움이됩니다.
  4. 멸균 100mm 페트리 디에 뇌 종양 조직을 전송쉬.
  5. 고급 가위 또는 메스와 집게를 사용 슬러리의 일관성에 조직을 disaggregate.
  6. Liberase으로 사전 예열 aCSF을 포함하는 튜브에 10 ML 일반 피펫 또는 포셉 및 전송 조각을 사용하여 샘​​플을 수집합니다.
  7. 보육-흔드는 (30 RPM)에 장소 37로 설정 ° C, 15 분에.
  8. 50 ML 팔콘 튜브에 70 μm 전지 스트레이너를 통해 조직 lysate를 필터링합니다.
  9. 5 분에 280 XG에서 여과를 봐.
  10. 조심스럽게 표면에 뜨는을 제거하고 그 결과 세포 펠렛의 크기와 색상을 평가 : 분홍색 또는 빨간색 펠릿가 빨간색으로 혈액 세포의 증가 숫자를 나타냅니다.
  11. 1 ML PBS에 Resuspend 펠릿.
  12. 펠렛 크기와 적혈구 오염에 따라 염화 암모늄 용액 (4-12 ML)의 적절한 금액을 추가 (염화 암모늄 솔루션은 매우 부드러운이며 증가 금액은 붉은 색 세포가 아닌 다른 세포에 해로운되지 않습니다.)
  13. 5 분 동안 실온에서 알을 품다.
  14. 스핀 세포5 분에 280 XG에서 내려.
  15. 멸균 PBS의 10 ML에 한 번 씻으십시오.
  16. 5 ML NSC 전체 매체 (표 2)와 매우 낮은 바인딩 60mm 조직 문화 판 (코닝)에 양도 Resuspend. 우리는 친수성과 중립적 세포 첨부 파일로 인한 차별화를 최소화하기 위해 부과됩니다 covalently 보세 히드로 겔 표면과 초저 구속력 문화 접시를 사용합니다.

문화의 초기 일 동안 미디어를 변경하지 마십시오 : 미디어의 색깔이 약간 노란색되면 최고 오직 필요에 따라 1-2 ML의 미디어 다음 문화와 변화 미디어를 관찰하고 있습니다.

2. 유동 세포 계측법에 대한 Tumorsphere 분리

  1. 현미경으로 tumorspheres을 평가 : 영역의 크기가> 100 μm 인 경우 큰 분야는 중앙에 괴사 될 수 있으므로, 분리하는 것이 좋습니다.
  2. 15 ML 원뿔 튜브에 문화를 전송할 수 있습니다.
  3. 2-3 ML 멸균 P를 추가합니다BS는 철저하게 판을 씻어 원뿔 튜브에 추가 할 수 있습니다.
  4. 5 분에 280 XG에 원심 분리기.
  5. 1 표면에 뜨는 및 resuspend 제거 - 2 ML 멸균 PBS.
  6. 10 μl Liberase을 추가합니다.
  7. 3 분에 37 ° C의 물을 욕조에 품다. 여러 clumps가 본 경우 정지를 제거하고 시각적으로 평가, 1000 μl 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 가루로 빻다.
  8. 거리며 걷게가 지속되면 추가 1-2 분 동안 배양을 계속합니다.
  9. 5 ML 멸균 PBS를 추가하고 5 분에 280 XG에 centrifuging하여 세포를 씻으십시오.
  10. 500-1,000 μl 멸균 PBS 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에 표면에 뜨는 및 resuspend 제거합니다.
  11. 휴대폰 번호와 trypan 파랑을 사용하여 생존을 평가합니다.
  12. PBS 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에서 1,000,000 / ML로 세포 수를 조정합니다.

3. 표면 착색

  1. 12x75 mm 유동 튜브로 테스트 당 1x10 6 / ML 세포 현탁액 100 μl를 전송합니다.
  2. 항체의 적절한 금액을 추가합니다. 일치하는 Isotype 컨트롤은 각각에 대해 사용되어야합니다항체 (표 3 참조).
  3. 얼음에 30 분에 품다.
  4. 각 유동 튜브에 2 ML PBS 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가합니다.
  5. 4 분, 가만히 따르다과 얼룩에 대해 200 XG에 원심 분리기.
  6. 300 μl PBS 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에 Resuspend 펠릿.
  7. 각 튜브에 10 μl 7AAD 생존의 염료를 추가하고 얼음에 적어도 15 분에 품다.
  8. 유동 세포 계측법에 의해 분석 할 수 있습니다.

4. 유동 세포 계측법의 수집 및 분석

흐름 데이터의 수집 및 분석의 세부 사항은 악기에 따라 달라집니다. 대표 부정적인 샘플은 실행하고 악기 설정은 앞으로 (크기) 및 측면 (단위) 분산을 위해 설립되어 있습니다. 이 분산 패턴은 최종 사용자가 쓰레기를 포함하여 샘플에있는 모든 셀을 볼 수 있습니다. 지역은 일반적으로 관심의 셀 주위에 그려집니다. (그림 4A) 설정은 다음 AF의 첫 10 년 내에 부정적인 셀을 배치하는 데 필요한 모든 형광 검출기에 설치되어luorescence 강도 줄거리. 하나 이상의 염색을하거나 fluorochrome를 사용하는 경우, 하나의 스테인드 컨트롤 색상 보상 값을 (형광 방출을 방해 빼기) 수립 실행해야합니다. 사용되며, 죽은 세포 (그림 4B) 제외 그려 두 번째 지역 - 라이브 세포 등 7 AAD (여기 488/emission 655 7 - 아미노 actinomycin D)과 같은 생존의 염료를 실행합니다. 이 지역은 모두 샘플 추가 분석에 적용됩니다.

5. 자기 갱신 분석

크게 clonal 영역의 성장에 의해 촉진되는 키 검정은 자기 갱신 용량 제한 희석 분석의의 체외 시험입니다. Tumorspheres는 dissociated 잘 당 하나의 셀에 dilutions에 다운 배포 있으며, 문화에 7 일 이후의 영역 형성의 비율이 계산됩니다. 일 7 각 셀 도금 밀도에 대한 분야를 (F 0) 포함하지 않는 우물의 비율이 계산하고 도시된다잘 당 세포 (x)의 수에 대한. 모든 잘에 최소 하나의 tumorsphere을 형성하는 데 필요한 셀의 수는 줄은 0.37 수준 (F 0 = 전자 x)를 교차하는 시점에서 결정됩니다. 세포의 푸 아송 분포,이 계산은 (37 %는 교차) 전체 세포 인구 (그림 5)에서 clonogenic 줄기 세포의 빈도를 반영하도록 잘 당 하나의 셀의 희석에 F 0 = 0.37에 해당.

6. 단일 셀 RT-PCR

다른 인구의 싱글 셀은 AmpliGrid 슬라이드 (Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 고양이 # AG480F)에 반응 사이트에서 Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 MoFlo XDP에 의해 정렬됩니다. 단일 셀 RT-PCR은 제조업체의 사양에 따라 AmpliGrid 단일 한 단계 RT-PCR 시스템 (Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 고양이 # OAX04515)를 사용하여 수행됩니다. 간단히, 단일 세포는 AmpliGrid 슬라이드의 각 반응 사이트에 증착되는, 각각에 하나의 세포의 존재를반응 사이트는 현미경으로 확인했다. 역 전사 (RT)이 손상되지 않도록 샘플을 방지하기 위해 정렬 후 즉시 수행됩니다. RT 마스터 믹스는 키트 지침 (표 4)에 의하면, 신선한 준비가되어 있습니다. 우리는 반응 당 25 μM 무작위 프리 머 (Promega)의 0.03 μl를 사용, 마스터 믹스 1 μl은 각 반응 사이트의 중심에 추가됩니다. 이것은 즉시 밀봉 솔루션 (Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 고양이 # OAX04503)의 5 μl으로 코팅되어 있습니다. AmpliSpeed​​ 슬라이드 자전거 타는 사람 (Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날, 고양이 # OAX04101)를 사용, 슬라이드는 25 incubated 아르 ° 10 분, 42에 C ° C 10 분, 55 ° C에 45 분을위한. 역 스크립트, DNase / RNase 무료 생수 3 μl은 각 반응 사이트에 추가하고, 전체 혼합물은 PCR 튜브 (1 관 / 사이트)로 이동 한 후. 8 μl qPCR 마스터 믹스 (5 μl Sybr 녹색 (콴타), 1 μl 물, 10 앞으로 μM 및 역방향 프라이머 믹스 1 μl)와 2 & : PCR 플레이트에 10 μl의 반응 볼륨이 정량 PCR에 사용됩니다무, RT 혼합물의 리터. 실시간 정량화를 들어, 샘플은 다음과 같은 프로그램을 사용하여 BioRad 자전거 타는 사람에 게재됩니다 : 60 초에 60 초, 72 ° C 30 초 95 ° C 10 분, 95 ° C의 45주기, 60 ° C를 따라 72시 10 분에 의해 ° C 및 용해 곡선 분석. CT 값은 Opticon 모니터 3 (BioRad)를 사용하여 결정됩니다. 세 유전자는 하우스 키핑 유전자로 GAPDH를 포함, 셀 당 평가 할 수 있습니다. 유전자 발현은 2 ΔCt에 의하면, GAPDH 식으로 표준화되어 있습니다. 생물학적 기술은 복제의 부족을 보완하기 위해 복제와 같은 종류의 같은 인구 중 적어도 12 하나의 셀을 사용할 수 있습니다.

7. 대표 결과

그림 1은 GBM으로 대표 환자의 자기 공명 영상 (MRI) 스캔을 보여줍니다. 뇌 종양 샘플은 해밀턴 건강 과학 / McMaster 건강 S에서와 같은 승인 즉시 수술 후 동의 환자에서 얻은ciences 연구 윤리위원회. 각 표본의 일부는 일상적인 임상 진단 neuropathologist로 제공됩니다. 그림 2와 같이 나머지 샘플 처리됩니다. 그림 3과 같이 한 번 성장 요인, 양식 tumorspheres과 함께 완벽한 신경 줄기 세포 미디어에 도금 종양 세포.

종양 세포는 신경 표면 줄기 세포 마커 CD133과 CD15를 표시하고 그림 4와 같이 유동 세포 계측법에 의해 분석됩니다.

예를 들어, CD15 + / CD133에 대해 서로 다른 인구에서 단일 세포 +, CD15 + / CD133-, CD15-/CD133 +, CD15-/CD133- 후 96 잘 플레이트 (그림 5A)로 또는 AmpliGrid 슬라이드 (그림 6A)로 정렬됩니다.

96 잘 판에 자기 갱신 용량 (예 : CD133 + 세포), (그림 5B)를 가지고 하나의 세포는 incu 다음 (그림 5C) tumorspheres를 형성 할 수bation. 자기 갱신 그래프가 잘 형성 당 분야의 수를 계산하여 (5 일 그림) 역모를 할 수 있습니다. 싱글 셀 Ampligrid 슬라이드 (그림 6A)의 반응 사이트에 정렬. 하나의 세포에서 추출한 RNA는 역 Advalytix AmpliSpeed ​​(그림 6B)를 사용하여 베꼈 할 수 있습니다. 얻은 cDNA는 실시간 RT-PCR (그림 6C)를 수행하는 데 사용됩니다.

그림 1
1 그림. 환자 GBM의 자기 공명 영상 (MRI). 두통의 달 오랜 역사와 구토, 혼수 및 시각 흐리게의 1 주간의 역사를 가진 16 세 소녀의 뇌의 MRI 스캔. 축 방향 감각 시퀀스은 대형 이중 반구형 ( "나비") GBM을 보여줍니다.

그림 2
그림 2. 뇌 종양 처리. 뇌 종양 샘플 obta 아르즉시 수술 후 환자 동의에서 ined. 그들은 (A)와 같이 기계적으로 dissociated이며 15 분 (B)를 37 ° C에서 30 RPM 흔들 보육에 잠복기로 Liberase과 aCSF에서 다음 효소 dissociated 있습니다.

그림 3
그림 3. BTIC 인구는 문화에 tumorspheres를 형성하고 있습니다. 성장 요소와 함께 완벽한 신경 줄기 세포 미디어에 도금 Dissociated 뇌 종양 세포가 tumorspheres를 형성하고 있습니다.

그림 4
4 그림. BTIC 인구의 흐름 cytometric 분석. () 전달 측면 분산 특성 비교 (b)는 생존의 염료 7 AAD으로 얼룩 세포는 분석에서 제외됩니다 부스러기를 포함한 모든 세포의 이미지를 제공합니다. (C) 통계 당장 자리의 위치는 (d)에 종양 세포 표면 mA 물들 적절한 Isotype 컨트롤을 사용하여 결정됩니다rkers CD15-PE와 CD133-APC. (D) Moflo XDP 셀 정렬이 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 5
그림 5. BTICs의 희석 분석을 제한하면 스스로 갱신 능력을 보여준다. (A) 다양한 dilutions의 세포가 잘 당 (b)는 하나의 셀에 NSC 200 μl를 포함하는 96 우물로 정렬됩니다. (C) 7 일 잠복기 후, tumorsphere가 형성된다. 보조 tumorspheres의 형태가 기본 tumorspheres의 동일합니다. (D) 평균 X-절편 값은 당, 적어도 한 tumorsphere을 형성하는 데 필요한 세포의 수를 표시하는 방법으로 각 종양 하위 유형에 대한 희석 분석을 제한으로부터 계산 될 수있다.

그림 6
6 그림. 하나의 BTIC 세포의 유전자 발현 분석가능한 단일 셀 RT-PCR 기술을 사용하고 있습니다. (A) BTIC 인구의 싱글 셀이 AmpliGrid 슬라이드에 정렬 할 수 있습니다. (B) cDNA 합성은 Advalytix AmpliSpeed​​를 사용하여 AmpliGrid 슬라이드에 하나의 셀에 수행됩니다. (C) 수량 실시간 PCR은 단일 BTIC 세포에서 합성 cDNA에 수행됩니다.

2M NaCl 62 ML
1M KCl 5 ML
100 MgCl 2 3.2 ML
155 MM NaHCO 3 169 ML
1M 포도당 10 ML
108 MM CaCl 2 0.9256 ML
Purelab 울트라 H 2 0 749.84 ML

표 1 인공 뇌척수 (aCSF) -. 1,000 ML.

주식 자연적으로 흐르는 것과 미디어 500 ML
1시 1분 DMEM : F12 480 ML
N2 보충 5 ML
100 HEPES 5 ML
포도당 3.0 g
N-acetylcysteine​​ (60 μg / ML) 한 ML
신경 생존 인자 - 1 (NSF-1) 10 ML

표 2. 신경 줄기 세포 미디어.

NSC 전체 미디어 (사용하기 전에 새로운 한) :
NSC 기저 미디어 + 20 NG / ML EGF (표피 성장 인자) + 20 NG / ML bFGF (기본 섬유 아세포 성장 인자) + 10 NG / ML 난생 (백혈병 억제 인자) * + 10 ML / μl 항생제 - antimycotic

* 백혈병 억제 인자 (난생) : Millipore의이 시약은 인터루킨 6 급 시토 킨, 홍보를 포함줄기 세포 문화의 장기간 유지를 촉진 줄기 세포의 자연 차별화를 억제 otein.

항체 공급 업체 / CAT # μl / 테스트 (100 μl)를
CD133 / 2 APC (293C3) Miltenyi Biotec/130-090-854 5
IgG2b APC (Isotype 제어) Miltenyi Biotec/130-092-217 5
CD15PE Beckman Coulter/IM1954U 5
IgG2a PE (Isotype 제어) Beckman Coulter/A09141 5
7AAD Beckman Coulter/A07704 10

표 3. 흐름 항체.

구성 요소 볼륨 (1 반응) 볼륨 (48 반응)
단일 셀 RT 반응 버퍼를 2 배 0.50 μl 30.0 μl
RNase 억제제 (10 U / μl) 0.02 μl 1.2 μl
5 배 싱글 셀 RT 증강 0.15 μl 9.00 μl
싱글 셀 RT 효소 믹스 0.04 μl 2.4 μl
Advablue (OAX04227) μl 0.1 6.00 μl
Nuclease 무료 물 1 μl까지 확인 60 μl까지 확인

표 4. 단일 셀 RTPCR (고양이 # OAX04515)에 대한 RT 마스터 믹스의 구성.

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Discussion

백혈병 21 일을 기준으로 암 줄기 세포 가설 (10), 유방암은 암 11, 뇌 암 4,5는 종양의 세포 만 상대적으로 작은 부분, 칭했다 암 줄기 세포가 광범위하게 세포 분열 따위에 의해 번식과 자기 할 수있는 능력을 가지고하는 것이 좋습니다 갱신. 종양 세포의 대부분은 세포 분열 따위에 의해 번식하고 종양의 phenotypic 서명 될 세포로 분화으로 자기 갱신 할 수있는 능력을 잃게됩니다. 종양을 유지 할 수있는 뇌 종양의 인구 키 셀을 찾는 것은 뇌 tumorigenesis의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하고 우리는 기원의 세포로 다시 추적 할 수 있습니다.

줄기 세포는 기능적으로 멀티 혈통 차별화 22-24을 전시 자체 갱신 세포로 정의됩니다. 기본 뇌 종양 조직은 이전에 tumorspheres으로 신경 줄기 세포의 분리에 설립, 줄기 세포의 성장을 선호 문화 조건에서 재배되어 있습니다 6,26을 자기 갱신과 확장 줄기 세포의 증식을 유도한다. 에 관계없이 병리학 하위 유형의, 기본 문화의 24 ~ 48 시간, 대부분의 뇌 종양 clonally 파생 neurosphere 같은 클러스터, 또는 tumorspheres로 성장을 보여 세포의 소수 분수를 얻을 수 있습니다. 따라서 우리는 환자의 뇌 종양의 조직에서 BTIC 인구에 풍부하게 할 수 있습니다.

27 단클론 항체 기술 28 정렬 다중 매개 변수 형광 활성화 세포의 출현 세포 표면 마커에 따라 암 줄기 세포의 정화를 사용할 수 있습니다. 이러한 CD133과 CD15와 같은 줄기 세포 마커를 사용하여, 우리는 prospectively 특정 줄기 세포와 같은 인구에 대한 정렬 및 제한 희석 assays를 수행하여 자기 갱신 능력을 연구 할 수있었습니다. cavea자기 갱신 assays의 t는 체외에서 자기 갱신은 항상 마우스 모델 29 종양 형성과 관련되지 않는 보여주는 최근 연구에 의해 도입되었다. 그러나 최근 작업은 체외 자기 갱신 assays에 BTIC 생물학 (30)의 지속적인 연구 가치가 이러한 assays를 렌더링, 환자 생존과 상관 관계 않는 것으로 나타났습니다.

주요 인체 조직과의 협력 많은 기술적 과제를 제시합니다. 조직 처리가 분리 된 세포의 생존을 유지하기 위해 매우 조심스럽게 수행해야합니다. 부화의 사용 Liberase의 금액과 시간은 중요합니다. 셀의 흐름 정렬이 다른 노즐과 압력을 사용하여 사후 정렬 가능성을 높이기 위해 최적화 할 수 있습니다. 우리는 우리의 세포가 피복 압력의 30 PSI에서 100μm 노즐을 통해 정렬을 선호 것을 알게됩니다. Ampligrid 슬라이드 반응성 사이트에 정렬하는 것은 다소 어려울 수 있습니다 : 그것은 현미경에 의해 증착 된 세포의 존재를 확인하는 것이 중요합니다.

31 지속적인 검색에서 가장 큰 문제 중 하나를 나타냅니다. 뇌 종양은 일반적으로 신경 계통 마커의 다양한 표현 morphologically 다양한 세포로 구성되어 있습니다. 기존의 조직 병리학에 의한 뇌 종양의 연구는 종양의 임상 행동에 대한 지식의 제한된 양을 굴복했다. 주요 진보는 일부 뇌 종양 3,32-34, 특히 medulloblastomas 및 악성 gliomas, 이러한 식별 변경 중 일부는 지금 치료를 안내하기 시작의 분자 유전 변경에 대한 이해에서 만든되었습니다 있지만 확실하지 않습니다 모든 종양 여부 세포가 종양 성장을 유지하기 위해 자신의 능력 같습니다. 뇌 종양의 인구의 신호 경로에 관여 주요 유전자 분석 뇌 종양 형성으로 이어지는 탈선 메커니즘에 대한 우리의 이해를 촉진하는 것이 중요합니다. 비록 겉으로 homoge에마음 조직, 세포는 잠재적 인 능력을 고유 증명. 단일 셀의 성적 증명서 및 단백질 표현 수준의 분석 휴식 상태와 자극 35-39에 노출되면 모두 큰 세포 세포 변화가 있다는 것을 알 수있다. 따라서, 세포의 전체 인구를 분석하면 단일 셀의 동작을 공개하지 않습니다. qRT-PCR은 mRNA의 양을 정함 40-41를위한 황금 표준으로 간주됩니다. 본 연구에서는, 우리는 AmpliGrid 슬라이드에 뚜렷한 인구에서 개별 세포의 미래의 정렬을 보여줍니다. 단일 셀 RT-PCR을 사용하여, 우리는 따라서 혼합 인구 내에서 선택한 셀의 생물학적 중요성을 평가, 이기종 인구에서 하나의 셀을 유전자 발현 분석을 수행 할 수 있습니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgements

이 작품은 암 연구 온타리오 연구소 (OICR), 테리 폭스 재단과 신경 외과의 미국 협회의 지원을받는되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1:1 DMEM:F12 Invitrogen 11320-082
N2 supplement Invitrogen 17502-048
1M HEPES Wisent Inc. 330-050-EL
Glucose Invitrogen 15023-021
N-acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165-25g
Neural survival factor -1 (NSF-1) Lonza Clonetics CC-4323
Epidermal growth factor (EGF) Sigma-Aldrich E9644
Basic fibroblast growth factor (bFGF) Invitrogen PHG0261
Leukemia inhibitory factor (LIF) EMD Millipore LIF1010
Antibiotic/mycotic Wisent Inc. 450-115-EL
Liberase TM Roche Group 05 401 119 001
Ammonium chloride solution Stem Cell Technologies 07850

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