Behandling af primær hjernetumor Tissue for stamcelle Analyser og Flow Sortering

Published 9/25/2012
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Identifikationen af ​​hjernesvulst initierende celler (BTICs), de sjældne celler i en heterogene tumor besidder stamceller egenskaber, giver ny indsigt i den menneskelige hjerne tumor patogenese. Vi har forfinet særlige dyrkningsbetingelser at berige for BTICs, og vi rutinemæssigt bruger flowcytometri til yderligere berige disse befolkningsgrupper. Selvfornyelse assays og transkript analyse ved enkelt celle RT-PCR kan efterfølgende udføres på disse isolerede celler.

Cite this Article

Copy Citation

Venugopal, C., McFarlane, N. M., Nolte, S., Manoranjan, B., Singh, S. K. Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting. J. Vis. Exp. (67), e4111, doi:10.3791/4111 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hjernetumorer omfatter typisk morfologisk forskellige celler, som udtrykker en række neurale afstamning markører. Kun en forholdsvis lille del af cellerne i tumoren med stamceller egenskaber, betegnet hjernesvulst initierende celler (BTICs), besidder en evne til at differentiere langs flere slægter, selv-fornyelse og initiere tumorer in vivo. Vi anvendte dyrkningsbetingelser oprindeligt anvendt til normale, neurale stamceller (NSC) og en række humane hjernetumorer og fandt, at denne dyrkningsmetode specifikt selekterer for stilk-lignende populationer. Serumfrit medium (NSC) giver mulighed for opretholdelse af en udifferentieret stamcelle tilstand og tilsætning af bFGF og EGF muliggør proliferationen af ​​multi-potente, selvfornyende, og ekspanderbare tumorspheres.

For yderligere at karakterisere hver tumor BTIC population, vi evaluere celleoverflademarkører ved flowcytometri. Vi kan også sortere populationer af interesse for mere specifikke characterization. Selvfornyelse analyser udføres på enkelte BTICs sorteret i 96-brønds plader, dannelsen af ​​tumorspheres efter inkubation ved 37 ° C indikerer tilstedeværelsen af ​​en stam-eller progenitorcelle. Multiple celleantal i en bestemt population kan også sorteres i forskellige brønde for begrænsende fortynding analyse for at analysere selvfornyelse kapacitet. Vi kan se differentiel genekspression i en bestemt cellepopulation ved hjælp af enkeltcelle-RT-PCR.

De følgende protokoller beskriver vores procedurer for dissociation og dyrkning af primære humane prøver at berige for BTIC populationer samt dissociationen af ​​tumorspheres. Også indbefattet er protokoller for farvning for flowcytometrianalyse eller sortering, selvfornyelse assays, og enkeltcelle-RT-PCR.

Introduction

Hjernetumorer er blandt de mest aggressive og heterogene cancere kendt hos mennesker. Selv om deres tidligere detektion og diagnose er blevet lettet af moderne neuro-imaging-teknologi, vi stadig mangler helbredende behandlinger for mange hjernetumorer, især for diffuse, invasive dem, der ligger dybt i hjernen.

Hjernetumorer repræsenterer førende årsag til kræft dødelighed hos børn på grund af deres meget aggressive og ofte uhelbredelige karakter. Glioblastoma (GBM), den mest almindelige primær hjernetumor i voksne, er en af de mest aggressive humane cancere, frygtede for sin ensartet fatal prognose 1. Denne yderst ondartet astrocytisk tumor (WHO grad 4) forekommer normalt i de cerebrale hemisfærer af voksne, og kan også forekomme hos små børn og spædbørn. Dens vækst er hurtig og infiltrativ, og diagnostiske patologiske funktioner omfatter nuklear pleomorphism, mikrovaskulær proliferation og nekrose 2,3. For adults med nydiagnosticeret GBM, median overlevelse sjældent strækker sig ud over 12 måneder 1, med generelt dårlige svar på alle terapeutiske modaliteter. Vi bemærkede, at der er mange funktionelle og genetiske ligheder fælles for somatiske stamceller og cancerceller, og at de molekylære veje, der regulerer normal udvikling af hjernen ofte dysreguleret i cancer. Ved anvendelsen stamcellebiologi paradigmer til studiet af hjernesvulster, var vi de første forskere til prospektivt identificere og oprense en subpopulation af celler fra menneskelige GBMS som udviste på stamcelle egenskaber spredning, selvfornyelse og differentiering in vitro 4 og i vivo 5. Vi anvendte dyrkningsbetingelser og assays oprindeligt anvendes til at karakterisere normale, neurale stamceller (NSC) in vitro 6,7 til flere pædiatriske og voksne hjernetumorer, og beriget med disse stilk-lignende celler ved cellesortering til den neurale progenitorcelle overflademarkør CD133 8 ,9. The CD133 + hjernetumor fraktion indeholdt celler, der havde en meget højere frekvens af tumorinitiering end CD133-fraktionen i NOD-SCID musehjerner 5,10. Dette formelt fastslået, at kun en sjælden delmængde af hjernetumorceller med stamceller egenskaber er tumorfremkaldende, tjener dem navnet "brain tumorfremkaldende celler" eller "BTICs". Den hidtil ukendte identifikation af BTICs giver nye indsigter i den menneskelige hjerne tumorigenese, der giver en kraftig støtte til kræft stamceller hypotese 10-13 som grundlag for mange solide tumorer, og etablerer en ny cellulære mål for mere effektive behandlinger mod kræft 14-20. Terapier, der fokuserer på at dræbe hovedparten af ​​tumoren kan gå glip af sjældne stilk-lignende fraktion, således at tumoren fortsat at vokse. Terapier, der fokuserer på at dræbe kræft stamceller kan give bedre behandling og prognose for patienter med hjernetumorer.

For at undersøge BTIC populationer har vi forfinet vores culture protokoller til specifikt selekterer for cellepopulationer inden humane hjernetumorer, der besidder stamceller egenskaber. Serumfrit, neural stamcelle (NSC) medium giver mulighed for opretholdelse af en udifferentieret stamcelle tilstand, og tilsætningen af ​​basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF), epidermal vækstfaktor (EGF) og leukæmiinhiberende faktor (LIF) tillader udbredelsen af ​​multi-potent, selvfornyende, og udvidelige menneskelige tumorspheres. Her beskriver vi de metoder, der er involveret i behandling af primære hjernetumorer og dyrkning dem i NSC medium til at berige BTIC befolkninger. Vi har kaldt vores eksperimentelle modelsystem "BTIC patientisolater" for at understrege, at disse celler er kun minimalt dyrkes under stamceller celle betingelser med henblik på selektion stamcellepopulationer. Efterfølgende immunolabelling for BTIC populationer for vigtige stamceller markører såsom CD133 og CD15 og flowcytometri-analyse er også beskrevet. Vi så diskutere begrænsende fortynding analyse,som hjælper med at studere selvfornyelse potentiale BTICs. Endelig udnytter vi den genekspressionsanalyse af disse sjældne celler ved at sortere enkelte celler på AmpliGrid objektglas og udføre enkelt celle RT-PCR. Disse teknikker gælder også for andre hjernetumorer, såsom medulloblastom ependymoma og pædiatriske gliomer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Culture of Brain Tumor Tissue

  1. Tilsæt 200 pi optøet Liberase (Roche Applied Science) til 15 ml kunstig CSF (aCSF-se tabel 1) og anbringes i 37 ° C vandbad. Liberase TM er en blanding af proteolytiske enzymer, der anvendes til at dissociere primære vævsprøver, såvel som dyrkede tumorspheres. I modsætning trypsin-EDTA, bevarer Liberase metoden overfladeantigenet CD133. For en vævsprøve på omkring 0,5 cm 3, bruger vi 200 pi Liberase. Hvis vævet er mindre, bruger vi 100 ul.
  2. Bring ammoniumchloridopløsning (Stamcelleforskning teknologi) til stuetemperatur. Ammoniumchloridopløsning forsigtigt lyserer røde blodlegemer med minimal virkning på andre celler. Den indeholder ikke et fiksativ.
  3. I steril biologisk sikkerhedsskab, tilsættes 5 ml aCSF til prøvebeholder, hvirvel at skylle væv, så pipette off. Dette trin hjælper med til fjernelse af røde blodlegemer (RBC).
  4. Overfør hjernetumor væv til en steril 100 mm Petri dish.
  5. Brug fine saks eller skalpeller og pincet, væv disaggregere til gylle konsistens.
  6. Indsaml prøve ved anvendelse af en 10 ml pipette regelmæssig eller pincet og overføre fragmenterne til røret indeholdende forvarmet aCSF med Liberase.
  7. Sted inkubator-ryster (30 rpm) og indstillet til 37 ° C, i 15 min.
  8. Filtreres vævet lysat ved 70 pm cell strainer i et 50 ml Falcon-rør.
  9. Spin filtratet ned ved 280 x g i 5 min.
  10. Fjern supernatanten omhyggeligt og vurdere størrelse og farve af den resulterende cellepellet: pellets, der er pink eller rød indikerer stigende antal røde blodlegemer.
  11. Resuspender pellet i 1 ml PBS.
  12. Tilsæt en passende mængde af ammoniumchloridopløsning (4-12 ml) baseret på pellet størrelse og røde blodlegemer kontaminering (for ammoniumchloridopløsning er meget blid og forøgede mængder er ikke skadelige for andre celler end røde celler).
  13. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
  14. Spin cellerned ved 280 x g i 5 min.
  15. Vask en gang med 10 ml steril PBS.
  16. Resuspender i 5 ml NSC komplet medium (tabel 2) og overføres til en ultralav binding 60 mm vævskulturplade (Corning). Vi anvender ultra-low bindende dyrkningsplader med kovalent bundne hydrogel overflader, der er hydrofile og neutralt ladet, for at minimere cellebinding-medieret differentiering.

For de første dage i kultur, ikke ændrer medierne: top-up kun med 1-2 ml medier efter behov, fortsætter derefter at observere kultur og forandring medier, når farven på mediet bliver en anelse gul.

2. Tumorsphere Dissociation for Flowcytometri

  1. Evaluere tumorspheres under mikroskop: Hvis kuglen størrelse er> 100 pm, er dissociation anbefales som større kugler kan blive nekrotiske i midten.
  2. Overføre kulturen til 15 ml konisk rør.
  3. Tilføj 2-3 ml steril PBS at skylle pladen grundigt og tilføje til konisk rør.
  4. Centrifuger ved 280 x g i 5 min.
  5. Fjern supernatanten og resuspender i 1-2 ml sterilt PBS.
  6. Tilsæt 10 gl Liberase.
  7. Der inkuberes i 37 ° C vandbad i 3 min. Fjern og visuelt vurdere suspension, hvis flere klumper set, tritureres forsigtigt ved hjælp af en 1.000 gl pipettespids.
  8. Hvis sammenklumpning fortsætter, inkubering i yderligere 1-2 min.
  9. Vask cellerne ved tilsætning af 5 ml sterilt PBS og centrifugering ved 280 x g i 5 min.
  10. Fjern supernatanten og resuspender i 500-1.000 pi sterilt PBS 2 mM EDTA.
  11. Vurdere celletal og levedygtighed ved hjælp af trypanblåt.
  12. Juster celletal til 1 million / ml i PBS 2 mM EDTA.

3. Overfladefarvning

  1. Overfør 100 gl 1x10 6 / ml cellesuspension pr test til 12x75 mm strømningsrør.
  2. Tilføj passende mængde af antistoffer. Matchede isotype kontrol bør anvendes for hverantistof (se tabel 3).
  3. Inkuber i 30 minutter på is.
  4. Tilsættes 2 ml PBS 2 mM EDTA til hver gennemstrømningsrøret.
  5. Centrifuger ved 200 x g i 4 minutter, dekanteres og blot.
  6. Resuspender pellet i 300 ul PBS 2 mM EDTA.
  7. Tilsæt 10 gl 7AAD levedygtighed farvestof til hvert rør og inkuberes i mindst 15 minutter på is.
  8. Analysere ved flowcytometri.

4. Flowcytometri indsamling og analyse af

De nærmere af indsamling og analyse af strømdata er instrument-afhængig. Repræsentative negative prøver køres og instrumentindstillinger etableret for Forward (størrelse) og Side (granularitet) scatter. Denne scatter mønster giver slutbrugeren at se alle celler i prøven, herunder affald. En region er normalt trukket omkring cellerne af interesse. (Figur 4a) Indstillinger derefter oprettet for alle fluorescens detektorer, der er nødvendige for at placere de negative celler i det første årti af AFluorescence intensitet plot. Når mere end én farve eller fluorochrom benyttes, skal enkelt farvede kontroller køres til at etablere farvekompensationsindstillinger værdier (subtraktion af interfererende fluorescens-emissioner). Når der køres levende celler, en levedygtighed farvning, såsom 7-AAD (7-amino-actinomycin D - excitation 488/emission 655) anvendes, og et andet område trækkes at udelukke døde celler (figur 4b). Begge disse regioner anvendes på yderligere analyse af prøverne.

5. Selvfornyelse Assay

Det centrale assay, lettes meget ved klonal kugle vækst in vitro test af selvfornyelse kapacitet, begrænsende fortynding assay. Tumorspheres dissocieres og distribueres fortyndinger ned til en enkelt celle per brønd, og hastigheden af ​​efterfølgende sfære dannelse over 7 dage i kultur beregnes. På dag 7, er procentdelen af brønde uden indhold af kugler for hver celle udpladningsdensitet (F 0) beregnes og afbildesmod antallet af celler per brønd (x). Antallet af celler, der kræves for at danne mindst en tumorsphere i hver brønd bestemmes fra det punkt, hvor linien krydser 0,37 niveau (F 0 = e-x). I en Poisson-fordeling af celler,. F 0 = 0,37 svarer til fortyndingen af en celle per brønd, således at denne beregning (37% skærer hinanden) afspejler frekvensen af klonogene stamceller i hele cellepopulationen (fig. 5)

6. Single Cell RT-PCR

Enkelte celler fra forskellige populationer er sorteret efter Beckman Coulter MoFlo XDP på ​​reaktionssteder på en AmpliGrid slide (Beckman Coulter cat # AG480F). Enkeltcelle RT-PCR udføres under anvendelse af AmpliGrid Single One Step RT-PCR-system (Beckman Coulter cat # OAX04515) ifølge producentens specifikationer. Kort fortalt en enkelt celle anbragt i hver reaktion sted i en AmpliGrid slide, tilstedeværelsen af ​​en enkelt celle i hverreaktionsstedet bekræftet ved mikroskopi. Revers transskription (RT) udføres umiddelbart efter sortering for at forhindre prøven i at blive bragt i fare. RT Master Mix fremstilles frisk, ifølge kittets instruktioner (tabel 4). Vi anvendte 0,03 ul af 25 pM tilfældige primere (Promega) per reaktion, 1 pi af master mix tilsættes til midten af ​​hver reaktionsstedet. Dette er umiddelbart overtrukket med 5 ul af forseglende opløsning (Beckman Coulter cat # OAX04503). Ved anvendelse af en AmpliSpeed ​​slide cycler (Beckman Coulter, kat # OAX04101), der objektglas inkuberet ved 25 ° C i 10 minutter, 42 ° C i 10 min, og 55 ° C i 45 minutter. Efter revers transkription, 3 ul DNase / RNase-frit vand tilsat til hver reaktion sted, og hele blandingen overføres til et PCR-rør (1 rør / sted). I en PCR-plade, et reaktionsvolumen på 10 pi anvendes til kvantitativ PCR: 8 pi qPCR stamblanding (5 pi SYBR Green (Quanta), 1 pi vand, 1 ml af 10 uM fremadrettet og revers primer mix) plus 2 &mu, l af RT blandingen. For real-time kvantificering der prøver kørt på en BioRad cycler under anvendelse af følgende program: 95 ° C i 10 minutter, 45 cykler af 95 ° C i 30 sek, 60 ° C i 60 sekunder, 72 ° C i 60 sekunder, efterfulgt ved 10 min ved 72 ° C og smeltekurve analyse. Ct-værdier blev bestemt ved anvendelse Opticon Monitor 3 (BioRad). Tre gener kan vurderes per celle, herunder GAPDH som housekeeping-gen. Genekspression normaliseres til GAPDH udtryk, ifølge 2-ΔCt. Mindst et dusin enkelte celler af den samme befolkning fra den samme slags kan bruges som biologisk gentagelser for at kompensere for manglende teknisk replikater.

7. Repræsentative resultater

Figur 1 viser et magnetisk resonansbilleddannelse (MRI) scan af en repræsentativ patient med en GBM. Hjernesvulst prøver opnås fra samtykkende patienter umiddelbart efter operationen, som er godkendt af Hamilton Health Sciences / McMaster Health Sciences Research Ethics Board. En del af hver prøve er givet til neuropathologist til rutinemæssig klinisk diagnose. Den resterende prøve behandles som vist i figur 2. Tumorcellerne, når udpladet i komplette neurale stamceller medier med vækstfaktorer, danner tumorspheres som vist i figur 3.

Tumorcellerne er mærket med neurale overflade stamceller markører CD133 og CD15 og analyseret ved flowcytometri som vist i figur 4..

Enkelte celler fra forskellige populationer af fx CD15 + / CD133 +, CD15 + / CD133-, CD15-/CD133 +, CD15-/CD133- Derefter sorteres i 96 brønds-plader (figur 5a) eller til AmpliGrid objektglas (figur 6a).

I 96-brønds plade, kan enkelte celler, som har selvfornyelse kapacitet (f.eks CD133 +-celler), (figur 5b), danner tumorspheres (figur 5c) efter inkubatorbation. En selvfornyelse graf kan afbildes (figur 5D) ved at tælle antallet af kugler dannet per brønd. Enkelte celler sorteret i reaktionsblandingen stedet for Ampligrid slide (figur 6a). The RNA ekstraheret fra enkelte celler kan revers transkriberes ved hjælp af Advalytix AmpliSpeed ​​(fig. 6b). Det opnåede cDNA anvendes til at udføre real time RT-PCR (figur 6c).

Figur 1
Figur 1. Magnetisk resonans billede (MR) af en patient GBM. MR-scanning af hjernen hos en 16-årig pige med en måned-lang historie af hovedpine og en uges historie af opkastning, sløvhed og sløret syn. Axial FLAIR sekvens viser en stor bi-hemisfærisk ("sommerfugl") GBM.

Figur 2
Figur 2. Brain tumor behandling. Hjernesvulst prøver er SKAFFESined fra samtykkende patienter umiddelbart efter kirurgi. De er mekanisk dissocieret som vist (a) og er derefter enzymatisk dissocieret i aCSF med Liberase ved inkubation i en 30 rpm rocking inkubator ved 37 ° C i 15 minutter (b).

Figur 3
Figur 3. BTIC befolkninger danner tumorspheres i kultur. Dissocierede hjernetumorceller udpladet i komplette neurale stamceller medier med vækstfaktorer danner tumorspheres.

Figur 4
Figur 4. Flowcytometrisk analyse af BTIC populationer. (A) Forward versus Side Scatter egenskaber tilvejebringe et billede af alle celler, herunder affald (b) Celler, som farves med levedygtighed dye 7-AAD er udelukket fra analysen. (C) placering af de statistiske kvadranter bestemmes under anvendelse af passende isotype kontrol (d) Tumorceller farvet med overfladen markers CD15-PE-og CD133-APC. (D) Moflo XDP cellesorterer. Klik her for at se større figur .

Figur 5
Figur 5. Begrænsende fortynding analyse af BTICs viser deres selvfornyelse kapacitet. (A) Celler af varierende fortyndinger sorteres i 96 brønde indeholdende 200 pi NSC til (b) en enkelt celle per brønd. (C) Efter en 7 dages inkubationsperiode en tumorsphere dannet. Morfologien af ​​sekundære tumorspheres er identisk med primære tumorspheres. (D) De gennemsnitlige x-skæringspunktet værdierne kan beregnes ud fra begrænsende fortyndingsanalyse for hver tumor subtype at afsløre det antal celler, der kræves for at danne mindst en tumorsphere per brønd.

Figur 6
Figur 6. Genekspressionsanalyse af en enkelt BTIC celleer muligt ved hjælp af en enkelt celle RT-PCR-teknologi. (a) Enkelte celler fra en BTIC population kan sorteres på AmpliGrid dias. (B) cDNA-syntese udføres på enkelte celler på AmpliGrid dias med den Advalytix AmpliSpeed. (C) Kvantitativ Realtime PCR udføres på cDNA syntetiseret ud fra enkelte BTIC celler.

2 M NaCI 62 ml
1M KCl 5 ml
1 M MgCl2 3,2 ml
155 mM NaHCO3 169 ml
1M Glucose 10 ml
108 mM CaCl2 0,9256 ml
Purelab Ultra H 2 0 749,84 ml

Tabel 1 kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) -. 1,000 ml.

Omgående basismedier 500 ml
01:01 DMEM: F12 480 ml
N2 supplement 5 ml
1M HEPES 5 ml
Glucose 3,0 g
N-acetylcystein (60 ug / ml) 1 ml
Neural overlevelsesfaktor-1 (NSF-1) 10 ml

Tabel 2. Neural stamcelle medier.

NSC komplette medier (lavet frisk før brug):
NSC basismedier + 20 ng / ml EGF (epidermal vækstfaktor) + 20 ng / ml bFGF (basisk fibroblastvækstfaktor) + 10 ng / ml LIF (leukæmiinhibitorisk faktor) * + 10 ul / ml antibiotisk-antimykotisk

* Leukæmiinhiberende faktor (LIF): Dette reagens fra Millipore indeholder en interleukin 6-klasse cytokin, en protein som undertrykker spontan differentiering af stamceller til fremme langsigtet opretholdelse af stamcellekulturer.

Antistoffer Leverandør / CAT # gl / test (i 100 ul)
CD133 / 2 APC (293C3) Miltenyi Biotec/130-090-854 5
IgG2b APC (isotypekontrol) Miltenyi Biotec/130-092-217 5
CD15PE Beckman Coulter/IM1954U 5
IgG2a-PE (isotypekontrol) Beckman Coulter/A09141 5
7AAD Beckman Coulter/A07704 10

Tabel 3. Flow antistoffer.

Component Volumen (1 reaktion) Volumen (48 reaktion)
2x Single Cell RT reaktionsbuffer 0,50 gl 30,0 gl
RNase Inhibitor (10 U / ul) 0,02 gl 1,2 gl
5X Single Cell RT enhancer 0,15 gl 9,00 gl
Single Cell RT Enzyme Mix 0,04 gl 2,4 gl
Advablue (OAX04227) 0,1 gl 6,00 gl
Nuclease frit vand fyldes op til 1 pi fyldes op til 60 ul

Tabel 4. Sammensætning af RT mester mix for Single Cell RTPCR (cat # OAX04515).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

The cancer stamceller hypotese 10, baseret på arbejde i leukæmi 21, brystkræft 11 og hjernecancer 4,5, foreslår, at kun en forholdsvis lille brøkdel af celler i tumoren, betegnet cancerstamceller, besidder en evne til omfattende proliferere og selvstændige -forny. De fleste af tumorcellerne mister evnen til at proliferere og selv-fornyelse idet de differentierer til celler, der bliver den fænotypiske signatur af tumoren. At finde de centrale celler i hjernen tumor befolkning, der er i stand til at opretholde tumoren vil give et indblik i den mekanisme i hjernen tumorigenese og vil give os mulighed for at spore tilbage til cellen oprindelseslandet.

Stamceller er funktionelt defineret som selvfornyende celler, der udviser multi-slægt differentiering 22-24. Primær hjernetumor væv dyrkes under dyrkningsbetingelser, der favoriserer stamcellevækstfaktor, der tidligere er fastsat til isolering af neurale stamceller som tumorspheres 6,26. Uanset patologisk subtype, inden for 24 til 48 timer efter primær kultur, udbytte fleste hjernetumorer et mindretal brøkdel af celler, der viser vækst i klonalt afledte neurosfæren-lignende klynger, eller tumorspheres. Således er vi i stand til at berige for BTIC populationer fra patientens hjerne tumorvæv.

Fremkomsten af multi-parameter fluorescerende cellesortering 27 og monoklonalt antistof-teknologi 28 har muliggjort oprensning af cancerstamceller baseret på celleoverflademarkører. Ved at bruge stamceller markører såsom CD133 og CD15, har vi været i stand til fremadrettet sortere efter bestemte stamcelle-lignende populationer, og at studere deres selvfornyelse kapacitet ved at udføre begrænsende fortynding assays. En caveat selvfornyelse assays blev indført ved en nylig undersøgelse viser, at in vitro selvfornyelse ikke altid hænger sammen med tumordannelse i musemodeller 29. Men vores seneste arbejde har vist, at in vitro selvfornyelse assays ikke korrelerer med patientens overlevelse, hvilket gør disse assays værdifulde til den igangværende undersøgelse af BTIC biologi 30.

Arbejde med primære humane væv giver mange tekniske udfordringer. Vævsbehandling bør udføres meget forsigtigt for at bevare levedygtigheden af ​​isolerede celler. Mængden af ​​Liberase anvendt og inkubationstid er kritisk. Flow sortering af celler kan optimeres for at øge post-sort levedygtighed ved hjælp af forskellige dyser og tryk. Vi oplever, at vores celler foretrækker at blive sorteret gennem en 100 um dyse ved 30 psi kappe pres. Sortering på Ampligrid slide reaktive steder kan være noget vanskelig: Det er vigtigt at bekræfte tilstedeværelsen af ​​det deponerede celler ved mikroskopi.

31. Hjernetumorer omfatter typisk morfologisk forskellige celler, som udtrykker en række neurale afstamning markører. Undersøgelse af hjernetumorer ved traditionel histopatologisk har kun haft en begrænset mængde viden om den kliniske adfærd af tumoren. Selv om de store fremskridt der er gjort i forståelsen af de molekylære genetiske ændringer af nogle hjernetumorer 3,32-34, især Medulloblastomas og maligne gliomer, og nogle af disse identificerede ændringer nu begynder at lede behandling, er det ikke klart, om alle tumor celler ækvivalente i deres evne til at opretholde tumorvækst. Analyse af centrale gener involveret i signalveje i hjernesvulst populationer er afgørende for at fremme vores forståelse af afvigende mekanismer, der fører til hjernen tumordannelse. Selv i en tilsyneladende homogennous væv, celler vise sig at være enestående i deres potentielle evner. Analyse af transkript-og protein-ekspressionsniveauer i enkelte celler viser, at der er en stor celle-celle variation både i den hvilende tilstand og ved udsættelse for stimuli 35-39. Derfor vil analysere hele population af celler ikke viser opførslen af ​​en enkelt celle. qRT-PCR betragtes som den gyldne standard for mRNA kvantificering 40-41. I denne undersøgelse viser vi forventede sortering af individuelle celler fra forskellige populationer på AmpliGrid objektglas. Ved hjælp af enkeltcelle RT-PCR, er vi i stand til at udføre genekspressionsanalyse på en enkelt celle fra en heterogen population, således evaluere den biologiske betydning af en udvalgt celle i en blandet population.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgements

Dette arbejde blev finansieret af Ontario Institute of Cancer Research (OICR), Terry Fox Foundation og American Association of Neurologiske Surgeons.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1:1 DMEM:F12 Invitrogen 11320-082
N2 supplement Invitrogen 17502-048
1M HEPES Wisent Inc. 330-050-EL
Glucose Invitrogen 15023-021
N-acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165-25g
Neural survival factor -1 (NSF-1) Lonza Clonetics CC-4323
Epidermal growth factor (EGF) Sigma-Aldrich E9644
Basic fibroblast growth factor (bFGF) Invitrogen PHG0261
Leukemia inhibitory factor (LIF) EMD Millipore LIF1010
Antibiotic/mycotic Wisent Inc. 450-115-EL
Liberase TM Roche Group 05 401 119 001
Ammonium chloride solution Stem Cell Technologies 07850

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ohgaki, H., Kleihues, P. Epidemiology and etiology of gliomas. Acta Neuropathol. 109, 93 (2005).
  2. Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma. 10, 319 (2010).
  3. Wechsler-Reya, R., Scott, M. P. The developmental biology of brain tumors. Annu. Rev. Neurosci. 24, 385 (2001).
  4. Singh, S. K. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Res. 63, 5821 (2003).
  5. Singh, S. K. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396 (2004).
  6. Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev. Biol. 175, 1 (1996).
  7. Tropepe, V. Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev. Biol. 208, 166 (1999).
  8. Yin, A. H. AC133, a novel marker for human hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 90, 5002 (1997).
  9. Yu, Y., Flint, A., Dvorin, E. L., Bischoff, J. AC133-2, a novel isoform of human AC133 stem cell antigen. J. Biol. Chem. 277, 20711 (2002).
  10. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414, 105 (2001).
  11. Al-Hajj, M. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 3983 (2003).
  12. Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat. Med. 3, 730 (1997).
  13. Matsui, W. Characterization of clonogenic multiple myeloma cells. Blood. 103, 2332 (2004).
  14. Bao, S. Targeting cancer stem cells through L1CAM suppresses glioma growth. Cancer Res. 68, 6043 (2008).
  15. Bao, S. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444, 756 (2006).
  16. Bao, S. Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor. Cancer Res. 66, 7843 (2006).
  17. Beier, D. Temozolomide preferentially depletes cancer stem cells in glioblastoma. Cancer Res. 68, 5706 (2008).
  18. Piccirillo, S. G. Distinct pools of cancer stem-like cells coexist within human glioblastomas and display different tumorigenicity and independent genomic evolution. Oncogene. 28, 1807 (2009).
  19. Piccirillo, S. G. morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature. 444, 761 (2006).
  20. Rich, J. N., Bao, S. Chemotherapy and cancer stem cells. Cell Stem Cell. 1, 353 (2007).
  21. Lapidot, T. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367, 645 (1994).
  22. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414, 105 (2001).
  23. Fuchs, E., Segre, J. A. Stem cells: a new lease on life. Cell. 100, 143 (2000).
  24. Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157 (2000).
  25. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707 (1992).
  26. Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes. J. Neurosci. 12, 4565 (1992).
  27. Hulett, H. R., Bonner, W. A., Barrett, J., Herzenberg, L. A. Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence. Science. 166, 747 (1969).
  28. Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495 (1975).
  29. Barrett, L. E. Self-renewal does not predict tumor growth potential in mouse models of high-grade glioma. Cancer Cell. 21, 11 (2012).
  30. Venugopal, C. Bmi1 marks intermediate precursors during differentiation of human brain tumor initiating cells. Stem Cell Res. 8, 141 (2012).
  31. Gerlinger, M. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883 (2012).
  32. Gilbertson, R. J. Medulloblastoma: signalling a change in treatment. Lancet. Oncol. 5, 209 (2004).
  33. Zhu, Y., Parada, L. F. The molecular and genetic basis of neurological tumours. Nat. Rev. Cancer. 2, 616 (2002).
  34. Maher, E. A. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15, 1311 (2001).
  35. Blake, W. J., KAErn, M., Cantor, C. R., Collins, J. J. Noise in eukaryotic gene expression. Nature. 422, 633 (2003).
  36. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297, 1183 (2002).
  37. Maheshri, N., O'Shea, E. K. Living with noisy genes: how cells function reliably with inherent variability in gene expression. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 413 (2007).
  38. Raj, A. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4, e309 (2006).
  39. Ross, I. L., Browne, C. M., Hume, D. A. Transcription of individual genes in eukaryotic cells occurs randomly and infrequently. Immunol. Cell Biol. 72, 177 (1994).
  40. Kubista, M. The real-time polymerase chain reaction. Mol. Aspects Med. 27, 95 (2006).
  41. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat. Protoc. 1, 1559 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats