Behandling av primær hjernesvulst Tissue for Stem Cell Assays og Flow Sortere

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Identifisering av hjernesvulst initiere celler (BTICs), sjeldne celler i en heterogen tumor besitter stamcelleforskningen egenskaper, gir ny innsikt i menneskelige hjerne svulst patogenesen. Vi har raffinert spesifikke kultur forhold til å berike for BTICs, og vi rutinemessig bruk flowcytometri å berike disse populasjonene. Selvfornyelse analyser og karakterutskrift analyse av enkelt celle RT-PCR kan senere bli utført på disse isolerte celler.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Venugopal, C., McFarlane, N. M., Nolte, S., Manoranjan, B., Singh, S. K. Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting. J. Vis. Exp. (67), e4111, doi:10.3791/4111 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hjernesvulster er vanligvis består av morfologisk forskjellige celler som uttrykker en rekke nevrale avstamning markører. Bare en forholdsvis liten brøkdel av celler i tumoren med stilk celleegenskaper betegnes hjernesvulst initierende celler (BTICs), ha en evne til å differensiere langs flere linjer, selv-fornyelse og initiere svulster in vivo. Vi søkte dyrkningsbetingelser opprinnelig brukt for normale nevrale stamceller (NSCs) til en rekke menneskelige hjernesvulster og funnet ut at denne kulturen metoden spesielt velger for stilk-lignende populasjoner. Serumfritt medium (NSC) muliggjør opprettholdelse av en udifferensiert stamcelle tilstand, og tillegg av bFGF og EGF tillater spredning av multi-potente, selv-fornyelse, og utvidbare tumorspheres.

For ytterligere å karakterisere hver svulsten BTIC befolkningen, vurderer vi celleoverflaten markører ved flowcytometri. Vi kan også sortere bestander av interesse for mer spesifikke characterizasjon. Selvfornyelse analysene er utført på enkelt BTICs sortert i 96 brønners plater; dannelsen av tumorspheres etter inkubering ved 37 ° C indikerer nærværet av en stilk eller stamceller. Flere celle tall av en bestemt populasjon kan også sorteres i forskjellige brønner for begrensende fortynning analyse, å analysere selvfornyelse kapasitet. Vi kan også studere differensial genuttrykk i en bestemt celle befolkning ved hjelp av enkelt celle RT-PCR.

Følgende protokoller beskrive våre prosedyrer for dissosiasjon og dyrkning av primære humane prøver å berike for BTIC populasjoner samt Dissosiasjonen av tumorspheres. Det finnes også protokoller for farging for flowcytometri analyse eller sortering, selvfornyelse analyser, og enkelt celle RT-PCR.

Introduction

Hjernesvulster er blant de mest aggressive og heterogene kreft kjent hos mennesker. Selv om deres tidligere oppdagelse og diagnose er tilrettelagt av moderne nevro-imaging teknologi, vi mangler fortsatt helbredende terapi for mange hjernesvulster, spesielt for diffuse, invasive eller de ligger dypt i hjernen.

Hjernesvulster representerer den ledende årsaken til kreft dødelighet hos barn på grunn av deres svært aggressiv og ofte uhelbredelig natur. Glioblastoma (GBM), den vanligste primær hjernesvulst hos voksne, er en av de mest aggressive humane cancertyper fryktet for sine jevnt dødelig prognose 1. Denne svært ondartet astrocytic tumor (WHO grad 4) oppstår vanligvis i de cerebrale halvkuler av voksne, og kan også forekomme i små barn og spedbarn. Veksten er rask og infiltrerende og diagnostiske patologiske funksjoner inkluderer kjernekraft pleomorphism, mikrovaskulær spredning, og nekrose 2,3. For adults med nylig diagnostisert GBM, strekker median overlevelse sjelden utover 12 måneder 1, med generelt dårlige svar på alle terapeutiske modaliteter. Vi merket oss at det er mange funksjonelle og genetiske likheter som deles av somatiske stamceller og kreftceller, og at de molekylære mekanismer som regulerer normal utvikling av hjernen er ofte feilregulert i kreft. Ved anvendelsen av stamceller biologi paradigmer til studiet av hjernesvulster, vi var de første forskerne som prospektivt identifisere og rense en undergruppe av celler fra menneskelige GBMS som utstilt stamcelleforskningen egenskaper spredning, selvfornyelse og differensiering in vitro 4 og i vivo 5. Vi søkte dyrkningsbetingelser og analyser opprinnelig brukt for å karakterisere normale nevrale stamceller (NSCs) in vitro 6,7 til flere barn og voksne hjernesvulster, og beriket for disse stilk-lignende celler ved celle sortering for den nevrale stamceller overflate markør CD133 8 ,9. Den CD133 + hjernesvulst brøkdel inneholdt celler som hadde en mye høyere frekvens av startfasen enn CD133-fraksjonen i NOD-SCID mus hjerner 5,10. Dette formelt etablert som bare en sjelden undergruppe av hjernesvulst celler med stamcelle egenskaper er tumor-initiere, tjene dem navnet "hjernesvulst initiere celler" eller "BTICs". Romanen identifisering av BTICs gir ny innsikt i menneskelige hjerne tumorigenesis, noe som gir sterk støtte til kreft stamceller hypotese 10-13 som grunnlag for mange solide svulster, og etablerer en ny mobil mål for mer effektive kreft behandlinger 14-20. Terapi som fokuserer på å drepe mesteparten av svulsten kan gå glipp av den sjeldne stilk-lignende fraksjon, slik at svulsten å fortsette å vokse. Terapi som fokuserer på å drepe kreft stamcelle kan gi bedre behandling og prognose for pasienter med hjernesvulster.

For å studere BTIC populasjoner, har vi videreutviklet vår culture protokoller spesifikt velger for celle populasjoner innenfor menneskelige hjernesvulster som besitter stamcelleforskningen egenskaper. Serumfritt, nevrale stamcelle (NSC) mediet tillater for vedlikehold av en udifferensiert stamcelle tilstand, og tillegg av grunnleggende fibroblast vekstfaktor (bFGF), epidermal vekstfaktor (EGF), og leukemi inhibitorisk faktor (LIF) tillater spredning av multi-potent, selv fornye og utvidbare menneskelige tumorspheres. Her beskriver vi de metoder som er involvert i behandlingen av primære hjernesvulster og dyrking dem i NSC medium å berike for BTIC populasjoner. Vi har kalt vårt eksperimentell modell system "BTIC polikliniske pasienter" for å understreke det faktum at disse cellene er bare minimalt dyrket i henhold stammen celle forhold til å velge for stamcelleforskningen populasjoner. Påfølgende immunolabelling av BTIC populasjoner for viktige stamceller markører som CD133 og CD15 og flowcytometri analyse er også beskrevet. Vi diskuterer den begrensende fortynning analyse,som hjelpemidler i å studere selvfornyelse potensialet BTICs. Til slutt undersøker vi genekspresjonsanalyse av disse sjeldne celler ved å sortere enkeltceller på AmpliGrid lysbilder og utføre enkelt celle RT-PCR. Disse teknikkene er også gjeldende for andre hjernesvulster som medulloblastoma, ependymoma og pediatriske hjernesvulst.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Culture of Brain Tumor Tissue

  1. Tilsett 200 pl opptint Liberase (Roche Applied Science) til 15 ml kunstig CSF (aCSF-se tabell 1) og fyll i 37 ° C vannbad. Liberase TM er en blanding av proteolytiske enzymer som brukes å dissosiere primære vevsprøver samt dyrkede tumorspheres. I motsetning til Trypsin-EDTA, bevarer Liberase metoden overflateantigen CD133. For en vevsprøve av ca 0,5 cm 3, bruker vi 200 ul Liberase. Hvis vevet er mindre, bruker vi 100 ul.
  2. Bring ammoniumkloridoppløsning (stamcelle teknologier) til romtemperatur. Ammoniumkloridoppløsning lyserer forsiktig røde blodceller med minimal effekt på andre celler. Det inneholder ikke et bindemiddel.
  3. I steril biologisk sikkerhetskabinett, tilsett 5 ml aCSF til prøven beholder, virvel å skylle vev, og pipetter av. Dette trinnet bidrar til å fjerne røde blodceller (RBC).
  4. Overføre hjernesvulst vevet til en steril 100 mm Petri dish.
  5. Ved hjelp av fine saks eller skalpeller og pinsetter, disaggregate vev til slurry konsistens.
  6. Samle prøve å bruke en 10 ml vanlig pipette eller tang og overføre fragmenter inn i røret som inneholder forvarmet aCSF med Liberase.
  7. Place inkubator-shaker (30 rpm) og satt til 37 ° C, i 15 min.
  8. Filtrer vevet lysatet gjennom 70 um celle sil i en 50 ml Falcon-rør.
  9. Spinn filtratet ned på 280 xg i 5 min.
  10. Fjern supernatanten forsiktig og evaluere størrelse og farge av den resulterende cellepelleten: pellets som er rosa eller røde indikerer økende antall røde blodlegemer.
  11. Gjensuspender pellet i 1 ml PBS.
  12. Tilsett en passende mengde av ammoniumkloridoppløsning (4-12 ml) basert på pelletstørrelse og røde blodceller kontaminering (den ammoniumkloridoppløsning er meget mild og økte mengder er ikke skadelig for cellene enn røde celler).
  13. Inkuber ved romtemperatur i 5 min.
  14. Spin cellerned på 280 xg i 5 minutter.
  15. Vask en gang med 10 ml sterilt PBS.
  16. Resuspender i 5 ml NSC komplett medium (Tabell 2) og overfør til en ultra-lav binding 60 mm vevskultur plate (Corning). Vi bruker ultralave bindende lagede agarskåler med kovalent bundet hydrogel overflater som er hydrofile og nøytralt ladet, for å minimere cellefesting-mediert differensiering.

For de første dagene i kultur, ikke endrer mediene: top-up bare med 1-2 ml media etter behov, og deretter fortsette å observere kultur og endring media når fargen på media blir litt gult.

2. Tumorsphere Dissosiasjon for flowcytometri

  1. Evaluere tumorspheres under mikroskop: hvis sfæren størrelse er> 100 pm, er dissosiasjon anbefales som større sfærer kan bli nekrotisk i sentrum.
  2. Overføre kulturen til 15 ml koniske rør.
  3. Legg 2-3 ml sterilt PBS å skylle plate grundig og legge til konisk tube.
  4. Sentrifuger ved 280 xg i 5 minutter.
  5. Fjern supernatant og resuspender i 1 - 2 ml sterilt PBS.
  6. Tilsett 10 ul Liberase.
  7. Inkuber i 37 ° C vannbad i 3 min. Fjern og visuelt vurdere suspensjon, hvis flere klumper sett, triturate forsiktig med en 1000 ul pipettespiss.
  8. Hvis klumper vedvarer, fortsetter inkubering for en ekstra 1-2 min.
  9. Vask cellene ved tilsetning av 5 ml sterilt PBS og sentrifugering ved 280 xg i 5 minutter.
  10. Fjern supernatant og resuspender i 500-1000 ul sterile PBS 2 mM EDTA.
  11. Vurdere celle nummer og levedyktighet ved hjelp trypan blå.
  12. Juster celletall til 1 million / ml i PBS 2 mM EDTA.

3. Surface Farging

  1. Overfør 100 ul av 1x10 6 / ml cellesuspensjon per test til 12x75 mm flyt rør.
  2. Legge til riktig mengde av antistoffer. Matchet isotype kontroller skal brukes for hverantistoff (se tabell 3).
  3. Inkuber i 30 min på isen.
  4. Tilsett 2 ml PBS 2 mM EDTA til hver målerøret.
  5. Sentrifuger ved 200 xg for 4 min, decant og blot.
  6. Gjensuspender pellet i 300 ul PBS 2 mM EDTA.
  7. Tilsett 10 pl 7AAD levedyktighet fargestoff til hvert rør og inkuberes i minst 15 minutter på is.
  8. Analyser av flowcytometri.

4. Flowcytometri Oppkjøp og analyse

Spesifikk av innsamling og analyse av flowdata er instrument-avhengige. Representative negative prøver er kjørt og instrumentinnstillinger etablert for Forward (størrelse) og Side (granularitet) scatter. Dette scatter mønster lar sluttbrukeren å vise alle celler i prøven, herunder avfall. En region er vanligvis trukket rundt cellene av interesse. (Figur 4a) Innstillinger blir deretter etablert for alle fluorescens detektorer som kreves for å plassere de negative celler i det første tiåret av afluorescence intensitet plot. Når mer enn én farge eller fluorokrom brukes, må enkelt farget kontrollene kjøres for å etablere fargekompensasjon verdier (subtraksjon av forstyrrende fluorescens-utslipp). Når kjøre levende celler, en levedyktighet dye eksempel 7-AAD (7-amino-Actinomycin D - eksitasjon 488/emission 655) brukes, og et andre område trukket å ekskludere døde celler (figur 4b). Begge av disse regionene påføres noen videre analyse av prøvene.

5. Selvfornyelse Assay

Nøkkelen assay som er mye lettere å klonal sfære vekst er in vitro-test av selvfornyelse kapasitet, den begrensende fortynningsanalyse. Tumorspheres er dissosiert og distribuert ved fortynninger ned til en enkelt celle per brønn, og hastigheten for påfølgende sfære formasjon over 7 dager i kultur beregnes. På dag 7, prosentandel av brønner som ikke inneholder kuler for hver celle Plating tettheten (F 0) beregnes og plottesmot antall celler per brønn (x). Antall celler som kreves for å danne minst en tumorsphere i hver brønn blir bestemt fra det punktet hvor linjen krysser 0,37 nivået (F 0 = e-x). I en Poisson fordeling av celler, F 0 = 0,37 tilsvarer fortynningen av en celle per brønn, slik at denne beregningen (den 37% intersect) reflekterer frekvensen clonogenic stamceller i hele cellepopulasjon (figur 5).

6. Enkelt celle RT-PCR

Enkeltceller fra ulike populasjoner er sortert etter Beckman Coulter MoFlo XDP på ​​reaksjon nettsteder på en AmpliGrid lysbilde (Beckman Coulter cat # AG480F). Enkelt celle RT-PCR utføres med AmpliGrid Enkel One Step RT-PCR system (Beckman Coulter cat # OAX04515) i henhold til produsentens spesifikasjoner. Kort, er en enkelt celle deponert inn i hver reaksjon området av en AmpliGrid lysbilde, tilstedeværelse av en enkelt celle i hverreaksjonsstedet bekreftet ved mikroskopi. Revers transkripsjon (RT) utføres umiddelbart etter sortering for å hindre at prøven fra å bli kompromittert. RT mester mix er forberedt frisk, ifølge kit instruksjoner (Tabell 4). Vi brukte 0,03 pl 25 uM tilfeldige primere (Promega) per reaksjon; 1 ul av konsentrat-blanding tilsettes til midten av hver reaksjonsstedet. Dette er umiddelbart belagt med 5 ul av tettende løsning (Beckman Coulter cat # OAX04503). Bruke en AmpliSpeed ​​lysbilde cycler (Beckman Coulter, cat # OAX04101) blir lysbilder inkubert ved 25 ° C i 10 min, 42 ° C i 10 min, og 55 ° C i 45 min. Etter revers transkripsjon, 3 ul DNase / RNase-fritt vann blir tilsatt til hver reaksjon for reiser, og hele blandingen overført til en PCR rør (en rør / område). I en PCR-plate, er et reaksjonsprodukt av 10 ul volum brukes for kvantitativ PCR: 8 pl qPCR konsentrat-blanding (5 pl SYBR Green (Quanta), 1 pl vann, 1 pl av 10 pM forover og revers primer mix) pluss 2 μ l av RT blanding. For sanntid kvantifisering, blir prøvene kjørt på en BioRad cycler med følgende program: 95 ° C i 10 min, 45 sykluser av 95 ° C i 30 sek, 60 ° C i 60 sek, 72 ° C i 60 sek, etterfulgt etter 10 minutter ved 72 ° C og smeltepunkt kurve analyse. Ct-verdier ble fastsatt ved hjelp av Opticon Monitor 3 (BioRad). Tre gener kan vurderes per celle, inkludert GAPDH som husholdningsgenet. Genekspresjon normalisert til GAPDH uttrykk ifølge 2-ΔCt. Minst et dusin enkeltceller av samme populasjon fra samme sorter kan brukes som biologisk replikater å kompensere for mangel på teknisk replikater.

7. Representant Resultater

Figur 1 viser en Magnetic Resonance Imaging (MRI) skanning av en representant pasient med en GBM. Hjernesvulst prøvene er hentet fra samtykkende pasienter umiddelbart etter operasjonen, som er godkjent av Hamilton Health Sciences / McMaster Health Sciences Forskningsetisk styret. En del av hver prøve er gitt til nevropatologen for rutinemessig klinisk diagnose. Den gjenværende prøven er behandlet som vist på figur 2. Tumorcellene, gang belagt i komplette nevrale stamceller medier med vekstfaktorer, form tumorspheres som vist i figur 3..

Tumorcellene er merket med nevrale overflate stamceller markører CD133 og CD15 og analysert ved flowcytometri, som vist i Figur 4.

Enkeltceller fra ulike populasjoner for f.eks, CD15 + / CD133 +, CD15 + / CD133-, CD15-/CD133 +, CD15-/CD133- blir deretter sortert i 96 brønners plater (figur 5a) eller inn AmpliGrid lysbilder (figur 6a).

I 96 brønners plate, kan enkle celler som besitter selvfornyelse kapasitet (f.eks CD133 + celler), (figur 5b), danner tumorspheres (figur 5c) etter inkuberingbation. En selvfornyelse graf kan plottes (Figur 5d) ved å telle antall av kuler dannet per brønn. Enkeltceller sortert inn reaksjonsstedet av Ampligrid lysbildet (figur 6a). RNA ekstrahert fra enkeltceller kan omvendt transkribert med Advalytix AmpliSpeed ​​(figur 6b). CDNA erholdte brukes til å utføre Sanntid RT-PCR (figur 6c).

Figur 1
Figur 1. Magnetisk resonans image (MRI) av en pasient GBM. MR av hjernen til en 16 år gammel jente med en måneds lang historie med hodepine og en ukes historie oppkast, sløvhet og synsforstyrrelser. Axial FLAIR-sekvens viser en stor bi-hemispheric ("sommerfugl") GBM.

Figur 2
Figur 2. Hjernesvulst behandling. Brain tumorprøver er obtastudere aggressiv fra samtykkende pasienter umiddelbart etter operasjonen. De er mekanisk dissosiert som vist (a), og er deretter enzymatisk dissosiert i aCSF med Liberase ved inkubering i en 30 rpm rocking inkubator ved 37 ° C i 15 min (b).

Figur 3
Figur 3. BTIC populasjoner danne tumorspheres i kultur. Danner dissosiert hjernesvulst celler belagt i komplette nevrale stamceller media med vekstfaktorer tumorspheres.

Figur 4
Figur 4. Flowcytometrisk analyse av BTIC populasjoner. (A) forover versus sidespredning egenskaper gir et bilde av alle cellene, inkludert rusk (b) Celler som flekker med levedyktighet fargestoff 7-AAD er ekskludert fra analyse. (C) plassering av de statistiske kvadrantene bestemmes ved hjelp av egnede isotype kontroller (d) Kreftceller farget med overflate markers CD15-PE og CD133-APC. (D) Moflo XDP celle sorter. Klikk her for å se større figur .

Figur 5
Figur 5. Begrensende fortynning analyse av BTICs avslører deres selvfornyelse kapasitet. (A) Celler av varierende fortynninger blir sortert i 96 brønner inneholdende 200 pl NSC til (b) en enkelt celle per brønn. (C) Etter en 7 dagers inkuberingsperiode, en tumorsphere dannet. Morfologien av sekundære tumorspheres er identisk med primære tumorspheres. (D) De gjennomsnittlige x-akse verdier kan beregnes ut fra begrensende fortynning analyse for hver tumor subtype for å vise antall celler som kreves for å danne minst en tumorsphere per brønn.

Figur 6
Figur 6. Genekspresjonsanalyse av en enkelt BTIC celleer mulig å bruke én enkelt celle RT-PCR-teknologi. (a) Single celler fra en BTIC befolkning kan sorteres på AmpliGrid lysbilder. (B) cDNA syntese er utført på enkeltceller på AmpliGrid lysbilder ved hjelp av Advalytix AmpliSpeed. (C) Kvantitativ realtime PCR utført på cDNA syntetisert fra enkelt BTIC celler.

2M NaCl 62 ml
1M KCl 5 ml
1M MgCl 2 3,2 ml
155 mm NaHCO 3 169 ml
1M Glukose 10 ml
108 mm CaCl 2 0,9256 ml
Purelab Ultra H 2 0 749,84 ml

Tabell 1 Kunstig cerebrospinalvæsken (aCSF) -. 1000 ml.

Lager Basal media 500 ml
01:01 DMEM: F12 480 ml
N2 supplement 5 ml
1M HEPES 5 ml
Glukose 3,0 g
N-acetylcystein (60 ug / ml) 1 ml
Nevrale overlevelse faktor-1 (NSF-1) 10 ml

Tabell 2. Neural stamcelleforskningen media.

NSC komplette medier (laget fersk før bruk):
NSC basal medier + 20 ng / ml EGF (epidermal vekstfaktor) + 20 ng / ml bFGF (basic fibroblast growth factor) + 10 ng / ml LIF (leukemi inhibitorisk faktor) * + 10 pl / ml antibiotika-antimykotikum

* Leukemi hemmende faktor (LIF): Denne reagensen fra Millipore inneholder en interleukin 6 klasse cytokin, en protein som undertrykker spontan differensiering av stamceller fremme lengre sikt vedlikehold av stamcelleforskningen kulturer.

Antistoffer Leverandør / CAT # pl / test (i 100 ul)
CD133 / 2 APC (293C3) Miltenyi Biotec/130-090-854 5
IgG2b APC (isotype kontroll) Miltenyi Biotec/130-092-217 5
CD15PE Beckman Coulter/IM1954U 5
IgG2a PE (isotype kontroll) Beckman Coulter/A09141 5
7AAD Beckman Coulter/A07704 10

Tabell 3. Flow antistoffer.

Komponent Volum (1 reaksjon) Volum (48 reaksjon)
2x Enkeltseng Cell RT reaksjon Buffer 0,50 ul 30,0 ul
RNase Inhibitor (10 U / ul) 0,02 ul 1,2 pl
5x Enkeltseng Cell RT enhancer 0,15 ul 9,00 ul
Enkelt celle RT Enzyme Mix 0,04 ul 2,4 pl
Advablue (OAX04227) 0,1 pl 6,00 ul
Nuklease fritt vann gjøre opp til 1 pl fyll opp til 60 ul

Tabell 4. Sammensetning av RT mester mix for Single Cell RTPCR (cat # OAX04515).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kreften stamcelle hypotesen 10, basert på arbeid i leukemi 21, brystkreft 11 og hjernekreft 4,5, antyder at bare en relativt liten del av cellene i svulsten, betegnet kreft stamceller, besitter en evne til omfattende sprer og selv fornye. De fleste av kreftceller mister evnen til å spre seg og selv fornye som de differensiere i cellene som blir den fenotypiske signatur av svulsten. Finne de viktigste cellene i hjernen svulst befolkningen som er i stand til å opprettholde svulsten vil gi innsikt i mekanismen i hjernen tumorigenesis og vil tillate oss å spore tilbake til cellen opprinnelse.

Stamceller er funksjonelt definert som selvstendig fornye celler som viser multi-avstamning differensiering 22-24. Primær hjernesvulst vev er dyrket under kultur forhold som favoriserer stamcelleforskningen vekst, tidligere etablert for isolering av nevrale stamceller som tumorspheres 6,26. Uavhengig av patologisk undertype, innen 24 til 48 timer av primær kultur, fleste hjernesvulster gi en minoritet brøkdel av celler som viser vekst inn klonalt avledet neurosphere-lignende klynger eller tumorspheres. Dermed er vi i stand til å berike for BTIC populasjoner fra pasientens hjernesvulst vev.

Bruk av multi-parameter fluorescerende aktivert celle sortering 27 og monoklonal antistoff-teknologi har gjort det mulig 28 for rensing av kreftstamceller celler basert på celleoverflaten markører. Ved å bruke stamceller markører som CD133 og CD15, har vi vært i stand til å prospektivt sortere etter bestemte stamcelle-liknende populasjoner og for å studere deres selvfornyelse kapasitet ved å utføre begrensende fortynning analyser. En caveat av selvfornyelse analyser ble innført av en fersk undersøkelse som viser at in vitro selvfornyelse ikke korrelerer alltid med svulst formasjonen i musemodeller 29. Men vårt siste arbeid har vist at in vitro selvfornyelse analyser ikke korrelerer med pasientens overlevelse, rendering disse analysene verdifull for den pågående studie av BTIC biologi 30.

Arbeide med primær menneskelig vev presenterer mange tekniske utfordringer. Tissue behandling bør utføres svært forsiktig for å bevare levedyktigheten av isolerte celler. Mengden Liberase brukt og tidspunkt for inkuberingen er kritisk. Flow sortering av celler kan bli optimalisert for å øke post-sorter levedyktighet ved hjelp av ulike dyser og trykk. Vi finner at cellene våre foretrekker å bli sortert gjennom en 100μm dyse på 30 psi av kappen press. Sortering bort Ampligrid lysbilde reaktive seter kan være noe vanskelig: det er viktig for å bekrefte tilstedeværelsen av det deponerte celle ved mikroskopi.

31. Hjernesvulster er vanligvis består av morfologisk forskjellige celler som uttrykker en rekke nevrale avstamning markører. Studien av hjernesvulster av tradisjonelle histopatologi har bare gitt en begrenset mengde kunnskap om klinisk atferd av svulsten. Selv om store fremskritt har blitt gjort i forståelse av de molekylære genetiske forandringer av noen hjernesvulster 3,32-34, spesielt Medulloblastomas og ondartet hjernesvulst, og noen av disse identifiserte endringer er nå i ferd med å veilede behandling, er det ikke klart om alle svulst cellene er ekvivalent i sin evne til å opprettholde tumorvekst. Analyse av viktige gener involvert i signalveier i hjernesvulst populasjoner er kritisk til å videreutvikle vår forståelse av avvikende mekanismene som fører til hjernesvulst formasjon. Selv i en tilsynelatende homogenenous vev, celler vise seg å være unike i sine potensielle evner. Analyse av transkripsjon og protein ekspresjon nivåer i enkeltceller avslører at det er en stor celle-celle variasjon både i hviletilstand og når de utsettes for stimuli 35-39. Derfor vil analysere hele populasjonen av celler ikke avsløre virkemåten for en enkelt celle. QRT-PCR anses å være gullstandarden for mRNA kvantifisering 40-41. I denne studien, viser vi potensielle sortering av individuelle celler fra forskjellige populasjoner på AmpliGrid lysbilder. Bruke enkeltcelle RT-PCR, er vi i stand til å utføre genekspresjonsanalyse på en enkelt celle fra en heterogen populasjon, dermed evaluere den biologiske betydning av en valgt celle i en blandet populasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble finansiert av Ontario Institute of Cancer Research (OICR), Terry Fox Foundation og American Association for nevrologisk Surgeons.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1:1 DMEM:F12 Invitrogen 11320-082
N2 supplement Invitrogen 17502-048
1M HEPES Wisent Inc. 330-050-EL
Glucose Invitrogen 15023-021
N-acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165-25g
Neural survival factor -1 (NSF-1) Lonza Clonetics CC-4323
Epidermal growth factor (EGF) Sigma-Aldrich E9644
Basic fibroblast growth factor (bFGF) Invitrogen PHG0261
Leukemia inhibitory factor (LIF) EMD Millipore LIF1010
Antibiotic/mycotic Wisent Inc. 450-115-EL
Liberase TM Roche Group 05 401 119 001
Ammonium chloride solution Stem Cell Technologies 07850

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ohgaki, H., Kleihues, P. Epidemiology and etiology of gliomas. Acta Neuropathol. 109, 93 (2005).
  2. Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma. 10, 319 (2010).
  3. Wechsler-Reya, R., Scott, M. P. The developmental biology of brain tumors. Annu. Rev. Neurosci. 24, 385 (2001).
  4. Singh, S. K. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Res. 63, 5821 (2003).
  5. Singh, S. K. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396 (2004).
  6. Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev. Biol. 175, 1 (1996).
  7. Tropepe, V. Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev. Biol. 208, 166 (1999).
  8. Yin, A. H. AC133, a novel marker for human hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 90, 5002 (1997).
  9. Yu, Y., Flint, A., Dvorin, E. L., Bischoff, J. AC133-2, a novel isoform of human AC133 stem cell antigen. J. Biol. Chem. 277, 20711 (2002).
  10. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414, 105 (2001).
  11. Al-Hajj, M. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 3983 (2003).
  12. Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat. Med. 3, 730 (1997).
  13. Matsui, W. Characterization of clonogenic multiple myeloma cells. Blood. 103, 2332 (2004).
  14. Bao, S. Targeting cancer stem cells through L1CAM suppresses glioma growth. Cancer Res. 68, 6043 (2008).
  15. Bao, S. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444, 756 (2006).
  16. Bao, S. Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor. Cancer Res. 66, 7843 (2006).
  17. Beier, D. Temozolomide preferentially depletes cancer stem cells in glioblastoma. Cancer Res. 68, 5706 (2008).
  18. Piccirillo, S. G. Distinct pools of cancer stem-like cells coexist within human glioblastomas and display different tumorigenicity and independent genomic evolution. Oncogene. 28, 1807 (2009).
  19. Piccirillo, S. G. morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature. 444, 761 (2006).
  20. Rich, J. N., Bao, S. Chemotherapy and cancer stem cells. Cell Stem Cell. 1, 353 (2007).
  21. Lapidot, T. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367, 645 (1994).
  22. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414, 105 (2001).
  23. Fuchs, E., Segre, J. A. Stem cells: a new lease on life. Cell. 100, 143 (2000).
  24. Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157 (2000).
  25. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707 (1992).
  26. Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes. J. Neurosci. 12, 4565 (1992).
  27. Hulett, H. R., Bonner, W. A., Barrett, J., Herzenberg, L. A. Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence. Science. 166, 747 (1969).
  28. Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495 (1975).
  29. Barrett, L. E. Self-renewal does not predict tumor growth potential in mouse models of high-grade glioma. Cancer Cell. 21, 11 (2012).
  30. Venugopal, C. Bmi1 marks intermediate precursors during differentiation of human brain tumor initiating cells. Stem Cell Res. 8, 141 (2012).
  31. Gerlinger, M. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883 (2012).
  32. Gilbertson, R. J. Medulloblastoma: signalling a change in treatment. Lancet. Oncol. 5, 209 (2004).
  33. Zhu, Y., Parada, L. F. The molecular and genetic basis of neurological tumours. Nat. Rev. Cancer. 2, 616 (2002).
  34. Maher, E. A. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15, 1311 (2001).
  35. Blake, W. J., KAErn, M., Cantor, C. R., Collins, J. J. Noise in eukaryotic gene expression. Nature. 422, 633 (2003).
  36. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297, 1183 (2002).
  37. Maheshri, N., O'Shea, E. K. Living with noisy genes: how cells function reliably with inherent variability in gene expression. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 413 (2007).
  38. Raj, A. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4, e309 (2006).
  39. Ross, I. L., Browne, C. M., Hume, D. A. Transcription of individual genes in eukaryotic cells occurs randomly and infrequently. Immunol. Cell Biol. 72, 177 (1994).
  40. Kubista, M. The real-time polymerase chain reaction. Mol. Aspects Med. 27, 95 (2006).
  41. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat. Protoc. 1, 1559 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics