Behandling av primär hjärntumör Mjukpapper för analyser stamceller och Flow Sortering

Published 9/25/2012
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Identifieringen av initierande hjärnan tumörceller (BTICs), sällsynta celler i en heterogen tumör som har egenskaper stamceller, ger nya insikter i människans hjärntumör patogenes. Vi har förfinat speciella odlingsbetingelser att anrika BTICs och vi rutinmässigt använder flödescytometri för att ytterligare berika dessa populationer. Självförnyelse analyser och transkript analys med en enda cell RT-PCR kan sedan utföras på dessa isolerade celler.

Cite this Article

Copy Citation

Venugopal, C., McFarlane, N. M., Nolte, S., Manoranjan, B., Singh, S. K. Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting. J. Vis. Exp. (67), e4111, doi:10.3791/4111 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hjärntumörer består typiskt av morfologiskt olika celler som uttrycker en mängd av neurala lineage markörer. Endast en relativt liten fraktion av celler i tumören med egenskaper stamceller, benämnda hjärntumör initierande celler (BTICs), uppvisar en förmåga att differentiera längs flera linjer, själv förnya, och initiera tumörer in vivo. Vi tillämpat odlingsbetingelser som ursprungligen användes för normala neurala stamceller (NSC) till en mängd av humana hjärntumörer och fann att denna kultur metod specifikt selekterar för stam-liknande populationer. Serumfritt medium (NSC) medger upprätthållande av en odifferentierad stamceller tillstånd, och tillsatsen av bFGF och EGF möjliggör spridningen av flera potenta, självförnyande, och expanderbara tumorspheres.

För att ytterligare karaktärisera varje tumör är BTIC befolkning, utvärderar vi cellytmarkörer med flödescytometri. Vi kan också sortera bestånd av intresse för mer specifika characterization. Självförnyelse analyser utförs på enstaka BTICs sorterade i 96 brunnsplattor, bildandet av tumorspheres efter inkubering vid 37 ° C indikerar närvaron av en stam eller progenitorcell. Flera cellantal av en viss population kan också sorteras i olika brunnar för begränsande utspädning analys, för att analysera självförnyelse kapacitet. Vi kan också studera uttryck differentiell gen inom en viss cellpopulation med en enda cell RT-PCR.

Följande protokoll beskriver våra rutiner för dissociation och odling av primära humana prover att anrika BTIC populationer, samt dissociation av tumorspheres. Dessutom ingår protokoll för färgning för flödescytometrianalys eller sortering, självförnyelse analyser, och enda cell RT-PCR.

Introduction

Hjärntumörer är bland de mest aggressiva och heterogena cancer kända människor. Även om deras tidigare upptäckt och diagnos har underlättats av moderna neuro-bildteknik saknar vi fortfarande botande behandlingar för många hjärntumörer, särskilt för diffusa, invasiva kära eller de ligger djupt i hjärnan.

Hjärntumörer representerar ledande orsaken till dödlighet i cancer hos barn på grund av deras mycket aggressiv och ofta obotlig natur. Glioblastom (GBM), den vanligaste primära hjärntumör hos vuxna, är en av de mest aggressiva humana cancrar, fruktade för sin likformigt dödlig prognos 1. Denna mycket maligna astrocytisk tumör (WHO grad 4) sker oftast i hjärnhalvorna hos vuxna, och kan även förekomma hos små barn och spädbarn. Dess tillväxt är snabb och infiltrativ och diagnostiska patologiska funktioner inkluderar kärnkraft pleomorfism, mikrovaskulära proliferation och nekros 2,3. För Adults med nyligen diagnostiserad GBM, sträcker medianöverlevnad sällan längre än 12 månader 1, med generellt dåliga svar på alla terapeutiska modaliteter. Vi noterade att det finns många funktionella och genetiska likheter som delas av somatiska stamceller och cancerceller, och att de molekylära vägar som reglerar hjärnans normala utveckling ofta oreglerad i cancer. Vid tillämpningen stamceller paradigm cellbiologiska till studiet av hjärntumörer, vi var de första forskarna att prospektivt identifiera och rena en subpopulation av celler från mänskliga GBMS som uppvisade egenskaper stamceller hos spridning, självförnyelse och differentiering in vitro 4 och in vivo 5. Vi tillämpat odlingsbetingelser och analyser som ursprungligen användes för att karakterisera normala neurala stamceller (NSCs) in vitro 6,7 till flera barn och vuxna hjärntumörer, och anrikas för dessa stam-liknande celler genom cellsortering för den neurala progenitorceller ytmarkör CD133 8 ,9. Den CD133 + hjärntumör fraktionen innehöll celler som hade en mycket högre frekvens av tumörinitiering än CD133-fraktionen i NOD-SCID mushjärnor 5,10. Detta inrättades formellt att endast en sällsynt delmängd av celler hjärntumör med egenskaper stamceller är tumör-initiera, tjäna dem namnet "hjärntumör inledande celler" eller "BTICs". Den nya identifieringen av BTICs ger nya insikter i människans hjärna tumörbildning, vilket ger ett starkt stöd för cancer stamceller hypotes 10-13 som grund för många solida tumörer, och upprättar en ny cellulär mål för effektivare cancerbehandlingar 14-20. Behandlingar som fokuserar på att döda merparten av tumören kan missa den sällsynta stam-liknande fraktion, vilket gör att tumören att fortsätta växa. Behandlingar som fokuserar på att döda cell cancer stammen kan ge bättre behandling och prognos för patienter med hjärntumörer.

För att studera BTIC befolkningar har vi förfinat vår kulture protokoll att specifikt välja för cellpopulationer inom humana hjärntumörer som har egenskaper stamceller. Serumfritt, neural stamcell (NSC)-medium medger upprätthållandet av en odifferentierad stamceller tillstånd, och tillsats av basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF), epidermal tillväxtfaktor (EGF), och leukemi inhiberande faktor (LIF) medger spridningen av flera potenta, självförnyande och expanderbara mänskliga tumorspheres. Här beskriver vi de metoder i samband med behandling av primära hjärntumörer och odling dem i NSC medium för anrika BTIC populationer. Vi har kallat vårt experimentella modellsystem "BTIC patienten isolat" för att betona det faktum att dessa celler endast minimalt odlades under stam cell villkor att välja för populationer stamceller. Efterföljande inmärkning av BTIC populationer för viktiga markörer stamceller som CD133 och CD15 och flödescytometrianalys beskrivs också. Vi diskuterar då den begränsande utspädningsanalys,som stöd i att studera självförnyelse potential BTICs. Slutligen, vi utforskar analys genuttrycket av dessa sällsynta celler genom sortering enstaka celler på AmpliGrid objektglas och utföra enda cell RT-PCR. Dessa tekniker är också tillämpliga på andra hjärntumörer som medulloblastom, ependymom och barn gliom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kultur av hjärntumör Tissue

  1. Tillsätt 200 | il upptinade Liberase (Roche Applied Science) till 15 ml artificiell CSF (aCSF-se tabell 1) och placera i 37 ° C vattenbad. Liberase TM är en blandning av proteolytiska enzymer som används för att skilja primära vävnadsprover, samt odlade tumorspheres. Till skillnad trypsin-EDTA, bevarar Liberase metoden CD133 ytantigen. För ett vävnadsprov av ca 0,5 cm 3, använder vi 200 pl Liberase. Om vävnaden är mindre, använder vi 100 ul.
  2. Ta ammoniumkloridlösning (stamcell teknik) till rumstemperatur. Ammoniumkloridlösning lyserar försiktigt röda blodkroppar med minimal effekt på andra celler. Den innehåller inte ett fixativ.
  3. I steril biologiskt säkerhetsskåp, tillsätt 5 ml aCSF till provbehållare, snurra för att skölja vävnad, sedan pipettera bort. Detta steg hjälper till att avlägsna röda blodkroppar (RBC).
  4. Överför vävnad hjärntumör till en steril 100 mm Petri dish.
  5. Med fina sax eller skalpell och pincett, dela upp vävnad till slam konsistens.
  6. Samla prov med hjälp av en 10 ml vanlig pipett eller pincett och fragment överföring till röret med förvärmd aCSF med Liberase.
  7. Placera på inkubator-skakapparat (30 rpm) och inställd på 37 ° C, under 15 minuter.
  8. Filtrera vävnaden lysatet genom 70 im cellfilter i en 50 ml Falcon-rör.
  9. Centrifugera filtratet ned vid 280 x g under 5 min.
  10. Avlägsna supernatanten försiktigt och utvärdera storlek och färg av den resulterande cellpelleten: pellets som är rosa eller röd indikerar ökande antal röda blodkroppar.
  11. Återsuspendera pelleten i 1 ml PBS.
  12. Lägg en lämplig mängd ammoniumkloridlösning (4-12 ml) baserat på pellets storlek och röda blodkroppar kontamination (ammoniumkloridlösningen är mycket mild och ökade mängder inte är skadliga för andra celler än röda blodkroppar).
  13. Inkubera vid rumstemperatur under 5 min.
  14. Spin cellerner vid 280 x g under 5 min.
  15. Tvätta en gång med 10 ml steril PBS.
  16. Återsuspendera i 5 ml NSC komplett medium (tabell 2) och överföring till en ultra-låg bindning 60 mm vävnadsodlingsplatta (Corning). Vi använder mycket låga bindning odlingsplattor med kovalent bundna hydrogel ytor som är hydrofila och neutralt laddade för att minimera cellvidhäftning-medierad differentiering.

För de första dagarna i kultur, inte ändra media: påfyllning endast med 1-2 ml media som behövs, sedan fortsätta att observera kultur och förändring media när färgen på mediet blir svagt gul.

2. Tumorsphere dissociation för flödescytometri

  1. Utvärdera tumorspheres under mikroskop: om sfären storlek är> 100 um, är dissociation rekommenderas som större sfärer kan bli nekrotisk i centrum.
  2. Överför kultur till 15 ml koniska rör.
  3. Tillsätt 2-3 ml steril PBS att skölja plåten ordentligt och lägga till koniskt rör.
  4. Centrifugera vid 280 x g under 5 min.
  5. Avlägsna supernatanten och återsuspendera i 1 - 2 ml steril PBS.
  6. Tillsätt 10 | il Liberase.
  7. Inkubera i 37 ° C vattenbad under 3 minuter. Ta bort och visuellt bedöma fjädring, om flera klumpar sett, triturera försiktigt med hjälp av en 1.000 ul pipettspets.
  8. Om klumpar kvarstår fortsätter inkubation under ytterligare 1-2 minuter.
  9. Tvätta cellerna genom tillsats av 5 ml steril PBS och centrifugering vid 280 xg under 5 minuter.
  10. Avlägsna supernatanten och återsuspendera i 500-1000 ul sterilt PBS två mM EDTA.
  11. Utvärdera cellantal och livsduglighet med trypanblått.
  12. Justera celltal till 1 miljon / ml i PBS 2 mM EDTA.

3. Ytfärgning

  1. Överför 100 pl 1x10 6 / ml cellsuspension per test 12x75 mm flöde.
  2. Tillsätt lämplig mängd antikroppar. Matchade isotyp kontroller ska användas för varjeantikropp (se tabell 3).
  3. Inkubera 30 min på is.
  4. Tillsätt 2 ml PBS +2 mm EDTA till varje flödesröret.
  5. Centrifugera vid 200 x g under 4 minuter, dekantera och torka.
  6. Återsuspendera pelleten i 300 pl PBS +2 mm EDTA.
  7. Tillsätt 10 | il 7AAD bärkraft färgämne till varje rör och inkubera under åtminstone 15 min på is.
  8. Analysera med flödescytometri.

4. Flödescytometri och analys

Detaljerna i insamling och analys av flödesdata är instrumentet-beroende. Representativa negativa prover körs och instrumentinställningar fastställts för Forward (storlek) och sida (granularitet) scatter. Denna scatter mönster ger slutanvändaren att visa alla celler i provet, inklusive skräp. En region är vanligtvis dras runt cellerna av intresse. (Figur 4a) Inställningarna sedan upprättas för alla fluorescens detektorer som krävs för att placera de negativa celler i det första årtiondet av afluorescence intensitet tomt. När mer än en färg eller fluorokrom används måste enskilda färgade kontroller köras för att fastställa färgvärden ersättning (subtraktion av störande fluorescensemissioner). När man kör levande celler, en viabilitet färgämne såsom 7-AAD (7-amino-aktinomycin D - excitations 488/emission 655) används och en andra region dragen att utesluta döda celler (Figur 4b). Båda dessa regioner tillämpas på någon ytterligare analys av proverna.

5. Självförnyelse analys

Den viktigaste analys som i hög grad underlättas genom klonal sfär tillväxt in vitro test av självfömyande kapacitet, den begränsande utspädning analysen. Tumorspheres är dissocierade och distribueras utspädningar ned till en enda cell per brunn, och graden av efterföljande sfär bildas under 7 dagar i odling beräknas. På dag 7, är procentandelen av brunnarna som inte innehåller sfärer för varje cell plätering densitet (F 0) beräknades och plottadesmot antalet celler per brunn (x). Antalet celler som krävs för att bilda åtminstone en tumorsphere i varje brunn bestäms ur den punkt vid vilken linjen korsar 0,37 nivå (F 0 = e-x). I en Poisson-fördelning av celler, F 0 = 0,37 motsvarar den utspädning av en cell per brunn, så att denna beräkning (det 37% skär) återspeglar ofta klonogena stamceller i hela cellpopulationen (Figur 5).

6. Encelliga RT-PCR

Enstaka celler från olika populationer är sorterade efter Beckman Coulter MoFlo XDP på ​​reaktionsställen på en AmpliGrid bild (Beckman Coulter cat # AG480F). Encelliga RT-PCR utförs med AmpliGrid Singel One Step RT-PCR-system (Beckman Coulter cat # OAX04515) enligt tillverkarens specifikationer. Kortfattat är en enda cell deponeras i varje reaktionsställe för en AmpliGrid slid, närvaron av en enda cell i varjereaktionsställe bekräftades genom mikroskopi. Omvänd transkription (RT) utförs omedelbart efter sortering för att förhindra provet från att äventyras. RT huvudblandning är beredda färska, enligt kit instruktioner (tabell 4). Vi använde 0,03 pl 25 pM slumpmässiga primrar (Promega) per reaktion, 1 | il av huvudblandning sättes till mitten av varje reaktionsställe. Detta är omedelbart beläggs med 5 pl tätande lösning (Beckman Coulter kat # OAX04503). Använda en AmpliSpeed ​​slid cykler (Beckman Coulter, cat # OAX04101), är objektglasen inkuberas vid 25 ° C under 10 min, 42 ° C under 10 minuter, och 55 ° C under 45 minuter. Efter omvänd transkription, 3 pl DNas / RNas-fritt vatten till varje reaktionsställe, och hela blandningen överfördes till en PCR-rör (1 rör / ställe). I en PCR-platta, är en reaktionsvolym av 10 | il används för kvantitativ PCR: 8 pl qPCR huvudblandning (5 pl SYBR Green (Quanta), 1 pl vatten, 1 pl av 10 pM framåt och omvänd primer mix) plus 2 &mu, l RT blandningen. För realtid kvantifiering, prover körs på en BioRad cycler med följande program: 95 ° C under 10 minuter, 45 cykler av 95 ° C under 30 sekunder, 60 ° C under 60 sekunder, 72 ° C under 60 sekunder, följt av 10 min vid 72 ° C och smältkurva analys. Ct-värdena bestämdes med användning Opticon monitor 3 (BioRad). Tre gener kan bedömas per cell, inklusive GAPDH som en hushållning gen. Genuttryck normaliseras till GAPDH uttryck, enligt 2-ACt. Åtminstone ett dussin enskilda celler av samma population från samma sort kan användas som biologiskt replikat för att kompensera för brist på teknisk replikat.

7. Representativa resultat

Figur 1 visar en magnetisk resonanstomografi (MRT) avsökning av en representativ patient med en GBM. Brain tumörprover erhålls från samtyckande patienter omedelbart efter operationen, som godkänts av Hamilton Health Sciences / McMaster Hälsa Sciences Research etikprövningsnämnd. En del av varje prov ges till neuropatologen för rutinmässig klinisk diagnos. Det återstående provet bearbetas, såsom visas i figur 2. Tumörcellerna, en gång ströks i fullständiga neurala stamcellsmedier med tillväxtfaktorer, tumorspheres form som visas i figur 3.

Tumörcellerna märks med neurala cellytan stamceller markörer CD133 och CD15 och analyserades med flödescytometri, såsom visas i figur 4.

Enstaka celler från olika populationer för t.ex. CD15 + / CD133 +, CD15 + / CD133-, CD15-/CD133 +, CD15-/CD133- sedan sorteras i 96 brunnar (Figur 5a) eller i AmpliGrid bilder (Figur 6a).

I 96 brunnar, kan enskilda celler som uppvisar självfömyande kapacitet (t.ex. CD133 + celler), (figur 5b), bildar tumorspheres (figur 5c) efter incubation. En själv-förnyelse graf kan plottas (figur 5d) genom att räkna antalet sfärer som bildas per brunn. Enstaka celler sorterades in reaktionsstället för Ampligrid sliden (figur 6a). De RNA extraherat från enstaka celler kan omvänt transkriberas med Advalytix AmpliSpeed ​​(figur 6b). Den cDNA som erhållits användes för att utföra realtid RT-PCR (figur 6c).

Figur 1
Figur 1. Magnetisk resonanstomografi bild (MRT) av en patient GBM. MRT av hjärnan av en 16-årig flicka med en månad lång historia av huvudvärk och en veckas historia av kräkningar, slöhet och dimsyn. Axiell FLAIR-sekvens visar en stor bi-hemisfärisk ("butterfly") GBM.

Figur 2
Figur 2. Hjärntumör behandling. Hjärntumör prover obtaINED från samtyckande patienter omedelbart efter operationen. De är mekaniskt dissocieras såsom visas (a) och är därefter enzymatiskt dissocieras i aCSF med Liberase genom inkubering i en 30 rpm vaggande inkubator vid 37 ° C under 15 minuter (b).

Figur 3
Figur 3. BTIC populationer bildar tumorspheres i kultur. Dissocierade hjärntumör celler ut i fullständiga neurala stamcellsmedier med tillväxtfaktorer bildar tumorspheres.

Figur 4
Figur 4. Flödescytometrisk analys av BTIC populationer. (A) framåt mot egenskaper sidospridning ger en bild av alla celler, inklusive skräp (b) Celler som färgas med viabiliteten färgämnet 7-AAD exkluderas från analysen. (C) läget för de statistiska kvadranterna bestäms med hjälp av lämpliga isotyp kontroller (d) Tumörceller färgades med ytan markers CD15-PE och CD133-APC. (D) Moflo XDP cellsorterare. Klicka här för att se större bild .

Figur 5
Figur 5. Begränsande utspädning analys av BTICs avslöjar deras självförnyelse kapacitet. (A) Celler med olika spädningar sorteras i 96 brunnar innehållande 200 ul NSC till (b) en enda cell per brunn. (C) Efter en 7 dagars inkubationstid, är en tumorsphere bildas. Morfologi sekundära tumorspheres är identisk med den primära tumorspheres. (D) Den genomsnittliga x-skärningspunkten kan beräknas från begränsande utspädning analys för varje tumör subtyp att avslöja antalet celler som krävs för att bilda åtminstone en tumorsphere per brunn.

Figur 6
Figur 6. Genuttrycksanalys av en enda BTIC cellär möjligt med en enda cell RT-PCR-teknik. (a) Enstaka celler från en BTIC population kan sorteras på AmpliGrid bilder. (B) cDNA-syntes utförs på enstaka celler på AmpliGrid bilder med hjälp av Advalytix AmpliSpeed. (C) Kvantitativ realtids-PCR utförs på cDNA syntetiserat från enstaka BTIC celler.

2M NaCl 62 ml
1M KCl 5 ml
1M MgCl 2 3,2 ml
155 mM NaHCOa 3 169 ml
1M Glukos 10 ml
108 mM CaClj 2 0,9256 ml
Purelab Ultra H 2 0 749,84 ml

Tabell 1 artificiell cerebrospinalvätska (aCSF) -. 1.000 ml.

Stock basmedier 500 ml
01:01 DMEM: F12 480 ml
N2 tillägg 5 ml
1M HEPES 5 ml
Glukos 3,0 g
N-acetylcystein (60 pg / ml) 1 ml
Neural överlevnad faktor-1 (NSF-1) 10 ml

Tabell 2. Neurala stamceller medier.

NSC komplett media (färskt före användning):
NSC basmedier + 20 ng / ml EGF (epidermal tillväxtfaktor) + 20 ng / ml bFGF (basisk fibroblasttillväxtfaktor) + 10 ng / ml LIF (leukemiinhiberande faktor) * + 10 ul / ml antibiotikum-antimykotikum

* Leukemi faktor (LIF): Denna reagens från Millipore innehåller en interleukin 6 klass cytokin, ett protein som undertrycker spontan differentiering av stamceller som främjar långsiktiga underhåll av kulturer stamceller.

Antikroppar Leverantör / CAT # il / prov (i 100 pl)
CD133 / 2 APC (293C3) Miltenyi Biotec/130-090-854 5
IgG2b APC (isotypkontroll) Miltenyi Biotec/130-092-217 5
CD15PE Beckman Coulter/IM1954U 5
IgG2a PE (isotypkontroll) Beckman Coulter/A09141 5
7AAD Beckman Coulter/A07704 10

Tabell 3. Flow antikroppar.

Komponent Volym (1 reaktion) Volym (48 reaktion)
2x Single Cell RT reaktionsbuffert 0,50 pl 30,0 ul
RNas-inhibitor (10 U / ^ il) 0,02 pl 1,2 pl
5X Single Cell RT förstärkare 0,15 pl 9,00 pl
Single Cell RT enzymblandning 0,04 pl 2,4 pl
Advablue (OAX04227) 0,1 pl 6,00 pl
Nukleasfritt vatten upp till 1 pl göra upp till 60 ul

Tabell 4. Sammansättning av RT Master Mix för Single Cell RTPCR (katt # OAX04515).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cancern stamceller hypotes 10, baserat på arbete i leukemi 21, bröstcancer 11 och hjärncancer 4,5, antyder att endast en relativt liten fraktion av celler i tumören, benämnda cancer stamceller, har en förmåga att föröka omfattande och själv -förnya. De flesta av tumörcellerna förlorar förmågan att föröka sig och själv förnya när de differentierar till celler som blir den fenotypiska signatur av tumören. Att hitta de viktigaste cellerna i hjärnan tumören befolkningen som är i stånd att upprätthålla tumören kommer att ge insikt i mekanismen för hjärnans tumorgenes och ger oss möjlighet att spåra tillbaka till cellen ursprung.

Stamceller är funktionellt definierad som självförnyande celler som uppvisar flera härstamning differentiering 22-24. Primär hjärntumör vävnad odlas under odlingsbetingelser som gynnar tillväxten stamceller, som tidigare fastställts för isolering av neurala stamceller som tumorspheres 6,26. Oavsett patologisk subtyp inom 24 till 48 timmar primär kultur, de flesta hjärntumörer ger en minoritet av celler som uppvisar tillväxt i klonalt härledda neurosfären-liknande kluster, eller tumorspheres. Därför kan vi anrika BTIC populationer från patientens vävnader hjärntumör.

Tillkomsten av flera parametrar aktiverad fluorescerande cellsortering 27 och monoklonal antikroppsteknologi 28 har möjliggjort rening av cancer stamceller baserat på cellytemarkörer. Genom att använda markörer stamceller som CD133 och CD15, har vi kunnat framåtriktat sortera efter specifika stamceller-liknande populationer och att studera deras självförnyelse kapacitet genom att utföra begränsande utspädning analyser. En caveaton självförnyelse analyser infördes genom en nyligen genomförd studie visar att in vitro-självförnyelse inte alltid korrelerar med tumörbildning i musmodeller 29. Men vår senaste arbete har visat att in vitro självförnyelse analyser inte korrelerar med patientens överlevnad, vilket gör dessa analyser värdefulla för den pågående studien av BTIC biologi 30.

Arbeta med primär mänsklig vävnad innebär många tekniska utmaningar. Vävnadsbehandling bör utföras mycket försiktigt för att bevara livskraften i isolerade celler. Mängden Liberase används och inkubationstid är kritisk. Flöde sortering av celler kan optimeras för att öka efter sortera livsduglighet genom att använda olika munstycken och tryck. Vi finner att våra celler föredrar att sorteras genom ett 100 | munstycke vid 30 psi slida tryck. Sortering på Ampligrid ställen slide reaktiva kan vara något svårt: det är viktigt att bekräfta närvaron av den deponerade cellen genom mikroskopi.

31. Hjärntumörer består typiskt av morfologiskt olika celler som uttrycker en mängd av neurala lineage markörer. Studie av hjärntumörer genom traditionell histopatologi har bara gett en begränsad mängd kunskap om kliniska beteendet av tumören. Även stora framsteg har gjorts i förståelsen av de molekylära genetiska förändringar av vissa hjärntumörer 3,32-34, särskilt medulloblastomas och maligna gliom, och några av dessa identifierade förändringar nu börjar styra behandling, är det inte klart om alla tumör celler är likvärdiga i sin förmåga att upprätthålla tumörtillväxt. Analys av viktiga gener involverade i signalvägar i populationer hjärntumör är avgörande för att främja vår förståelse av avvikande mekanismer som leder till hjärnan tumörbildning. Även i en till synes homogentnous vävnad, celler visar sig vara unik i deras potentiella förmåga. Analys av transkript och protein expressionsnivåer i enstaka celler avslöjar att det finns en stor cell-cell-variation både i vilotillstånd och när de utsätts för stimuli 35-39. Därför kommer analysera hela populationen av celler inte avslöja hur en enda cell. QRT-PCR anses vara den gyllene standarden för mRNA-kvantifiering 40-41. I denna studie visar vi blivande sortering av enskilda celler från olika populationer i AmpliGrid bilder. Använda enda cell RT-PCR, kan vi utföra analyser genuttryck på en enda cell från en heterogen population, vilket utvärderar den biologiska betydelsen av en vald cell i en blandad population.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgements

Detta arbete har finansierats av Ontario Institute of Cancer Research (OICR), Terry Fox Foundation och American Association of Neurological Surgeons.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1:1 DMEM:F12 Invitrogen 11320-082
N2 supplement Invitrogen 17502-048
1M HEPES Wisent Inc. 330-050-EL
Glucose Invitrogen 15023-021
N-acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165-25g
Neural survival factor -1 (NSF-1) Lonza Clonetics CC-4323
Epidermal growth factor (EGF) Sigma-Aldrich E9644
Basic fibroblast growth factor (bFGF) Invitrogen PHG0261
Leukemia inhibitory factor (LIF) EMD Millipore LIF1010
Antibiotic/mycotic Wisent Inc. 450-115-EL
Liberase TM Roche Group 05 401 119 001
Ammonium chloride solution Stem Cell Technologies 07850

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ohgaki, H., Kleihues, P. Epidemiology and etiology of gliomas. Acta Neuropathol. 109, 93 (2005).
  2. Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma. 10, 319 (2010).
  3. Wechsler-Reya, R., Scott, M. P. The developmental biology of brain tumors. Annu. Rev. Neurosci. 24, 385 (2001).
  4. Singh, S. K. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Res. 63, 5821 (2003).
  5. Singh, S. K. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396 (2004).
  6. Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev. Biol. 175, 1 (1996).
  7. Tropepe, V. Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev. Biol. 208, 166 (1999).
  8. Yin, A. H. AC133, a novel marker for human hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 90, 5002 (1997).
  9. Yu, Y., Flint, A., Dvorin, E. L., Bischoff, J. AC133-2, a novel isoform of human AC133 stem cell antigen. J. Biol. Chem. 277, 20711 (2002).
  10. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414, 105 (2001).
  11. Al-Hajj, M. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 3983 (2003).
  12. Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat. Med. 3, 730 (1997).
  13. Matsui, W. Characterization of clonogenic multiple myeloma cells. Blood. 103, 2332 (2004).
  14. Bao, S. Targeting cancer stem cells through L1CAM suppresses glioma growth. Cancer Res. 68, 6043 (2008).
  15. Bao, S. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444, 756 (2006).
  16. Bao, S. Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor. Cancer Res. 66, 7843 (2006).
  17. Beier, D. Temozolomide preferentially depletes cancer stem cells in glioblastoma. Cancer Res. 68, 5706 (2008).
  18. Piccirillo, S. G. Distinct pools of cancer stem-like cells coexist within human glioblastomas and display different tumorigenicity and independent genomic evolution. Oncogene. 28, 1807 (2009).
  19. Piccirillo, S. G. morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature. 444, 761 (2006).
  20. Rich, J. N., Bao, S. Chemotherapy and cancer stem cells. Cell Stem Cell. 1, 353 (2007).
  21. Lapidot, T. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367, 645 (1994).
  22. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414, 105 (2001).
  23. Fuchs, E., Segre, J. A. Stem cells: a new lease on life. Cell. 100, 143 (2000).
  24. Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157 (2000).
  25. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707 (1992).
  26. Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes. J. Neurosci. 12, 4565 (1992).
  27. Hulett, H. R., Bonner, W. A., Barrett, J., Herzenberg, L. A. Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence. Science. 166, 747 (1969).
  28. Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495 (1975).
  29. Barrett, L. E. Self-renewal does not predict tumor growth potential in mouse models of high-grade glioma. Cancer Cell. 21, 11 (2012).
  30. Venugopal, C. Bmi1 marks intermediate precursors during differentiation of human brain tumor initiating cells. Stem Cell Res. 8, 141 (2012).
  31. Gerlinger, M. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883 (2012).
  32. Gilbertson, R. J. Medulloblastoma: signalling a change in treatment. Lancet. Oncol. 5, 209 (2004).
  33. Zhu, Y., Parada, L. F. The molecular and genetic basis of neurological tumours. Nat. Rev. Cancer. 2, 616 (2002).
  34. Maher, E. A. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15, 1311 (2001).
  35. Blake, W. J., KAErn, M., Cantor, C. R., Collins, J. J. Noise in eukaryotic gene expression. Nature. 422, 633 (2003).
  36. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297, 1183 (2002).
  37. Maheshri, N., O'Shea, E. K. Living with noisy genes: how cells function reliably with inherent variability in gene expression. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 413 (2007).
  38. Raj, A. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4, e309 (2006).
  39. Ross, I. L., Browne, C. M., Hume, D. A. Transcription of individual genes in eukaryotic cells occurs randomly and infrequently. Immunol. Cell Biol. 72, 177 (1994).
  40. Kubista, M. The real-time polymerase chain reaction. Mol. Aspects Med. 27, 95 (2006).
  41. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat. Protoc. 1, 1559 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats