Lavorazione dei tessuti primaria tumore al cervello per saggi su cellule staminali e flusso di Ordinamento

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Summary

L'identificazione delle cellule tumorali del cervello avvio (BTICs), le cellule rare all'interno di una proprietà eterogenee di cellule staminali tumorali che possiedono, fornisce nuove intuizioni patogenesi umana tumore al cervello. Abbiamo affinato specifiche condizioni di coltura per arricchire per BTICs, e noi abitualmente uso citometria a flusso per arricchire ulteriormente queste popolazioni. Autorinnovamento saggi e analisi trascritto di singola cellula RT-PCR può successivamente essere eseguita su queste cellule isolate.

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Venugopal, C., McFarlane, N. M., Nolte, S., Manoranjan, B., Singh, S. K. Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting. J. Vis. Exp. (67), e4111, doi:10.3791/4111 (2012).

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Abstract

Tumori cerebrali sono in genere costituito da cellule morfologicamente diverse che esprimono una varietà di marcatori neurali lignaggio. Solo una frazione relativamente piccola di cellule nel tumore con proprietà staminali, chiamate cellule tumorali cerebrali avvio (BTICs), possiedono una capacità di differenziare lungo linee multiple, auto-rinnovano, e avviare tumori in vivo. Abbiamo applicato condizioni di coltura in origine usati per le normali cellule staminali neurali (NSC) a una varietà di tumori del cervello umano e ha scoperto che questo metodo cultura seleziona appositamente per stelo tipo popolazioni. Terreno privo di siero (NSC) consente il mantenimento di uno stato indifferenziato di cellule staminali, e l'aggiunta di EGF e bFGF permette la proliferazione di multi-potente, auto-rinnovano, e tumorspheres espandibili.

Per caratterizzare ulteriormente popolazione BTIC ciascun tumore, valutiamo marcatori di superficie cellulare mediante citometria a flusso. Possiamo anche ordinare le popolazioni di interesse per caratteriz più specifichezione. Autorinnovamento saggi vengono eseguiti su singole BTICs filtrate in piastre a 96 pozzetti, la formazione di tumorspheres dopo l'incubazione a 37 ° C indica la presenza di uno stelo o di cellule staminali. Il numero di cellule multiple di una particolare popolazione può anche essere ordinati in diversi pozzetti per limitare l'analisi di diluizione, per analizzare la capacità di auto-rinnovamento. Possiamo anche studiare l'espressione genica differenziale all'interno di una popolazione cellulare particolare utilizzando singola cella RT-PCR.

I protocolli seguenti descrivono le procedure per la dissociazione e la coltura di campioni umani primari per arricchire per popolazioni BTIC, così come la dissociazione di tumorspheres. Sono inclusi anche i protocolli per la colorazione per citometria a flusso o smistamento, self-renewal saggi, e singola cellula RT-PCR.

Introduction

I tumori cerebrali sono tra i tumori più aggressivi ed eterogenei conosciute negli esseri umani. Anche se la loro diagnosi precoce e la diagnosi sono state facilitate dalla moderna neuro-tecnologia di imaging, ci manca ancora terapie curative per i tumori cerebrali, in particolare per quelli invasivi diffuse, o quelle situate in profondità nel cervello.

I tumori cerebrali rappresentano la principale causa di mortalità per cancro nei bambini a causa della loro natura altamente aggressiva e spesso incurabile. Glioblastoma (GBM), il più comune tumore cerebrale primario negli adulti, è uno dei tumori più aggressivi umani, temeva per la sua prognosi uniformemente fatale 1. Questo tumore altamente maligno astrocitari (di grado 4) di solito si verifica negli emisferi cerebrali degli adulti, e può verificarsi anche nei bambini piccoli e neonati. La sua crescita è rapida e infiltrante, e diagnostici caratteristiche patologiche includono pleomorfismo nucleare, la proliferazione microvascolare e necrosi 2,3. Per adults con GBM di recente diagnosi, la sopravvivenza mediana va raramente oltre 12 mesi 1, con le risposte in genere poveri a tutte le modalità terapeutiche. Abbiamo notato che ci sono molte somiglianze funzionali e genetici condivisi da cellule staminali somatiche e cellule tumorali, e che le vie molecolari che regolano lo sviluppo normale del cervello sono spesso alterata nelle cancro. Nell'applicare staminali paradigmi biologia cellulare allo studio dei tumori cerebrali, siamo stati i primi ricercatori a identificare in modo prospettico e purificare una sottopopolazione di cellule di GBM umani che esibivano le proprietà delle cellule staminali di proliferazione, self-renewal e la differenziazione in vitro 4 e in vivo 5. Abbiamo applicato condizioni di coltura e saggi originariamente utilizzate per caratterizzare normali cellule staminali neurali (NSC) in vitro 6,7 a più tumori cerebrali pediatrici e adulti, e arricchito di questi-come le cellule staminali da cellule di ordinamento per la neurale marcatore di superficie delle cellule progenitrici CD133 8 ,9. Il CD133 + frazione di tumore al cervello conteneva cellule che hanno una frequenza molto più elevata di apertura del tumore rispetto al-CD133 frazione in NOD-SCID 5,10 topo cervello. Questo formalmente stabilito che solo un sottoinsieme rara di cellule cerebrali tumorali con caratteristiche di cellule staminali sono tumore avvio, guadagnandosi il nome di "tumore al cervello iniziare cellule" o "BTICs". L'identificazione romanzo di BTICs fornisce nuove intuizioni tumorigenesi cervello umano, dando un forte sostegno per l'ipotesi delle cellule staminali del cancro 10-13 come base per molti tumori solidi, e stabilisce un nuovo bersaglio cellulare per ulteriori terapie antitumorali efficaci 14-20. Terapie che si concentrano a uccidere la maggior parte del tumore può perdere la rara simil-staminali frazione, permettendo al tumore di continuare a crescere. Terapie che si concentrano a uccidere le cellule staminali tumorali possono fornire un migliore trattamento e la prognosi per i pazienti con tumori cerebrali.

Al fine di studiare le popolazioni BTIC, abbiamo affinato la nostra culture protocolli per selezionare specificamente per popolazioni di cellule all'interno di tumori cerebrali umani che possiedono proprietà delle cellule staminali. Privo di siero, cellule staminali neurali (NSC) medie consente il mantenimento di uno stato indifferenziato di cellule staminali, e l'aggiunta del fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF), fattore di crescita epidermico (EGF) e fattore inibitorio di leucemia (LIF) consente la proliferazione di multi-potenti, auto-rigenerante, e espandibili tumorspheres umani. Qui, descriviamo i metodi coinvolti nel trattamento dei tumori cerebrali primari e coltura in mezzo NSC per arricchire per le popolazioni BTIC. Abbiamo chiamato il nostro sistema modello sperimentale "isolati di pazienti BTIC" per sottolineare il fatto che queste cellule sono solo in minima parte coltivate in staminali condizioni delle celle alla selezione di popolazioni di cellule staminali. immunolabelling successiva delle popolazioni BTIC di indicatori chiave di cellule staminali, quali CD133 e CD15 e citometria analisi dei flussi è anche descritto. Discutiamo poi l'analisi di diluizione limitante,che aiuta nello studio del self-renewal potenziale di BTICs. Infine, abbiamo esplorare l'analisi di espressione genica delle cellule rare ordinando singole cellule su vetrini AmpliGrid ed eseguendo singola cella RT-PCR. Queste tecniche sono applicabili anche ad altri tumori cerebrali come il medulloblastoma, ependimoma e gliomi pediatrici.

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Protocol

1. Cultura del tessuto cerebrale Tumore

  1. Aggiungere 200 microlitri Liberase scongelato (Roche Applied Science) a 15 ml di liquido cerebrospinale artificiale (aCSF-vedi tabella 1) e riporre in bagno d'acqua a 37 ° C. Liberase TM è una miscela di enzimi proteolitici utilizzati per dissociare campioni di tessuto primari, così come tumorspheres coltura. Diversamente Tripsina-EDTA, il metodo Liberase conserva l'antigene di superficie CD133. Per un campione di tessuto di circa 0,5 cm 3, si usa 200 ml di Liberase. Se il tessuto è più piccolo, usiamo 100 ul.
  2. Portare soluzione di cloruro di ammonio (tecnologie di cellule staminali) a temperatura ambiente. Soluzione del cloruro di ammonio lisa delicatamente le cellule rosse del sangue, con effetto minimo sulle altre cellule. Non contiene un fissativo.
  3. In sterile cappa di sicurezza biologica, aggiungere 5 ml di aCSF al contenitore del campione, turbine a sciacquare il tessuto, quindi pipettare off. Questo passaggio aiuta a rimuovere globuli rossi (RBC).
  4. Trasferimento tumore al tessuto cerebrale a una sterile 100 millimetri di Petrish.
  5. Utilizzando forbici fini o bisturi e pinze, disaggregare tessuto di consistenza liquami.
  6. Raccogliere il campione con una pipetta 10 ml regolare o pinze e frammenti di trasferimento nella provetta contenente preriscaldata aCSF con Liberase.
  7. Posto su incubatore-agitatore (30 rpm) e impostare a 37 ° C, per 15 minuti.
  8. Filtrare il lisato tessuto filtro a 70 micron cella in una provetta da 50 ml Falcon.
  9. Centrifugare il filtrato fino a 280 xg per 5 min.
  10. Rimuovere il surnatante con attenzione e valutare le dimensioni e il colore del pellet cellulare risultante: pellet, che sono di colore rosa o rosso indicano un crescente numero di globuli rossi.
  11. Risospendere il pellet in 1 ml di PBS.
  12. Aggiungere una quantità appropriata di soluzione di cloruro di ammonio (4-12 ml) in base alle dimensioni di pellet e la contaminazione dei globuli rossi (soluzione di cloruro di ammonio è molto gentile e maggiori quantità non sono dannose per altre cellule dei globuli rossi).
  13. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
  14. Spin le cellulegiù a 280 xg per 5 min.
  15. Risciacquare una volta con 10 ml di PBS sterile.
  16. Risospendere in 5 ml di mezzo completo NSC (Tabella 2) e trasferimento ad un ultra-bassa attacco 60 piastra di coltura tissutale mm (Corning). Usiamo ultra-low piastre di coltura di legame con le superfici idrogel legati covalentemente che sono idrofili e carica neutra, per ridurre al minimo cellule attaccamento-mediata differenziazione.

Per i primi giorni in coltura, non cambiano i mezzi di comunicazione: top-up solo con 1-2 ml supporti in base alle esigenze, quindi continuare a osservare terreni di coltura e il cambiamento quando il colore dei media diventa leggermente gialla.

2. Tumorsphere dissociazione per citometria a flusso

  1. Valutare tumorspheres al microscopio: se la dimensione della sfera è> 100 micron, la dissociazione è raccomandato in quanto potrebbe diventare più grandi sfere necrotico al centro.
  2. Trasferimento cultura a 15 tubo ml.
  3. Aggiungere 2-3 ml sterile PBS di risciacquare a fondo piatto e aggiungere al tubo conico.
  4. Centrifugare a 280 xg per 5 min.
  5. Rimuovere il surnatante e risospendere in 1 - 2 ml PBS sterile.
  6. Aggiungere 10 microlitri Liberase.
  7. Incubare a 37 ° C bagno d'acqua per 3 minuti. Rimuovere e valutare visivamente la sospensione, se ciuffi più visto, triturare delicatamente con una punta di 1000 microlitri pipetta.
  8. Qualora invece ciò persiste, incubazione per altri 1-2 min.
  9. Lavare le cellule aggiungendo 5 ml di PBS sterile e centrifugazione a 280 xg per 5 min.
  10. Rimuovere il surnatante e risospendere in 500-1000 microlitri PBS sterile 2 mM EDTA.
  11. Valutare il numero e la vitalità cellulare con trypan blu.
  12. Regolare conteggio delle cellule a 1 milione / ml in PBS 2 mM EDTA.

3. Superficie di colorazione

  1. Trasferire 100 pl di sospensione di 1x10 6 cellule / ml in provette per test di flusso 12x75 mm.
  2. Aggiungere la quantità appropriata di anticorpi. Controlli Isotype trovati deve essere utilizzato per ciascunanticorpo (vedi Tabella 3).
  3. Incubare per 30 min in ghiaccio.
  4. Aggiungere 2 ml di PBS 2 mM EDTA a ciascun tubo di flusso.
  5. Centrifugare a 200 xg per 4 min, decantare e asciugare.
  6. Risospendere il pellet in 300 ml di PBS 2 mM EDTA.
  7. Aggiungere 10 microlitri colorante redditività 7AAD a ciascuna provetta e incubare per almeno 15 minuti in ghiaccio.
  8. Analizzare tramite citometria a flusso.

4. Flusso di acquisizione e analisi Citometria

Le specifiche di acquisizione e analisi dei dati di flusso sono strumento-dipendente. Rappresentativi campioni negativi sono gestiti e le impostazioni dello strumento istituito per Forward (dimensione) e laterale (granularità) dispersione. Questo modello di dispersione permette all'utente finale di visualizzare tutte le celle nel campione, compresi detriti. Una regione è generalmente disegnato intorno alle cellule di interesse. (Figura 4a) Le impostazioni vengono quindi stabiliti per tutti i rivelatori di fluorescenza necessarie per posizionare le cellule negative entro la prima decade di afintensità trama luorescence. Quando più di un colorante o fluorocromo è utilizzato, singoli controlli colorati deve essere eseguito per stabilire valori di compensazione del colore (sottrazione di interferire emissioni di fluorescenza). Quando si esegue cellule vive, un colorante vitalità come 7-AAD (7-Amino-actinomicina D - eccitazione 488/emission 655) viene utilizzata e una seconda regione disegnata per escludere cellule morte (Figura 4b). Entrambe queste regioni sono applicate a qualsiasi ulteriore analisi dei campioni.

5. Auto-rinnovamento Assay

Il dosaggio chiave che è molto facilitata dalla crescita clonale sfera è il test in vitro di auto-rinnovamento capacità, il saggio di diluizione limitante. Tumorspheres sono dissociati e distribuiti a diluizioni fino ad una singola cella per pozzetto, e il tasso di formazione sfera successiva più di 7 giorni di coltura viene calcolata. Il giorno 7, la percentuale di pozzetti non contenenti sfere per ciascuna densità di placcatura cella F (0) viene calcolato e tracciaticontro il numero di cellule per pozzetto (x). Il numero di cellule necessario per formare almeno una tumorsphere in ogni pozzetto è determinata dal punto in cui la linea attraversa il livello 0,37 (F = 0 e-x). In una distribuzione di Poisson di cellule, f 0 = 0,37 corrisponde alla diluizione di una cellula per pozzetto, in modo che questo calcolo (il 37% intersecano) riflette la frequenza di cellule staminali clonogeniche nella popolazione di cellula intera (Figura 5).

6. Single Cell RT-PCR

Cellule singole a partire da diverse popolazioni sono ordinati per Beckman Coulter MoFlo XDP su siti di reazione su un vetrino AmpliGrid (Beckman Coulter cat # AG480F). Singola cella di RT-PCR viene eseguita utilizzando AmpliGrid singola One Step RT-PCR sistema (Beckman Coulter cat # OAX04515) secondo le specifiche del produttore. Brevemente, una singola cellula è depositato in ogni sito di reazione di una diapositiva AmpliGrid, la presenza di una singola cella in ciascunsito di reazione confermata mediante microscopia. Trascrizione inversa (RT) viene effettuata immediatamente dopo la cernita per evitare che il campione venga compromessa. Il mix RT master è preparato fresco, secondo le istruzioni del kit (Tabella 4). Abbiamo usato 0,03 pl di 25 pM primer casuali (Promega) per reazione; 1 ml di miscela principale viene aggiunto al centro di ogni sito di reazione. Questo viene immediatamente rivestito con 5 ml di soluzione di sigillatura (Beckman Coulter cat # OAX04503). Utilizzando un AmpliSpeed ​​diapositiva cycler (Beckman Coulter, cat # OAX04101), vetrini vengono incubati a 25 ° C per 10 min, 42 ° C per 10 min, e 55 ° C per 45 min. Dopo trascrizione inversa, 3 ml di DNasi / RNasi-free acqua viene aggiunta ad ogni sito di reazione, e la miscela in una provetta da PCR (1 tubo / sito). In una piastra di PCR, un volume di reazione di 10 microlitri è utilizzato per la PCR quantitativa: 8 microlitri qPCR Master Mix (5 pl SYBR Green (Quanta), 1 microlitri di acqua, 1 ml di 10 pM avanti e mix primer reverse) più 2 &mu, l della miscela RT. Tempo reale quantificazione, i campioni vengono eseguiti in un cycler BioRad utilizzando il seguente programma: 95 ° C per 10 min, 45 cicli di 95 ° C per 30 sec, 60 ° C per 60 sec, 72 ° C per 60 sec, seguita da 10 min a 72 ° C e analisi della curva di fusione. Valori Ct sono stati determinati utilizzando Opticon Monitor 3 (BioRad). Tre geni possono essere valutati per cella, anche GAPDH come gene housekeeping. L'espressione genica è normalizzato espressione GAPDH, secondo 2-ACT. Almeno una dozzina di singole celle della stessa popolazione della stessa specie può essere usato come biologico replicati per compensare la mancanza di tecnica replicati.

7. Risultati rappresentativi

La figura 1 mostra una risonanza magnetica (MRI) di un paziente con un rappresentante GBM. Campioni tumorali cerebrali sono ottenuti da pazienti consenzienti subito dopo l'intervento chirurgico, come approvato dalla Hamilton Health Sciences / McMaster Salute Sciences ricerca Comitato Etico. Una parte di ciascun campione è dato al neuropathologist per la diagnosi clinica di routine. Il campione rimanente viene elaborato come mostrato in Figura 2. Le cellule tumorali, una volta piastrate in mezzi completi staminali neurali cellulari con fattori di crescita, tumorspheres forma come mostrato in Figura 3.

Le cellule tumorali sono marcati con marcatori neurali superficie di cellule staminali CD133 e CD15 e analizzate mediante citometria di flusso, come mostrato in Figura 4.

Cellule singole a partire da popolazioni diverse per esempio, CD15 + / CD133 +, CD15 + / CD133-, CD15-/CD133 +, CD15-/CD133- vengono poi ordinati in piastre a 96 pozzetti (Figura 5a) o in diapositive AmpliGrid (Figura 6a).

Nella piastra a 96 pozzetti, singole cellule che possiedono la capacità di auto-rinnovamento (ad esempio cellule CD133 +), (figura 5b), possono formare tumorspheres (Figura 5c) seguendo incudi incubazione. A autorinnovamento grafico può essere tracciato (Figura 5d) contando il numero di sfere formate per pozzetto. Singole cellule ordinati nel sito di reazione della slitta Ampligrid (Figura 6a). Gli RNA estratto da cellule singole possono essere retrotrascritto utilizzando il AmpliSpeed ​​Advalytix (Figura 6b). Il cDNA ottenuto viene utilizzato per eseguire in tempo reale RT-PCR (figura 6c).

Figura 1
Figura 1. Immagine di risonanza magnetica (MRI) di un GBM paziente. Risonanza magnetica del cervello di una ragazza di 16 anni con un mese di storia di mal di testa e una storia settimana di vomito, letargia e offuscamento della vista. Sequenza FLAIR assiale mostra una grande bi-emisferica ("farfalla") GBM.

Figura 2
Figura 2. Trattamento del tumore al cervello. Campioni di tumori cerebrali sono obtainato da pazienti consenzienti subito dopo l'intervento chirurgico. Essi sono dissociate meccanicamente come illustrato (a) e sono quindi dissociate enzimaticamente in aCSF con Liberase incubando in un rpm 30 dondolo incubatore a 37 ° C per 15 min (b).

Figura 3
Figura 3. Popolazioni BTIC formare tumorspheres nella cultura. Dissociati cellule tumorali cerebrali placcati in mezzi completi staminali neurali cellulari con fattori di crescita forma tumorspheres.

Figura 4
Figura 4. L'analisi citofluorimetrica delle popolazioni BTIC. (A) in avanti rispetto a proprietà scatter laterali forniscono l'immagine di tutte le cellule, compresi i residui (b) Le cellule che macchiano con il colorante vitalità 7-AAD sono esclusi dall'analisi. (C) La posizione dei quadranti statistici è determinato mediante opportuni controlli Isotype (d) cellule tumorali colorate con superficie markers CD15 e CD133-PE-APC. (D) Moflo cell sorter XDP. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 5
Figura 5. Limitando l'analisi di diluizione BTICs rivela la loro capacità di auto-rinnovamento. (A) Cellule di diluizioni differenti sono ordinati in 96 pozzetti contenenti 200 ml di NSC a (b) una singola cellula per pozzetto. (C) Dopo un periodo di 7 giorni di incubazione, si forma un tumorsphere. La morfologia di tumorspheres secondari è identica a quella di tumorspheres primari. (D) La media intercetta x valori possono essere calcolati da limitare l'analisi di diluizione per ciascun sottotipo di tumore per rivelare il numero di cellule necessario per formare almeno una tumorsphere per pozzetto.

Figura 6
Figura 6. Analisi dell'espressione genica di una singola cellula BTICè possibile utilizzando singola cellula RT-PCR tecnologia. (a) cellule singole da una popolazione BTIC possono essere ordinati su vetrini AmpliGrid. (B) sintesi di cDNA viene eseguita su singole cellule su vetrini AmpliGrid utilizzando il AmpliSpeed ​​Advalytix. (C) PCR quantitativa in tempo reale viene eseguita sul cDNA sintetizzato da singole cellule BTIC.

2M NaCl 62 ml
KCl 1M 5 ml
1M MgCl 2 3,2 ml
155 mm NaHCO 3 169 ml
Glucosio 1M 10 ml
108 mM CaCl 2 0,9256 ml
Purelab Ultra H 2 0 749,84 ml

Tabella 1 artificiale liquido cerebrospinale (aCSF) -. 1.000 ml.

Archivio multimediale basali 500 ml
01:01 DMEM: F12 480 ml
N2 supplemento 5 ml
HEPES 1M 5 ml
Glucosio 3,0 g
N-acetilcisteina (60 mg / ml) 1 ml
Sopravvivenza neurale fattore-1 (NSF-1) 10 ml

Tabella 2. Supporto di cellule staminali neurali.

Supporto NSC completi (preparato fresco prima dell'uso):
Supporti NSC basali + 20 ng / ml EGF (epidermal growth factor) + 20 ng / ml bFGF (fattore di crescita dei fibroblasti) + 10 ng / ml LIF (fattore inibitorio di leucemia) * + 10 microlitri / ml antibiotico-antimicotico

* Fattore inibitorio della leucemia (LIF): Questo reagente da Millipore contiene una classe citochina interleuchina 6, una protein che sopprime la differenziazione spontanea delle cellule staminali che promuovono la manutenzione a lungo termine di colture di cellule staminali.

Anticorpi Fornitore / CAT # pl / test (in 100 pl)
CD133 / 2 APC (293C3) Miltenyi Biotec/130-090-854 5
IgG2b APC (Isotype controllo) Miltenyi Biotec/130-092-217 5
CD15PE Beckman Coulter/IM1954U 5
IgG2a PE (Isotype controllo) Beckman Coulter/A09141 5
7AAD Beckman Coulter/A07704 10

Tabella 3. Anticorpi di flusso.

Componente Volume (1 reazione) Volume (48 reazione)
2x singola cella tampone di reazione RT 0,50 pl 30,0 pl
RNase Inhibitor (10 U / pl) 0,02 pl 1,2 pl
5X singola cella RT enhancer 0,15 pl 9,00 pl
RT singola cella Enzyme Mix 0,04 pl 2,4 pl
Advablue (OAX04227) 0,1 pl 6,00 pl
Acqua priva di nucleasi portare a 1 pl portare a 60 pl

Tabella 4. Composizione della miscela RT master per RTPCR singola cella (cat # OAX04515).

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Discussion

Il gambo ipotesi cancro cella 10, sulla base di lavoro 21 nella leucemia, cancro al seno e cancro al cervello 11 4,5, suggerisce che solo una frazione relativamente piccola di cellule nel tumore, chiamate cellule staminali tumorali, possiedono la capacità di proliferare e ampiamente auto -rinnovo. La maggior parte delle cellule tumorali perdono la capacità di proliferare e auto-rinnovano come differenziarsi in cellule che diventano la firma fenotipica del tumore. Trovare le cellule chiave nella popolazione tumore al cervello che sono in grado di mantenere il tumore darà comprensione del meccanismo della tumorigenesi cervello e ci permetterà di risalire alla cella di origine.

Le cellule staminali sono cellule funzionalmente definita come auto-rigenerante che presentano multi-lignaggio differenziazione 22-24. Primaria tessuto tumorale cerebrale viene coltivato in condizioni di coltura che favoriscono la crescita delle cellule staminali, precedentemente stabilito per l'isolamento delle cellule staminali neurali come tumorspheres 6,26. Indipendentemente dal sottotipo patologico, da 24 a 48 ore di coltura primaria, la maggior parte dei tumori cerebrali producono una frazione minoritaria di cellule che mostrano una crescita in neurosfere derivate clonale di tipo cluster, o tumorspheres. Così siamo in grado di arricchire le popolazioni BTIC dai tessuti del paziente tumore al cervello.

L'avvento di multi-parametro cella fluorescente attivato smistamento 27 e tecnologia degli anticorpi monoclonali 28 ha consentito per la purificazione di cellule staminali tumorali basata su marcatori di superficie cellulare. Utilizzando i marcatori di cellule staminali, come CD15 e CD133, siamo stati in grado di risolvere in modo prospettico per specifiche cellule staminali simili a popolazioni e per studiare la loro capacità di auto-rinnovamento eseguendo saggi di diluizione limite. A caveat di auto-rinnovamento test è stato introdotto da un recente studio dimostra che in vitro auto-rinnovamento non sempre correlata con la formazione di tumori in modelli murini 29. Tuttavia il nostro lavoro recente ha dimostrato che in vitro self-renewal saggi si correlano con la sopravvivenza dei pazienti, rendendo questi saggi preziosi per lo studio in corso di biologia BTIC 30.

Lavorare con primario di tessuti umani pone molte sfide tecniche. Trasformazione dei tessuti deve essere eseguita molto delicatamente per preservare la vitalità delle cellule isolate. La quantità di Liberase ei tempi di incubazione è critica. Smistamento flusso di celle può essere ottimizzato per aumentare post-ordina vitalità utilizzando ugelli e pressioni. Troviamo che le nostre cellule preferiscono essere ordinati attraverso un ugello 100μm a 30 psi di pressione guaina. Smistamento su siti reattivi Ampligrid scorrimento può essere alquanto difficile: è importante per confermare la presenza della cellula depositato mediante microscopia.

31. Tumori cerebrali sono in genere costituito da cellule morfologicamente diverse che esprimono una varietà di marcatori neurali lignaggio. Studio dei tumori cerebrali tradizionale istopatologia ha prodotto solo una quantità limitata di conoscenza del comportamento clinico del tumore. Anche se grandi progressi sono stati fatti nella comprensione delle alterazioni molecolari genetici di alcuni tumori cerebrali, gliomi 3,32-34 particolare medulloblastomi e maligni, e alcune di queste alterazioni identificate stanno cominciando a guidare il trattamento, non è chiaro se tutti i tumori cellule sono equivalenti nella loro capacità di mantenere la crescita tumorale. Analisi di geni chiave coinvolti nella vie di segnalazione in popolazioni tumore al cervello è fondamentale per migliorare la nostra comprensione dei meccanismi aberranti che portano alla formazione del tumore al cervello. Anche in un apparentemente omogeneonous tessuti, le cellule di dimostrare di essere unico nelle proprie capacità potenziali. Analisi dei livelli di espressione dei trascritti e proteine ​​in singole cellule rivelano che c'è una grande cellula-cellula variazioni sia in condizione di riposo e quando esposto a stimoli 35-39. Pertanto, analizzando l'intera popolazione di cellule non rivelerà il comportamento di una singola cella. qRT-PCR è considerato il gold standard per la quantificazione mRNA 40-41. In questo studio, dimostriamo ordinamento prospettico di singole cellule da popolazioni distinte delle diapositive AmpliGrid. Uso singola cella RT-PCR, siamo in grado di effettuare l'analisi di espressione genica in una singola cella da una popolazione eterogenea, valutando quindi il significato biologico di una cella selezionata all'interno di una popolazione mista.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato finanziato dall'Istituto Ontario di ricerca sul cancro (OICR), la Terry Fox Foundation e l'American Association of Neurological Surgeons.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1:1 DMEM:F12 Invitrogen 11320-082
N2 supplement Invitrogen 17502-048
1M HEPES Wisent Inc. 330-050-EL
Glucose Invitrogen 15023-021
N-acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165-25g
Neural survival factor -1 (NSF-1) Lonza Clonetics CC-4323
Epidermal growth factor (EGF) Sigma-Aldrich E9644
Basic fibroblast growth factor (bFGF) Invitrogen PHG0261
Leukemia inhibitory factor (LIF) EMD Millipore LIF1010
Antibiotic/mycotic Wisent Inc. 450-115-EL
Liberase TM Roche Group 05 401 119 001
Ammonium chloride solution Stem Cell Technologies 07850

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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