Verarbeitung von primären Hirntumoren Tissue für Stem Cell Assays und Flow Sortierung

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Summary

Die Identifizierung von Gehirntumor initiierende Zellen (BTICs), die seltenen Zellen innerhalb einer heterogenen Tumor besitzt Stammzell-Eigenschaften, liefert neue Einblicke in das menschliche Gehirn Tumor Pathogenese. Wir haben spezifische Kulturbedingungen verfeinert für BTICs bereichern, und wir routinemäßig Durchflusszytometrie weiter bereichern diese Populationen. Selbsterneuerung Assays und Transkript Analyse durch einzelne Zelle RT-PCR kann anschließend auf diesen isolierten Zellen durchgeführt werden.

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Venugopal, C., McFarlane, N. M., Nolte, S., Manoranjan, B., Singh, S. K. Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting. J. Vis. Exp. (67), e4111, doi:10.3791/4111 (2012).

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Abstract

Hirntumoren sind typischerweise aus morphologisch unterschiedlichen Zellen, die eine Vielzahl von neuronalen Marker exprimieren Linie besteht. Nur ein relativ kleiner Teil der Zellen im Tumor mit Stammzelleigenschaften, genannt Gehirntumor initiierende Zellen (BTICs), besitzen die Fähigkeit, entlang mehrerer Abstammungslinien unterscheiden, selbst zu erneuern, und initiieren Tumoren in vivo. Wir wendeten Kulturbedingungen ursprünglich für normalen neuralen Stammzellen (NSC) an einer Vielzahl von menschlichen Gehirntumoren verwendet und festgestellt, dass diese Kultur spezifisch Verfahren wählt für stielartigen Populationen. Serum-freiem Medium (NSC) ermöglicht die Aufrechterhaltung eines undifferenzierten Stammzellen Zustand, und die Zugabe von bFGF und EGF ermöglicht die Verbreitung von Multi-potent, sich selbst erneuernden und erweiterbaren tumorspheres.

Zur weiteren Charakterisierung der einzelnen Tumors BTIC Bevölkerung, werten wir Zelloberflächenmarker mittels Durchflusszytometrie. Wir können auch sortieren Bevölkerung von Interesse für die besonderen characterization. Selbsterneuerung Assays sind auf einzelnen BTICs in 96 Well-Platten sortiert durchgeführt, die Bildung von tumorspheres nach Inkubation bei 37 ° C zeigt das Vorhandensein von einem Stamm oder Vorläuferzelle. Mehrere Zellzahlen von einer bestimmten Population können auch in verschiedenen Brunnen für Grenzverdünnung Analyse sortiert werden, um sich selbst zu erneuern Fähigkeit zu analysieren. Wir können auch studieren differentiellen Genexpression innerhalb einer bestimmten Zellpopulation mit einzelnen Zelle RT-PCR.

Die folgenden Protokolle beschreiben unser Verfahren zur Dissoziation und Kultivieren von primären humanen Proben zum Nachweis BTIC Populationen sowie die Dissoziation von tumorspheres anzureichern. Ebenfalls eingeschlossen sind Protokolle für die Färbung für Durchflusszytometrie Analyse oder Sortierung, Selbsterneuerung Assays und einzelne Zelle RT-PCR.

Introduction

Hirntumoren gehören zu den aggressiven und heterogene Krebsarten beim Menschen bekannt. Obwohl ihre frühere Erkennung und Diagnose von modernen bildgebenden Technik erleichtert worden, wir noch fehlt kurative Therapien für vielen Hirntumoren, insbesondere für diffuse, invasive Einsen oder diesen sich tief im Gehirn.

Hirntumoren stellen die Hauptursache der Krebssterblichkeit im Kindesalter aufgrund ihrer sehr aggressiven und oft unheilbaren Natur. Glioblastom (GBM), der häufigsten primären Hirntumoren bei Erwachsenen, ist einer der aggressivsten Krebserkrankungen des Menschen, für seine gleichmäßig tödlichen Prognose 1 gefürchtet. Diese hoch-malignen astrozytären Tumor (WHO Grad 4) tritt meist in den zerebralen Hemisphären von Erwachsenen, und kann auch bei kleinen Kindern und Säuglingen auftreten. Sein Wachstum ist schnell und infiltrative und diagnostische pathologischen Merkmale sind Kernpolymorphie, mikrovaskuläre Proliferation und Nekrosen 2,3. Für adults mit neu diagnostiziertem GBM, mediane Überlebenszeit nur selten erstreckt sich über 12 Monate 1, mit allgemein schlechte Antworten auf alle therapeutischen Modalitäten. Wir haben festgestellt, dass es viele funktionale und genetische Ähnlichkeiten durch somatische Stammzellen und Krebszellen geteilt, und dass die molekularen Signalwege, die normale Entwicklung des Gehirns reguliert werden häufig in der Krebstherapie fehlreguliert. Bei der Anwendung der Stammzellbiologie Paradigmen zur Untersuchung von Hirntumoren, wir waren die ersten Forscher, die prospektiv zu identifizieren und zu reinigen eine Subpopulation von Zellen aus menschlichen GBMs, die Stammzell-Eigenschaften der Proliferation, Selbsterneuerung ausgestellt, und die Differenzierung in vitro 4 und in vivo 5. Wir wendeten Kulturbedingungen und Assays ursprünglich zur normalen neuralen Stammzellen (NSC) in vitro 6,7 charakterisieren, um mehrere Kinder-und Erwachsenen Hirntumoren und angereichert für diesen Stamm-ähnlichen Zellen durch Zellsortierung für das neuronale Vorläuferzellen Zelloberflächenmarker CD133 8 ,9. Die CD133 + Gehirntumor Fraktion enthaltenen Zellen, die eine viel höhere Frequenz als das Tumorinitiation CD133-Fraktion in NOD-SCID Mäusehirnen 5,10 hatte. Dieses formal festgestellt, dass nur eine seltene Untergruppe von Hirntumoren Zellen mit Stammzell-Eigenschaften Tumor-Initiierung, verdienen sie den Namen "Gehirntumor initiierende Zellen" oder "BTICs" sind. Der Roman Identifizierung BTICs gibt neue Einblicke in das menschliche Gehirn Tumorgenese, geben starke Unterstützung für die Krebsstammzellen Hypothese 10-13 als Grundlage für die vielen soliden Tumoren und stellt eine neuartige zelluläre Ziel für eine effektivere Krebstherapien 14-20. Therapien, die sich auf das Töten der Großteil des Tumors die seltene stielartigen Bruchteil verpassen kann, so dass der Tumor weiter wachsen. Therapien, die sich auf das Töten der Krebsstammzellen eine bessere Behandlung und Prognose für Patienten mit Hirntumoren vorsehen.

Um BTIC Populationen zu untersuchen, haben wir unsere cultu verfeinertre Protokolle speziell für Zellpopulationen innerhalb der menschlichen Hirntumoren, die Stammzell-Eigenschaften besitzen wählen. Serumfreiem, neurale Stammzellen (NSC) Medium ermöglicht die Wartung von einer undifferenzierten Stammzellen Zustand, und die Zugabe von basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), und Leukämie inhibierenden Faktor (LIF) ermöglicht die Verbreitung von Multi-potent, sich selbst erneuernden und erweiterbaren menschlichen tumorspheres. Hier beschreiben wir die Methoden bei der Verarbeitung von primären Hirntumoren und Kultivierung sie in NSC Medium für BTIC Bevölkerung bereichern beteiligt. Wir nannten unsere experimentellen Modellsystem "BTIC Patienten Isolate", die Tatsache, dass diese Zellen nur minimal unter Stammzellen kultiviert betonen Zelle Bedingungen für Stammzellpopulationen auszuwählen. Nachfolgende Immunmarkierung von BTIC Populationen für Schlüssel Stammzellmarkern wie CD133 und CD15 und Durchflusszytometrie-Analyse wird ebenfalls beschrieben. Dann besprechen wir die Grenzverdünnung Analyseder Beihilfen bei der Untersuchung der Selbsterneuerung Potenzial BTICs. Schließlich untersuchen wir die Genexpressionsanalyse dieser seltenen Zellen durch Sortierung einzelnen Zellen auf AmpliGrid Dias und Durchführung einzelne Zelle RT-PCR. Diese Techniken sind auch anwendbar auf andere Hirntumore wie Medulloblastom, Ependymom und pädiatrische Gliomen.

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Protocol

Ein. Culture of Brain Tumor Tissue

  1. Fügen Sie 200 ul aufgetaut Liberase (Roche Applied Science) auf 15 ml künstlichem CSF (aCSF-siehe Tabelle 1) und Platz in 37 ° C Wasserbad. Liberase TM ist eine Mischung aus proteolytischen Enzymen verwendet, um primäre Gewebeproben sowie kultivierten tumorspheres distanzieren. Im Gegensatz zu Trypsin-EDTA, bewahrt die Liberase Methode das Oberflächen-Antigen CD133. Für eine Gewebeprobe von etwa 0,5 cm 3, verwenden wir 200 ul Liberase. Wenn das Gewebe kleiner ist, verwenden wir 100 ul.
  2. Bringen Ammoniumchloridlösung (Stammzell-Technologien) auf Raumtemperatur. Ammoniumchlorid-Lösung vorsichtig lysiert roten Blutkörperchen mit minimalen Auswirkungen auf die anderen Zellen. Es enthält keine Fixativ.
  3. In sterile biologischen Sicherheitswerkbank, 5 ml aCSF um Probenbehälter, wirbeln um Gewebe abspülen, dann abpipettieren. Dieser Schritt hilft, um rote Blutkörperchen (RBC) zu entfernen.
  4. Übertragen Gehirn Tumorgewebe zu einer sterilen 100 mm Petri dish.
  5. Mit feinen Schere oder Skalpell und Pinzette, zerlegen Gewebe Gülle Konsistenz.
  6. Sammle Probe unter Verwendung einer 10 ml regelmäßigen Pipette oder einer Pinzette und Transfer-Fragmente in das Röhrchen mit vorgewärmten aCSF mit Liberase.
  7. Am Inkubator-Schüttler (30 rpm) und auf 37 ° C für 15 min.
  8. Filtern Sie die Gewebelysat bis 70 um Zellsieb in einem 50 ml-Falcon-Röhrchen.
  9. Drehen Sie das Filtrat nach unten bei 280 xg für 5 min.
  10. Überstand entfernen sorgfältig und evaluieren Größe und Farbe der resultierende Zellpellet: Pellets, die rosa oder rot sind anzugeben wachsende Zahl von roten Blutkörperchen.
  11. Pellet in 1 ml PBS.
  12. Hinzufügen einer geeigneten Menge von Ammoniumchloridlösung (4-12 ml) auf Pelletgröße und roten Zellkontamination bezogen (der Ammoniumchloridlösung ist sehr schonend und erhöhte Mengen sind nicht schädlich für andere Zellen als Erythrozyten).
  13. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min.
  14. Spin-ZellenFestlegung bei 280 × g für 5 min.
  15. Waschen einmal mit 10 ml sterilem PBS.
  16. Resuspendieren in 5 ml NSC Vollmedium (Tabelle 2) und Transfer zu einem ultra-low-Bindung 60 mm Gewebekulturplatten (Corning). Wir verwenden ultra-low-Bindung Petrischalen mit kovalent gebundenen Hydrogel Oberflächen, die hydrophile und neutral geladen, um Zelladhäsion-vermittelte Differenzierung zu minimieren.

Für die ersten Tage in der Kultur, nicht ändern, die Medien: top-up nur mit 1-2 ml Medium je nach Bedarf, dann weiter zu Kultur und Change-Medien zu beobachten, wenn die Farbe der Medien wird leicht gelblich.

2. Tumorsphere Dissoziation für die Durchflusszytometrie

  1. Bewerten tumorspheres unter dem Mikroskop: Wenn die Kugel Größe> 100 um, Dissoziation wird empfohlen, da größere Kugeln kann nekrotisch in der Mitte.
  2. Übertragen Kultur 15 ml konischen Röhrchen.
  3. Fügen Sie 2-3 ml sterile PBS auf die Platte gründlich und fügen Sie konischen Rohr.
  4. Zentrifuge bei 280 × g für 5 min.
  5. Überstand entfernen und resuspendieren in 1 - 2 ml steriler PBS.
  6. Fügen Sie 10 ul Liberase.
  7. Inkubieren bei 37 ° C-Wasserbad für 3 min. Entfernen und visuell auswerten Aufhängung, wenn mehrere Klumpen zu sehen, sanft verreiben mit einem 1.000 ul Pipettenspitze.
  8. Wenn Verklumpung auftritt, weiterhin Inkubation für eine zusätzliche 1-2 min.
  9. Waschen der Zellen durch Zugabe von 5 ml sterilem PBS und Zentrifugieren bei 280 × g für 5 min.
  10. Überstand entfernen und resuspendieren in 500-1,000 ul sterilem PBS 2 mM EDTA.
  11. Bewerten Zellzahl und Lebensfähigkeit unter Verwendung von Trypanblau.
  12. Passen Zellzahl zu 1 Million / ml in PBS + 2 mM EDTA.

3. Oberflächenfärbung

  1. Übertragen Sie 100 ul von 1x10 6 / ml Zellsuspension pro Test 12x75 mm Strömungsrohre.
  2. Fügen Sie entsprechende Menge von Antikörpern. Abgestimmt Isotyp Kontrollen sollten für jeden verwendet werdenAntikörper (siehe Tabelle 3).
  3. Inkubieren für 30 min auf Eis.
  4. 2 ml PBS 2 mM EDTA zu jedem Strömungsrohr.
  5. Zentrifugation bei 200 xg für 4 min, dekantieren und Blot.
  6. Pellet in 300 ul PBS 2 mM EDTA.
  7. Fügen Sie 10 ul 7AAD Lebensfähigkeit Farbstoff in jedes Röhrchen pipettieren und für mindestens 15 Minuten auf dem Eis.
  8. Analysieren mittels Durchflusszytometrie.

4. Durchflusszytometrie und-analyse

Die Einzelheiten der Erfassung und Analyse von Flow Daten Gerät abhängig. Vertreter negativen Proben laufen und Geräteeinstellungen für Forward (Größe) und Side (Granularität) streuen etabliert. Diese Streuung Muster ermöglicht dem Endbenutzer, um alle Zellen in der Probe zu sehen, darunter Schutt. Eine Region wird in der Regel um die Zellen von Interesse gezogen. (Abbildung 4a) Die Einstellungen werden dann für alle Fluoreszenz-Detektoren erforderlich, um die negativen Zellen innerhalb der ersten Dekade des AF-Position aufgebautluorescence Intensitätsverteilung. Wenn mehr als ein Farbstoff oder Fluorochrom verwendet wird, muss einzigen gefärbten Steuerelemente auszuführen, um Farbe Korrekturwerte (Subtraktion störende Fluoreszenz-Emissionen) zu etablieren. Beim Ausführen von lebenden Zellen eine Lebensfähigkeit Farbstoff wie 7-AAD (7-Amino-Actinomycin D - Anregung 488/emission 655) verwendet wird, und einem zweiten Bereich gezogen, um abgestorbene Zellen (Abb. 4b) auszuschließen. Beide Bereiche werden zu keiner weiteren Analyse der Proben aufgebracht.

5. Selbst-Erneuerung Assay

Der Schlüssel-Assay, die sich stark durch klonale Wachstum Kugel erleichtert ist die in-vitro-Test der Selbsterneuerung Kapazität, der Grenzverdünnung Assay. Tumorspheres dissoziiert und verteilt in Verdünnungen bis zu einer einzelnen Zelle pro Vertiefung, und die Geschwindigkeit der nachfolgenden Bereich Bildung über 7 Tagen in Kultur berechnet. Am Tag 7, wird der Prozentsatz der Vertiefungen ohne Gehalt Kugeln für jede Zelle Plattierungsdichte (F 0) berechnet und gegengegen die Anzahl der Zellen pro Vertiefung (x). Die Anzahl der Zellen erforderlich ist, um mindestens eine in jedem gut tumorsphere bilden wird aus dem Punkt, an dem die Leitung kreuzt die 0,37 Niveau (F 0 = e-x) bestimmt. In einer Poisson-Verteilung von Zellen, F 0 = 0,37 entspricht der Verdünnung von einer Zelle pro Napf, so dass diese Berechnung (der 37% schneiden) die Frequenz des klonogenen Stammzellen in der gesamten Zellpopulation (Abbildung 5) reflektiert.

6. Single Cell RT-PCR

Einzelne Zellen aus verschiedenen Populationen von Beckman Coulter MoFlo XDP auf Reaktionsstellen auf einem AmpliGrid Schieber (Beckman Coulter cat # AG480F) sortiert. Einzelne Zelle RT-PCR unter Verwendung AmpliGrid Single One Step RT-PCR-System (Beckman Coulter cat # OAX04515) nach den Angaben des Herstellers. Kurz gesagt, wird eine einzelne Zelle in jede Reaktionsstelle eines AmpliGrid Objektträger aufgebracht; die Anwesenheit einer einzelnen Zelle in jedemReaktionsstelle durch Mikroskopie bestätigt. Reverse Transkription (RT) wird unmittelbar nach dem Sortieren, um die Probe nicht beeinträchtigt wird durchgeführt. Die RT Master Mix wird frisch zubereitet, nach Testvorschrift (Tabelle 4). Wir verwendeten 0,03 ul 25 uM Zufallsprimern (Promega) pro Reaktion; 1 ul Mastermix ist an der Mitte jeder Reaktionsstelle zugegeben. Dies wird sofort mit 5 ul Versiegelungslösung (Beckman Coulter cat # OAX04503) beschichtet. Verwendung einer Folie AmpliSpeed ​​Zykluseinrichtung (Beckman Coulter, cat # OAX04101), Objektträger werden bei 25 ° C für 10 min, 42 ° C für 10 min und 55 ° C für 45 min. Nach der reversen Transkription, 3 ul DNAse / RNAse-freiem Wasser ist jedem Reaktionsstelle zugegeben und die gesamte Mischung zu einem PCR-Röhrchen (1 Röhre / Stelle) übertragen. 8 ul qPCR Master Mix (5 ul Sybr Green (Quanta), 1 ul Wasser, 1 ul 10 uM vorwärts und rückwärts Primer mix) plus 2 &: In einer PCR-Platte wird eine Reaktion Volumen von 10 ul für die quantitative PCR verwendetmu; l des RT Mischung. Für Echtzeit-Quantifizierung, Proben auf einem BioRad Cycler ausgeführt mit folgendem Programm: 95 ° C für 10 min, 45 Zyklen von 95 ° C für 30 sec, 60 ° C für 60 sec, 72 ° C für 60 sec, gefolgt von 10 min bei 72 ° C und Schmelzkurvenanalyse. Ct-Werte wurden mit Opticon Monitor 3 (BioRad). Drei Gene pro Zelle beurteilt werden, einschließlich GAPDH als Housekeeping-Gen. Genexpression zu GAPDH normalisiert Expression, nach Anspruch 2-ACt. Mindestens ein Dutzend einzelne Zellen des gleichen Bevölkerung von der gleichen Art verwendet werden, wie biologische Replikate aus Mangel an technischen Replikate zu kompensieren.

7. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt eine Magnetic Resonance Imaging (MRI)-Scan eines repräsentativen Patienten mit GBM. Hirntumor Proben aus mündigen Patienten sofort nach der Operation erhalten, als genehmigt von der Hamilton Health Sciences / McMaster Health Sciences Research Ethics Board. Ein Teil jeder Probe wird der Neuropathologe für die klinische Routinediagnostik gegeben. Der verbleibende Probe wird verarbeitet, wie in Abbildung 2 dargestellt. Die Tumorzellen, einmal in völliger neuralen Stammzelle Medien mit Wachstumsfaktoren, Form tumorspheres ausplattiert wie in Abbildung 3 dargestellt.

Die Tumorzellen werden mit neuronalen Oberfläche Stammzellmarkern CD133 und CD15 etikettiert und durch Durchflusszytometrie analysiert, wie in Abbildung 4 dargestellt.

Einzelne Zellen aus verschiedenen Populationen für zB CD15 + / CD133 +, CD15 + / CD133-, CD15-/CD133 +, CD15-/CD133- werden dann in 96-Well-Platten (5a) oder in AmpliGrid Dias (6a) sortiert.

In der 96-Well-Platte können einzelne Zellen, die Selbst-Erneuerung Kapazität (zB CD133 + Zellen), (5b) besitzen, bilden tumorspheres (Abbildung 5c) nach incubation. Ein Selbsterneuerung Graph kann aufgetragen (Figur 5d) durch Zählen der Anzahl von Kugeln pro Vertiefung ausgebildet werden. Einzelzellen in die Reaktionsstelle der AmpliGrid Schlitten (6a) sortiert. Die RNA aus Zellen extrahiert einzigen revers transkribiert werden kann unter Verwendung des Advalytix AmpliSpeed ​​(Abbildung 6b). Die erhaltene cDNA wird verwendet, um in Echtzeit RT-PCR (6c) durchzuführen.

Abbildung 1
Abbildung 1. Magnetresonanztomographie (MRI) eines Patienten GBM. MRT des Gehirns eines 16-jähriges Mädchen mit einer einmonatigen Geschichte der Kopfschmerzen und einer Woche Geschichte Erbrechen, Lethargie und visuelle Unschärfe. Axial FLAIR-Sequenz zeigt eine große bi-hemisphärische ("Schmetterling") GBM.

Abbildung 2
Abbildung 2. Hirntumor Verarbeitung. Hirntumor Proben sind obtaINED vom mündigen Patienten sofort nach der Operation. Sie sind mechanisch dissoziiert als (a) gezeigt und sind dann enzymatisch dissoziiert aCSF mit Liberase durch Inkubation in einem 30 min-Rocking-Inkubator bei 37 ° C für 15 min (b).

Abbildung 3
Abbildung 3. BTIC Populationen bilden tumorspheres in der Kultur. Dissoziierte Hirntumorzellen in völliger neuralen Stammzellen Medien mit Wachstumsfaktoren beschichtet bilden tumorspheres.

Abbildung 4
Abbildung 4. Die durchflusszytometrische Analyse der BTIC Populationen. (A) Forward gegenüber Seitwärtsstreuung Eigenschaften bereitzustellen ein Bild von allen Zellen, einschließlich Schmutz (b) Zellen, die mit der Lebensfähigkeit Farbstoff 7-AAD Flecken werden von der Analyse ausgeschlossen. (C) Die Position der statistischen Quadranten bestimmt wird unter Verwendung geeigneter Steuerungen Isotyp (d) Tumorzellen mit Oberflächen ma angefärbtrkers CD15-PE und CD133-APC. (D) MoFlo XDP Zellsortierer. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 5
Abbildung 5. Grenzverdünnung Analyse BTICs offenbart ihre Selbsterneuerung Kapazität. (A) Zellen der unterschiedlichen Verdünnungen in 96 Vertiefungen, enthaltend 200 ul NSC zu (b) einer einzelnen Zelle pro Well sortiert werden. (C) Nach einer 7-tägigen Inkubationszeit wird ein tumorsphere gebildet. Die Morphologie der sekundären tumorspheres ist identisch mit der primären tumorspheres. (D) Die mittleren x-Achsenabschnitt Werte können aus Grenzverdünnung Analyse für jeden Tumorsubtyp um die Anzahl der Zellen erforderlich ist, um mindestens einen tumorsphere pro Vertiefung bilden offenbaren berechnet.

Abbildung 6
Abbildung 6. Genexpressionsanalysen aus einer einzigen Zelle BTICwiederholen, indem einzelne Zelle RT-PCR-Technologie. (a) Einzel-Zellen aus einer Population kann auf BTIC AmpliGrid Folien sortiert werden. (B) cDNA-Synthese wird auf einzelne Zellen auf AmpliGrid Dias mit dem Advalytix AmpliSpeed ​​durchgeführt. (C) Quantitative Realtime PCR basiert auf der cDNA von einzelnen BTIC Zellen synthetisiert durchgeführt.

2 M NaCl 62 ml
1M KCl 5 ml
1M MgCl 2 3,2 ml
155 mM NaHCO 3 169 ml
1M Glucose 10 ml
108 mM CaCl 2 0,9256 ml
PURELAB Ultra-H 2 0 749,84 ml

Tabelle 1 Artificial Liquor (aCSF) -. 1.000 ml.

Lager Basal Medien 500 ml
01.01 DMEM: F12 480 ml
N2 Ergänzung 5 ml
1M HEPES 5 ml
Glucose 3,0 g
N-Acetylcystein (60 ug / ml) 1 ml
Neural Überleben factor-1 (NSF-1) 10 ml

Tabelle 2. Neuralen Stammzellen Medien.

NSC komplette Medien (frisch zubereitet vor der Verwendung):
NSC Grundmedien + 20 ng / ml EGF (epidermal growth factor) + 20 ng / ml bFGF (basic fibroblast growth factor) + 10 ng / ml LIF (Leukämie inhibierender Faktor) * + 10 ul / ml Antibiotikum-Antimykotikum

* Leukemia inhibitory factor (LIF): Dieses Reagenz von Millipore enthält ein Interleukin 6 Klasse Cytokin, ein protein die spontane Differenzierung von Stammzellen zu fördern längerfristige Wartung der Stammzell-Kulturen unterdrückt.

Antikörper Lieferant / CAT # ul / test (in 100 ul)
CD133 / 2 APC (293C3) Miltenyi Biotec/130-090-854 5
IgG2b APC (Isotyp-Kontrolle) Miltenyi Biotec/130-092-217 5
CD15PE Beckman Coulter/IM1954U 5
IgG2a PE (Isotyp-Kontrolle) Beckman Coulter/A09141 5
7AAD Beckman Coulter/A07704 10

Tabelle 3. Durchfluss Antikörper.

Komponente Volume (1 Reaktion) Volume (48 Reaktion)
2x Single Cell RT Reaktionspuffer 0,50 ul 30,0 ul
RNase Inhibitor (10 U / ul) 0,02 ul 1,2 ul
5X Single Cell RT-Enhancer 0,15 ul 9,00 ul
Single Cell RT Enzyme Mix 0,04 ul 2,4 ul
Advablue (OAX04227) 0,1 ul 6,00 ul
Nuclease freies Wasser bis zu 1 ul machen bis zu 60 ul

Tabelle 4. Zusammensetzung des RT Master Mix für Single Cell RTPCR (cat # OAX04515).

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Discussion

Die Krebsstammzelle Hypothese 10, auf der Arbeit bei Leukämie 21 basierend, Brustkrebs 11 und Hirnkrebs 4,5, legt nahe, dass nur ein relativ kleiner Teil der Zellen im Tumor, bezeichnet Krebsstammzellen, eine Fähigkeit, ausgiebig proliferieren und selbst besitzen erneuern. Die meisten der Tumorzellen die Fähigkeit verlieren, sich zu vermehren und selbst zu erneuern, als sie in Zellen, die die phänotypische Signatur des Tumors zu differenzieren. Den Schlüssel Zellen im Gehirn Tumor Bevölkerung, die in der Lage, den Tumor zu erhalten sind, werden Einblick in den Mechanismus des Gehirns Tumorentstehung geben und wird es uns ermöglichen zu verfolgen zurück in die Zelle des Ursprungs.

Stammzellen sind funktional als sich selbst erneuernden Zellen, die multi-Linie Differenzierung 22-24 weisen definiert. Primäre Gehirn Tumorgewebe unter Kulturbedingungen, die Stammzellwachstumsfaktor begünstigen gezüchtet, die zuvor für die Isolierung von neuralen Stammzellen etabliert tumorspheres 6,26. Unabhängig von pathologischen Subtyp, innerhalb von 24 bis 48 Stunden nach der primären Kultur ergeben meisten Hirntumoren eine Minderheit Bruchteil der Zellen, die Wachstum zeigen in klonal abgeleitet Neurosphäre-like Cluster oder tumorspheres. Dadurch sind wir in der Lage, für BTIC Populationen von Patienten Gehirn Tumorgewebe anzureichern.

Das Aufkommen von Multi-Parameter-fluoreszierenden Zellsortierung 27 und monoklonale Antikörper-Technologie 28 hat zur Reinigung von Krebsstammzellen auf Zelloberflächenmarker Basis erlaubt. Durch die Verwendung von Stammzellen Marker wie CD133 und CD15, konnten wir prospektiv für spezifische Stammzellen-like Populationen zu sortieren und ihre Selbst-Erneuerung Kapazitäten indem Grenzverdünnung Assays zu studieren. A caveat der Selbsterneuerung Assays wurde durch eine aktuelle Studie zeigt, dass in vitro Selbst-Erneuerung nicht immer mit Tumorbildung in Mausmodellen 29 korrelieren eingeführt. Jedoch sind unsere jüngsten Arbeiten hat gezeigt, dass in vitro Selbsterneuerung Assays nicht mit dem Überleben korrelieren, wodurch diese Assays wertvoll für den laufenden Studie BTIC Biologie 30.

Arbeiten mit primären humanen Gewebe bietet viele technische Herausforderungen. Gewebebearbeitungsverfahren sollte sehr vorsichtig durchgeführt werden, um die Lebensfähigkeit von isolierten Zellen bewahren. Die Menge des verwendeten Liberase und Zeit der Inkubation ist kritisch. Durchfluss Sortierung der Zellen optimiert werden, um nach der Art Lebensfähigkeit unter Verwendung verschiedener Düsen und Drücke zu erhöhen. Wir finden, dass unsere Zellen, um durch eine 100 um Düse bei 30 psi des Mantels Druck sortiert werden bevorzugen. Sortieranlage auf AmpliGrid Schieber reaktiven Stellen kann etwas schwieriger: es ist wichtig, um die Anwesenheit des abgeschiedenen Zelle durch Mikroskopie bestätigen.

31. Hirntumoren sind typischerweise aus morphologisch unterschiedlichen Zellen, die eine Vielzahl von neuronalen Marker exprimieren Linie besteht. Studie von Hirntumoren durch traditionelle Histopathologie hat nur eine begrenzte Menge an Wissen über die klinische Verhalten des Tumors ergab. Obwohl große Fortschritte im Verständnis der molekularen genetischen Veränderungen einiger Hirntumoren 3,32-34, besonders Medulloblastom und malignen Gliomen, und einige dieser identifizierten Veränderungen beginnen nun die Behandlung leiten gemacht worden sind, ist es nicht klar, ob alle Tumor- Zellen sind äquivalent in ihrer Fähigkeit, das Tumorwachstum zu halten. Analyse der wichtigsten Gene in Signalwege im Gehirn Tumor betroffenen Bevölkerung ist von entscheidender Bedeutung für unser Verständnis der aberranten Mechanismen des Gehirns Tumorbildung fördern. Selbst in einem scheinbar homogenennous Gewebe, beweisen Zellen eindeutig sein, ihr Potenzial. Analyse der Proteinexpression und-Transkript Ebenen in einzelnen Zellen zeigen, dass es eine große Variation Zell-Zell sowohl im Ruhezustand als auch bei 35-39 auf Stimuli ausgesetzt. Daher wird die Analyse der gesamten Population von Zellen nicht offenbaren das Verhalten einer einzelnen Zelle. qRT-PCR wird als der Goldstandard zur mRNA-Quantifizierung 40-41 sein. In dieser Studie zeigen wir Interessenten Sortierung der einzelnen Zellen aus unterschiedlichen Populationen AmpliGrid Dias. Verwendung Einzelzelle RT-PCR, können wir Genexpressionsanalyse auf einer einzelnen Zelle von einer heterogenen Population führen, wodurch die Beurteilung der biologischen Bedeutung eines ausgewählten Zelle innerhalb einer Mischpopulation.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der Ontario Institute of Cancer Research (OICR), die Terry Fox Stiftung und der American Association of Neurological Surgeons finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1:1 DMEM:F12 Invitrogen 11320-082
N2 supplement Invitrogen 17502-048
1M HEPES Wisent Inc. 330-050-EL
Glucose Invitrogen 15023-021
N-acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165-25g
Neural survival factor -1 (NSF-1) Lonza Clonetics CC-4323
Epidermal growth factor (EGF) Sigma-Aldrich E9644
Basic fibroblast growth factor (bFGF) Invitrogen PHG0261
Leukemia inhibitory factor (LIF) EMD Millipore LIF1010
Antibiotic/mycotic Wisent Inc. 450-115-EL
Liberase TM Roche Group 05 401 119 001
Ammonium chloride solution Stem Cell Technologies 07850

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References

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