الصلبة التجميعي المرحلة من الببتيد البس Functionalized استخدام "سلامة الصيد" منهجية

Biology
 

Summary

يوصف كفاءة الببتيد التوليف الصلبة مرحلة من ترايمر مكرر الببتيد functionalized الاستفادة من وجود "سلامة قبض على" إجراء شق من الراتنج HMBA.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Pfeiffer, C. T., Schafmeister, C. E. Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology. J. Vis. Exp. (63), e4112, doi:10.3791/4112 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

في عام 1962، نشرت RB ميريفيلد الإجراء الأول باستخدام الصلبة مرحلة التوليف الببتيد كطريق رواية لتجميع بكفاءة الببتيدات. هذه التقنية اثبتت بسرعة من المفيد أكثر من سلفه الحل التدريجي لها في كل من الوقت والعمل. التحسينات المتعلقة بطبيعة دعم قوي، وجماعات حماية العاملين وطرق توصيل يعملون على مدار العقود الخمسة الماضية وزادت فقط على فائدة نظام ميريفيلد الأصلي. اليوم، رائدة في استخدام حماية بوك على أساس وقاعدة / النيوكليوفيل استراتيجية الراتنج شطورة أو Fmoc القائم على حماية والحمضية استراتيجية الراتنج شطورة، من قبل شيبارد RC، هي الأكثر شيوعا لتركيب الببتيدات 1.

مستوحاة من استراتيجية متينة ميريفيلد لدعمها، وضعنا بوك / ثالثي بوتيل استراتيجية تركيب الصلبة مرحلة لتجميع functionalized الببتيدات مكرر الذي يوصف هنا. استخدام تركيب الحالة الصلبة مقارنة تيس حل مراحل منهجية ليست مفيدة فقط في كل من الوقت والعمل كما وصفها ميريفيلد ولكنه يسمح أيضا سهولة أكبر في تركيب مكرر الببتيد المكتبات. توليف أن نظهر هنا يشتمل على مرحلة الانقسام النهائي الذي يستخدم على مرحلتين "سلامة قبض على" آلية لاطلاق سراح functionalized مكرر الببتيد من راتنج بواسطة تشكيل ثنائي كيتوبيرازين.

مكرر الببتيدات الجامدة، وسبيرو، سلم oligomers من مكرر الأحماض الأمينية التي تكون قادرة على وضع وظيفة بطريقة يمكن التنبؤ بها وdesignable، التي تسيطر عليها نوع والفراغية وحدات أحادى، والربط بين كل مونومر. كل حمض أميني مكرر هو محض النمطية، سقالة دوري الذي يحتوي على اثنين من الأحماض الأمينية (حمض الكربوكسيلية مع α-أمين) 3،4. مختبر لدينا حاليا بالتحقيق إمكانات وظيفية مكرر الببتيدات عبر مجموعة واسعة من المجالات بما في ذلك التفاعلات الحفز البروتينات والبروتين، ونanomaterials.

Protocol

1. الإعداد

  1. رد فعل مجموعة المتابعة لتركيب الصلبة مرحلة هي خرطوشة مرشح البولي بروبلين أو مفاعل زجاج متصلة عبر أنابيب البولي بروبلين إلى قارورة مغلقة تصفية تحت فراغ كما هو مبين في الشكل رقم 1. يمكن أن تكون مختلطة في رد فعل من جانب شريط مغناطيسي أو بواسطة فقاعات النيتروجين من خلال المفاعل.
  2. ويوصى أيضا مشعب الغاز متصلة اسطوانة الأرجون مجهزة أنبوب تجفيف والفوار النفط كما يسمح الواردة وعاء التفاعل في مناخ خامل، ويسمح للإزالة من الكواشف من حاويات مختومة.
  3. يتم تنفيذ جميع العمليات في غطاء الدخان ومعدات الحماية الشخصية المناسبة (سلامة النظارات، ومعطف المختبر وقفازات النتريل) هو مطلوب.

2. تحميل أول مكرر الببتيد على الراتنج

  1. وزن 114 ملغ من HMBA-AM الراتنج (0.88 مليمول / ز التحميل، و 100 μmol) في 8 مل عاء التفاعل وإضافة قضيب تحريك مغناطيسي. سقف أعلى من السفينة البريد مع الحاجز المطاطي وتطهير الأنبوب مع الأرجون مدة لا تقل عن 5 دقائق.
  2. في غضون ذلك، تزن 117،3 ملغم من مركب 1 من الشكل (3) (586.63 غ / مول، 2eq) و 59.2 ملغ من 1 - (mesitylene-2-السلفونيل)-3-نيترو-1-،2،4 الترايازول (MSNT، 296.0 ز / مول، 2eq) في أنبوب 15 مليلتر الطرد المركزي يمكن التخلص منها، وتذوب في ثنائي كلورو ميثان 2 مل اللامائية (DCM). إضافة 24 ميكرولتر من methylimidazole-1 (NMI، 80.81 مل / مول، 3eq) إلى حل والمزيج حتى يذوب تماما.
  3. نقل حل المنشط في وعاء التفاعل عن طريق حقنة والسماح لاثارة بين عشية وضحاها تحت الأرجون (10 ساعة ~).
  4. إزالة الحاجز واستنزاف خليط التفاعل. غسل الراتنج مع DCM (5X)، وثنائي ميثيل (DMF) (5X). إجراء "اختبار أحمر الميثيل" وصفها في القسم 10.1 إلى تقييم درجة التحميل الراتنج. إذا كان لا يزال راتنج حمراء خلال الميثيل أحمر اختبار الخطوات ثم ينبغي تكرار 2.2 و 2.3. اللون الأصفر، يدل على اختبار الميثيل أحمر السلبية، هو الذي تفضله.ومع ذلك، قد توج منذ سيتم أي مجموعة الهيدروكسيل المتبقية في الخطوة التالية، نتيجة ايجابية قليلا (ضوء برتقالي اللون الراتنج) تكون مقبولة.

3. Deprotection الأولى من الراتنج مكرر الببتيد في وقت واحد والسد

  1. إضافة 1 مل من DCM إلى وعاء التفاعل ثم يضاف 1 مل بروميد الهيدروجين بنسبة 33٪ في قطرة قطرة حامض الخليك أكثر من 30 ثانية (محتدما يحدث) والسماح لاثارة لمدة 15 دقيقة. يصفى ويغسل الراتنج مع DCM (5X) ثم كرر العملية مرة واحدة أكثر.
  2. غسل الراتنج مع DCM (5X) ثم DMF (5X). تحييد الراتنج بواسطة غسل مرتين مع حلا V / V 5٪ من N، N-diisopropylethylamine (DIPEA) في DMF ثم تغسل مع DCM (5X) و DMF (5X) مرة أخرى. إجراء "اختبار الميثيل أحمر" و "الكلورانيل اختبار" التي نوقشت في القسم 10.1 و 10.2. وينبغي أن تكون النتائج سلبية بالنسبة لأحمر الميثيل اختبار وايجابية لاختبار الكلورانيل.

4. اقتران بوك / TBU محمية Functionalized مكرر عاميلا حمض

  1. إعادة جو خامل إلى الراتنج التي تحتوي على سفينة رد فعل من قبل الغسيل ثلاث مرات مع DCM اللامائية نعلق بعد ذلك الحاجز والخط الأرجون. تطهير وغسل الإناء بإضافة مل 1-2 من DCM اللامائية والسماح بالحركة لمدة 30 ثانية ثم تجفيف السفينة حتى خط الأرجون الفوار يبدأ في الارتفاع. القيام بذلك على الأقل مرة واحدة أكثر.
  2. يعد حل من 0.15 متر functionalized مكرر الحمض الأميني (3eq) و 245 ملغ من 1-هيدروكسي azabenzotriazole-7 (هوات، 136.11 غ / مول، 18eq) في 2 مل من 02:01 DCM: DMF في اختبار لهب المجففة أنبوب تحت جو الأرجون. إضافة 47 ميكرولتر من diisopropylcarbodiimide (مدينة دبي للإنترنت، 156.6 مل / مول، 3eq) ويحرك لمدة 90 دقيقة.
  3. إضافة 35 DIPEA ميكرولتر (174.19 مل / مول، 2eq) في DMF اللامائية 666 ميكروليتر إلى الراتنج والسماح لاثارة لمدة 5 دقائق.
  4. نقل ما قبل المنشط حل حامض مكرر الأمينية إلى السفينة رد فعل عن طريق الحقن، والسماح لاثارة بين عشية وضحاها.
  5. استنزاف خليط التفاعل وتغسل مرتين مع DCM اللامائية في حين تحت الأرجون.
  6. للترويج لإغلاق ثنائي كيتوبيرازين، إضافة إلى حل M 0،25 من هوات (136.11 جم / مول، 10eq)، ومدينة دبي للإنترنت (156.6 مل / مول، 10eq) في مل 4 من DCM 01:01: DMF، والسماح لاثارة تحت الأرجون لمدة 1 ساعة.
  7. إزالة الحاجز واستنزاف خليط التفاعل. غسل الراتنج مع DCM (5X) و DMF (5X). اذا شئت، نفذ "اختبار الكلورانيل" التي نوقشت في القسم 10.2.

5. Deprotection من بوك / TBU محمية حمض أميني مكرر Functionalized

  1. إضافة 2 مل من محلول حامض trifluororacetic 95:5 (TFA): triisopropylsilane (نصائح) إلى وعاء التفاعل والسماح لها إثارة لمدة 1 ساعة. يصفى ويغسل الراتنج لنحو 30 ثانية مع DCM (5X) ثم كرر العملية مرة أخرى.
  2. غسل الراتنج مع DCM (5X) ثم DMF (5X). تحييد الراتنج بواسطة غسل مرتين مع حلا V / V 5٪ من DIPEA في DMF ثم يغسل DCM (5X) و DMF (5X) مرة أخرى. اذا شئت، نفذ "اختبار الكلورانيل" التي نوقشت في القسم 10.2.
جنيه "كرر الخطوات من 6>. 4 و 5 على النحو المرغوب فيه لتجميع استهدفت مكرر الببتيد.

7. Functionalizing نهاية Prolidine مكرر الببتيد

  1. ويمكن acylated نهاية prolidine من الببتيد مكرر متزايد بشكل مستقل أو معا من خلال ثنائي كيتوبيرازين. أيضا، يمكن ترك هذه الغاية المحمية، والتي سيتم المشقوق الأخيرة، والتي تمنح مجانا حمض أميني. اذا شئت، نفذ "اختبار الكلورانيل" التي نوقشت في القسم 10.2 لتقييم كفاءة توصيل.

8. Deprotection من Fmoc وأسيلة النهاية الرباعية للمكرر الببتيد

  1. يضاف محلول 2mL من تأكسد 20٪ في DMF ويتم خلط رد فعل لمدة 20 دقيقة. يصفى ويغسل الراتنج مع DMF (5X) ثم كرر العملية مرة أخرى.
  2. غسل الراتنج مع DCM (5X) ثم DMF (5X).
  3. يعد حل 0.15 متر من الأحماض الأمينية (3eq) في 2 مل من N-methylpyrrolidone (NMP) مع 114 ملغ 2 - (7-عزة-1H-benzotriazole-1-يل) -1،1،3،3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU، 380.2 غرام / مول، 3eq) و 104.5 DIPEA ميكرولتر (174.19 مل / مول، 6eq) وتخلط جيدا. إضافة إلى سفينة رد فعل، والسماح لاثارة لمدة 6 ساعات.
  4. غسل الراتنج مع DCM (5X) ثم DMF (5X).

9. إزالة المجموعة بوك من الراتنج منضم الأحماض الأمينية وكليف من الراتنج

  1. إضافة 2 مل من TFA 01:01: DCM حل في وعاء التفاعل والسماح لاثارة لمدة 30 دقيقة. يصفى ويغسل الراتنج مع DCM (5X) ثم كرر العملية مرة واحدة أكثر.
  2. غسل وتجفيف الراتنج لمدة 30 ثانية مع DCM (5X) ثم DMF (5X).
  3. إضافة 2 مل من محلول DIPEA 10٪ في DMF اللامائية، والسماح لاثارة 24-48 ساعة.
  4. جمع خليط التفاعل إلى ما قبل جولة وزنه قارورة أسفل. نقل 30 ميكرولتر من هذا الحل إلى 450 ميكرولتر من THF في قارورة LC-MS وتقديمها للتحليل. غسل الراتنج مع aliquots إضافية من DMF وجمع في قارورة أسفل جولة ثم إزالة المذيب في الخلاء.
dflinebreak ">

10. تنقية مكرر الببتيد

  1. حل الخام مكرر الببتيد في الحد الأدنى من سلفوكسيد ميثيل (100-250 ميكرولتر) ونقل إلى إدراج قارورة HPLC. يضاف إلى مكان الاوتوماتيكى من نظام HPLC شبه prepitive (هيوليت باكارد 1100 سلسلة) مجهزة الإعدادية إكستيرا MS C18 عمود ميكرون 5 مم 7.8x150 و 100 حلقة حقن ميكرولتر.
  2. نفذ عدة عمليات الحقن 50 ميكروليتر من العينة باستخدام برنامج التدرج من الأسيتونيتريل 5-95٪ في الماء مع حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ على مدى 30 دقيقة في حين رصد في 274 نانومتر. جمع ذروة منتج في أنبوب الطرد المركزي وزنه قبل التخلص منها وتجميد الجافة باستخدام lyophilizer. وينبغي اتخاذ الحذر مع الجولة الأولى تحولا طفيفا في وقت الذروة مقارنة مع الاحتفاظ LCMS التحليلية ويلاحظ عادة.

11. تقييم طرق

  1. اختبار حمرة الميثيل 7: إزالة ~ 1 ملغ من الراتنج الجافة عن طريق ماصة للتصرف وشطف الى 4 عاء التفاعل مل. إضافة إلى حل من 20 أحمر الميثيل ملغ، 50 N ميكرولتر، N'-diisopropylcarbodiimide (DIC)، و 5 ملغ 4-dimethylaminopyridine (DMAP) في DCM 500 اللامائية ميكرولتر والسماح لاثارة ل5-10 دقيقة. يصفى ويغسل الراتنج مع DCM حتى يصبح عديم اللون الترشيح. إشارة إيجابية هي حبات راتنج المتبقية البرتقالي أو الأحمر.
  2. الكلورانيل اختبار (12): نقل ~ 1 ملغ من الراتنج الجافة إلى قارورة صغيرة من خلال ماصة للتصرف. إضافة 3 قطرات من كل من الكلورانيل 0.8 مم في حل DMF والأسيتالديهيد 2٪ في حل DMF وترك الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقائق. إشارة إيجابية هي حبات راتنج تحول أزرق / أرجواني.
  3. ويمكن تقييم المركبات المنشطة خلال التوليف عن طريق تحويل مبلغ صغير (ميكرولتر 5-10) من الحل تفعيلها لقياس الطيف اللوني الشامل السائل (LC-MS) قارورة تحتوي على 50 ميكرولتر من بيروليدين: تنشيط اختبار الفخ. مزيج من جهة لبضع ثوان (solutiوينبغي أن تصبح في الأصفر) ثم تضعف مع 450 ميكرولتر من رباعي هيدرو الفوران (THF)، ويقدم لLC-MS تحليل.
  4. التحليلية LC-MS: يمكن تقييم المنتج النهائي وسيطة المنشط باستخدام سلسلة HP 1200 LC-MS نظام مجهزة إكستيرا مياه ميكرومتر MS 3.5 C18 4.6 مم × 150 مم وعمود نظام التدرج من الأسيتونيتريل 5-95٪ في الماء مع حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ على مدى 30 دقيقة.

12. ممثل النتائج

على سبيل المثال كل من النفط الخام (الشكل 4) وتنقيته (الشكل 5) وتقدم آثار LCMS. ومن المتوقع أن غلة تنقيته من حوالي 10٪ باستخدام الأساليب المذكورة أعلاه.

الشكل 1
الشكل 1. مخطط من التجارب ما يصل تعيين لتخليق المرحلة الصلبة.

الشكل 2
الشكل 2.ذات الصلة من جدول التعريفة مكرر الأحماض الأمينية / هضميدات مكرر.

الشكل (3)
الشكل 3. خطة الاصطناعية بشكل عام. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

رقم 4A
رقم 4A. HPLC تتبع من الناتج الخام في 274 نانومتر.

رقم 4B
رقم 4B. MS الطيف من قمة المنتج الخام.

رقم 5A
5A شخصية. HPLC أثر لتنقية المنتج في 274 نانومتر.

الرقم 5B
5B شخصية. MS الطيف من المنتج منقىتي الذروة.

Discussion

نهج الاصطناعية الواردة في هذه الوثيقة يوفر طريقة لتجميع functionalized الببتيدات مكرر من مكررا الأمينية اللبنات باستخدام حمض مشترك الببتيد التوليف الصلبة مرحلة التقنيات. التوليف الأحادي من هذه "Pro4" لبنات البناء من غير المشبعة-4-3 هو هيدروكسي برولين تدرجية عالية، وقد أنجزت بنجاح إلى مرحلة هيدانتوين في مليمول 600 (234 ز) جدول (غير منشور). مرة واحدة أحادية هي في متناول اليد، واستخدام التقنيات الصلبة مرحلة يوفر طريقة أسرع للمكرر الببتيد التوليف من منهجيتنا حل في المرحلة الحالية 4 من خلال القضاء على الحاجة الى رد فعل العمل المنبثقة والتنقيات وسيطة.

التحدي الرئيسي في تركيب الحالة الصلبة يتم تشخيص التقدم الصناعي وحل المشاكل منذ يتم عزل أي وسيطة. هذا قد يؤدي إلى تطوير اختبارات لونية كثيرة بما فيها تلك التي لتحديد ما إذا كانت حرة الأمينات (كايزر اختبار 10) أو hydrox مجاناويتعرض yls (الميثيل الأحمر اختبار 7) على الراتنج. لسوء الحظ، فإن اختبار كايزر استخداما 10 لا ينطبق عموما في تركيب الصلبة مرحلة لدينا نتيجة لاستخدام الحصري تقريبا من الأمينات الثانوية أو الأمينات تعلق على الكربون الرباعية. خيارات أخرى للتقييم في الراتنج HMBA تشمل الانشقاقات اختبار باستخدام النيوكليوفيل مثل الهيدرازين 11، شق Fmoc كمي ترصدها أشعة فوق البنفسجية / فيس 1،11، ومحاصرة وتحليل مركبات واردة تفعيلها.

وثمة مسألة أخرى تجاهلها في تركيب الحالة الصلبة هي طبيعة متكررة من الخطوات الاصطناعية مطلوب من قبل المشغل. مع هذا هو العقل، والكتاب نوصي بشدة استخدام جدول بيانات أو قائمة عند تنفيذ أي دليل الببتيد التوليف الصلبة مرحلة.

وصعوبة في استخدام مكرر الببتيدات لتركيب الحالة الصلبة مقارنة مع الأحماض الأمينية α مشتركة تشمل احتمال حدوث الإزدواج أكثر صعوبة بسبب هين الفراغيةdrance، والحاجة إلى إغلاق ثنائي كيتوبيرازين على الراتنج، وdeprotections في وقت واحد (بوك / TBU؛ CBZ / TBU). آخر صعوبة تكمن في تحقيق الافراج عن كمية من راتنج استخدام هذا "الصيد سلامة" طريقة بالمقارنة مع الوسائل التقليدية. مع هذه العوامل في الاعتبار، فمن الممكن جدا أنه لا يمكن تحقيق مزيد من التحسين هذه الطريقة والجهود الحالية تجري في مجموعتنا لتحسين أسلوب المقدمة هنا.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور زاكاري Z. براون وAlleva جينيفر لتطوير هذه التقنية الأولى من مرحلة التوليف الصلبة وماثيو باركر فلوريدا لاجراء مناقشات مفيدة. ويدعم هذا العمل من قبل وكالة الدفاع للحد من التهديد (وزارة الدفاع، اثناء اجتماع السلطة) (HDTRA1-09-1-0009) وجائزة هورست زمالة يتزل بدعم من سيفالون، وشركة

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HMBA-Am Resin Novabiochem, EMD Millipore 855018
MSNT Novabiochem, EMD Millipore 851011
NMI Sigma-Aldrich 336092 Toxic, Corrosive
DCM Sigma-Aldrich D65100 Carcinogenic
Anhydrous DCM Acros Organics 34846 Carcinogenic
33% Hydrogen Bromide in Acetic Acid Sigma-Aldrich 248630 Toxic, Corrosive, Fumes when open
DIPEA Sigma-Aldrich 387649 Flammable, Toxic, Corrosive
DMF Fisher Scientific AC27960 Flammable, Toxic
Anhydrous DMF Acros Organics 34843 Flammable, Toxic
HOAt GenScript C01568
DIC Acros Organics BP590 Flammable, Toxic, Corrosive
TFA Sigma-Aldrich T6508 Toxic, Corrosive
TIPS Acros Organics 21492 Flammable, Toxic
Piperidine Sigma-Aldrich 104094 Flammable, Toxic, Corrosive
HATU GenScript C01566 Toxic
NMP Acros Organics 36438 Toxic
DMAP Novabiochem, EMD Millipore 851055 Toxic
Methyl Red Sigma-Aldrich 250198
THF Sigma-Aldrich 401757 Flammable, Toxic, Peroxide Forming
Pyrrolidine Sigma-Aldrich P73803 Flammable, Toxic, Corrosive
Dimethyl Sulfoxide Fisher Scientific D1281
SPPS Reaction Vessels Grace 211108
LCMS Agilent Technologies 1200 Series
Semi-Prep LC Hewlett-Packard 1100 Series
Lyophilizer Labconco Corp. 7934027
Rotovapor Buchi R-210 Series
Argon Airgas AR PP300CT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Atherton, E., Sheppard, R. C. Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. Oxford University Press. (1989).
  2. Brown, Z. Z., Alleva, J., Schafmeister, C. E. Solid-Phase Synthesis of Functionalized Bis-Peptides. Biopolymers. 96, 578-585 (2010).
  3. Schafmeister, C. E., Brown, Z. Z., Gupta, S. Shape-Programmable Macromolecules. Acc. Chem. Res. 41, 1387-1398 (2008).
  4. Brown, Z. Z., Schafmeister, C. E. Synthesis of Hexa- and Pentasubstituted Diketopiperazines from Sterically Hindered Amino Acids. Org. Let. 12, 1436-1439 (2010).
  5. Nielson, J., Lyngso, L. O. Combinatorial Solid-Phase Synthesis of Balanol Analogues. Tet. Lett. 37, 8439-8442 (1996).
  6. Blankemeyer-Menge, B., Nimtz, M., Frank, R. An Efficient Method for Anchoring Fmoc-Amino Acids to Hydroxyl-Functionalized Solid Supports. Tet. Lett. 31, 1701-1704 (1990).
  7. Komba, S., Sasaki, S., Machida, S. A New Colorimetric Test for Detection of Hydroxyl Groups in Solid-Phase Synthesis. Tet. Lett. 48, 2075-2078 (2007).
  8. Demner, O., Dijkgraaf, I., Schottelius, M., Wester, H. J., Kessler, H. Introduction of Functional Groups into Peptides via N-Alkylation. Org. Lett. 10, 2015-2018 (2008).
  9. Plas, S. E. V. ander, Van Hoeck, E., Lynen, F., Sandra, P., Madder, A. Toward a New SPE Material for EDCs: Fully Automated Synthesis of a Library of Tripodal Receptors Followed by Fast Screening by Affinity LC. Eur. J. Org. Chem. 11, 1796-1805 (2009).
  10. Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in Solid-Phase Synthesis of Peptides. Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970).
  11. Chan, W. C., White, P. D. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. Oxford University Press. (2000).
  12. Vojkovsky, T. Detection of Secondary Amines on Solid-Phase. Peptide Research. 71, 236-237 (1995).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics