NADH Fluorescens avbildning av isolerade biventrikulär Arbeta kaninhjärtan

Medicine
 

Summary

Målet är att övervaka den mitokondriella redoxtillstånd av isolerade hjärtan inom ramen för fysiologiska preload och tryck afterload. En biventrikulär arbetar kaninhjärta modell presenteras. Hög upplösning Spatiotemporal fluorescensavbildning av NADH används för att övervaka den mitokondriella redoxtillstånd av epikardial vävnad.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Asfour, H., Wengrowski, A. M., Jaimes III, R., Swift, L. M., Kay, M. W. NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts. J. Vis. Exp. (65), e4115, doi:10.3791/4115 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Sedan starten av Langendorff 1, förblir isolerat perfunderade hjärtat en framstående verktyg för att studera hjärtats fysiologi 2. Det är dock inte väl lämpade för studier av hjärt-metabolism, som kräver att hjärtat att utföra arbete inom ramen för fysiologiska preload och tryck afterload. Neely infördes ändringar i Langendorff tekniken att upprätta lämpliga vänster kammares (LV) preload och tryck afterload 3. Modellen är känd som det isolerade LV arbetande hjärta modell och har använts i stor utsträckning för att studera prestandan LV och metabolism 4-6. Denna modell är emellertid inte tillhandahåller en korrekt laddad högra ventrikeln (RV). Demmy et al. första rapporterade en biventrikulär modell som en modifiering av LV arbetande hjärtat modell 7, 8. De fann att slagvolymen, hjärtminutvolym och tryck utveckling förbättras i hjärtat omvandlats från att arbeta LV läge till biventrikulär arbetsläge 8 8.

När man studerar de metaboliska effekterna av myokardial skada, såsom ischemi, är det ofta nödvändigt att identifiera platsen för den påverkade vävnaden. Detta kan göras genom avbildning av fluorescens av NADH (den reducerade formen av nikotinamidadenindinukleotid) 9-11, funnet ett koenzym i stora mängder i mitokondrierna. NADH fluorescens (fNADH) visar en nära linjärt omvänt förhållande med lokala syrekoncentrationen 12 och tillhandahåller ett mått på mitokondriell redoxtillstånd 13. fNADH avbildning under hypoxiska och ischemisk förhållanden har använts som en dye-fri metod för att identifiera hypoxiska regioner 14, 15 och övervaka utvecklingen avhypoxiska förhållanden över tiden 10.

Syftet med metoden är att övervaka den mitokondriella redoxtillstånd av biventrikulär arbetande hjärtan under protokoll som förändrar graden av myocyt metabolism eller inducera hypoxi eller skapa en kombination av båda. Hjärtan från nyzeeländska vita kaniner var anslutna till en biventrikulär arbetar hjärtsystem (Hugo Sachs Elektronik) och perfuserades med modifierad Krebs-Henseleit-lösning 16 vid 37 ° C. Aorta, LV, lungartären och vänster och höger förmaks tryck har registrerats. Elektrisk aktivitet mättes med användning av en monofasisk elektrod aktionspotential. Att avbilda fNADH tillsattes ljus från en kvicksilverlampa filtrerades (350 ± 25 nm) och används för att belysa epikardium. Emitterat ljus filtrerades (460 ± 20 nm) och avbildades med användning av en CCD-kamera. Förändringar i epikardiella fNADH av biventrikulär arbetande hjärtan under olika stimuleringsfrekvenser presenteras. Kombinationen av hjärtat modellen och fNADH avbildningtillhandahåller en ny och värdefull experimentella verktyg för att studera akuta hjärtsjukdomar patologier i samband med realistiska fysiologiska betingelser.

Protocol

1. Ställa upp för studien

  1. Beredning av fyra liter modifierad Krebs-Henseleit-lösning 16 (i mM: 118 NaCl, 3,30 KCI, 2,00 CaCl2, 1,20 MgSO 4, 24,0 NaHCOa 3, 1,20 KH 2 PO 4, 10,0 glukos, 2,00 NaPyruvate och 20,0 mg / L albumin ). Lösningen skall framställas så nära början av experimentet som möjligt. PH bör justeras till 7,4 efter steril filtrering (porstorlek: 22 ^ m, Corning). Lösningen osmolaliteten bör vara mellan 275 och 295 mOsm / kg.
  2. Skölj alla rör och kamrar i arbetsgruppen hjärtat systemet med renat vatten. Kör pumpar tills allt vatten har tagits bort från systemet.
  3. Lägg till filter cellulosa membran (porstorlek: 5 pm, Advantec) i linje med var och en av perfusion pumpar (Langendorff perfusion pump, hjärtats vänstra perfusion pump, och just hjärtat perfusion pump).
  4. Utföra en tvåpunktskalibrering (0 och 60 mm Hg) för varje trycksensor.
  5. Sätt på vattenbad. En uppvärmd cirkulerande vattenbad (Cole Palmer) används för att värma de vatten-mantlade rör och värmeväxlare. Perfusatet förvärms i en separat vattenbad (Oakton Instruments). Båda baden sättes för att bibehålla en lösningstemperatur av 37 ° C.
  6. Slå på de pumpar för att cirkulera perfusatet i en sluten slinga. Perfusatet passerar genom mikrofibrer oxygenatorer (hemofilters) gasades med 95% O2 och 5% CO2 vid 80 kPa. Syresatt perfusat strömmar sedan genom värmeväxlare för att bibehålla den vid en temperatur av 37 ° C innan den kommer in i hjärtat kanyler.

2. Hjärta Excision

  1. Börja med att ställa in att arbeta hjärtat systemet att fungera i konstant tryck Langendorff läge. Ställa in trycket i aorta blocket inom intervallet 50 till 60 mm Hg.
  2. Bedöva kanin med en intramuskulär injektion av ketamin (44 mg / kg) och xylazin (10 mg / kg). Efter kanin är Proceduren pentobarbital (50 mg / Kg) och heparin (2000 U) injicerades intravenöst via den marginella öronvenen eller den laterala vena saphena på insidan av bakbenet.
  3. När kanin är fullständigt icke-responsiva, såsom bestämdes genom avsaknad av smärta reflexen, är brösthålan snabbt öppnas, hjärtsäcken skivats aortan fastklämd, och i hjärtat och lungorna excideras. Vid denna tidpunkt lungorna ska sitta kvar till hjärtat att hjälpa till med att isolera de lungvenerna.
  4. Isolera och kanylera aortan med en 5 mm diameter kanyl som är fastsatt till en spruta fylld med 60 ml perfusat och 200 enheter heparin. Fäst aorta till kanylen med storlek noll silkesutur och långsamt trycka sprutan att spola hjärtat av blod.

3. Biventrikulär Kanylering

  1. Ansluta hjärtat till aortablocket av den arbetande hjärta systemet. Förhindra luft från att inträda i aortan, vilket kan orsaka koronar emboli. Det är bäst att fästa kanylen till aorta blOck som närmar sig aorta kontakten i en sned vinkel och låta perfusat försiktigt droppa från kontakten i kanylen när den är ansluten.
  2. Medan hjärtat perfunderas i konstant tryck Langendorff läge, ta bort fett och bindväv och leta reda på följande fartyg: lägre och övre hålvenen, azygos ven, lungartären, lungvenerna.
  3. Ligera den övre hålvenen. Skär lungartären strax under, där den grenar till de högra och vänstra lungartärerna.
  4. Gruppera alla de återstående fartygen (de lungvenerna) mellan hjärtat och lungorna och ligera dem alla använder en sutur. Ta bort lungorna.
  5. Skär ett litet hål i hörnet av vänster förmak bihang. Se till att LA är fylld med perfusat. Kanylera LA samtidigt som kanylen helt fylld med perfusatet när det sitter. Suturera kanyl till LA bihanget.
  6. Slå på den vänstra sidan pumpen (pump # 2) för att åstadkomma flöde till than lämnade atrium. Ställa förspänning tryck mellan 2 till 6 mm Hg och justera ± 2 mmHg, såsom bestämts genom förmaks dilatation.
  7. Växla hjärtat till arbetsgruppen hjärtat läget genom att stänga av Langendorff pumpen (pump # 1).
  8. Momentant minska aortatrycket till 10 mm Hg och därefter långsamt öka den till inom intervallet från 80 till 100 mmHg. Detta gör det möjligt aortaklaffen för att öppna och fungera som det skulle under normala fysiologiska betingelser. Den slutliga efterbelastning tryck kommer att bero på kontraktiliteten hos LV. Det bör sättas till ett värde som är ungefär 20 mmHg lägre än högsta LV trycket.
  9. LV hjärtminutvolym kan bestämmas genom mätning av flödeshastigheten av perfusat som lämnar aortablocket (ml / min). Normalt hjärtminutvolym är mellan 14,77 och 16,43 ml / min per 100 g kroppsvikt 17 och medelvärden 340 ml / min för en 2,2 kg kanin. Aortatrycket bör likna trycksignalen som visas i figur 1.
  10. Kanylera RA genom Inferior hålvenen. Säkerställa att både RA och kanylen är helt fylld med perfusatet och för in en kanyl under förhindrande av bildning av luftbubblor. Suturera kanylen till venen.
  11. Slå på den högra sidan pumpen (pump # 3) för att ge flöde till det högra förmaket. Ställa in trycket till cirka 3 mm Hg.
  12. Säkerställa att RV är fylld med perfusatet och kanylera lungartären. Säkerställa att kanylen är helt fylld med perfusatet medan den är införd för att förhindra att luftbubblor. Suturera kanylen till lungpulsådern.

4. Signal Förvärv: tryck, Monofas potentialer Action och fNADH

  1. När biventrikulär kanylering är klar försiktigt in katetern tryckgivaren (Millar) i aorta via aortan kanylen. Försiktigt navigerar förbi aortaklaffen och in i LV. Övervaka LV trycksignalen för att säkerställa korrekt positionering av kateterspetsen. Ett exempel på LV-tryck visasi figur 1.
  2. Tryck försiktigt monofasiska elektroden aktionspotentialen mot ventrikulär epikardiet. Övervaka signalen för att åstadkomma lämpliga mätningar aktionspotential. Svag rörelseartefakt i signalen är normal.
  3. Placera en bipolär elektrod stimulus på det högra förmaket för att stimulera hjärtat. I vår protokollet var hjärtan tempo vid cykel längder mellan 300 och 150 msek, vilket motsvarar 200 och 400 slag per minut, respektive.
  4. Mäta temperaturen hos LV epikardiella ytan. Om studien förutsätter att temperaturen bibehålls vid 37 ° C, varefter positionera kärnan inuti en vattenmantlad hjärtkammaren eller doppa kärnan i en uppvärmd superfusate bad för att vidmakthålla en konstant temperatur genom hela hjärtat.
  5. Placera CCD-kamera (Andor iXon DV860, 128x128 pixlar) och fokusera linsen så att en lämplig synfält iakttas. Kameran är ansluten till en arbetsstation och bilder förvärvas vid 2 fps med Andor SOLIS software.
  6. Slå på kvicksilverlampa ljus före starten av avbildning. Ljus riktas genom ett excitationsfilter (350 ± 25 nm, Chroma Technology) och in i en fiberoptisk ljusledare (Horiba Jobin Yvon modell 1950-1M) för att belysa ytan av hjärtat. Dämpningen av UV-ljus genom ljusledaren är liten. UV-belysning kan även vara försedd med användning av en hög effekt LED-system bestående av LED-strålkastare (Mightex PLS-0365-030-S) och en styrenhet (Mightex SLC-SA04-US).
  7. Stäng av rumsbelysning och minimera omgivande belysning. Rikta hylsor av ljusledaren (eller LED strålkastare) i hjärtat för att uppnå jämn epikardiell belysning. Utsänds NADH fluorescens (fNADH) passerar genom ett emissionsfilter (460 ± 20 nm Chroma Technology) och avbildas av CCD-kameran.
  8. Övervaka fNADH förändringar över tiden genom att välja en region av intresse med användning av avbildning mjukvara. Välj levande uppdatera läget för att övervaka den genomsnittliga pixelintensiteten inom regionen of intresse.
  9. Hjärtat ska fungera i biventrikulär arbetsläge för att skapa lämpliga tryck. fNADH nivåer bör vara låg och stabil över epikardiella ytan för att bekräfta tillräcklig koronar genomblödning. Vid denna punkt i studien en viss experimentell protokoll bör genomföras för att testa en hypotes.
  10. När studien är klar, ta bort hjärtat från systemet och tappa ur allt perfusat. Skölj systemet slangen och kamrarna med renat vatten. Rutinmässigt underhåll, bör systemet vara periodiskt sköljas med Mucasol lösning eller en utspädd väteperoxidlösning, efter behov.

5. Off-line behandling av fNADH bilder

  1. Ett sätt att jämföra NADH datauppsättningar (fNADH (i, j, t)) mellan försöken är att normalisera varje fluorescensbild med användning av en referensbild (fNADH (i, j, t 0)) från den datamängd 9, såsom visas i ekvationen nedan . Ett annat sätt att normalisera NADH fluorescens är till PLess en liten bit av uranyl glas i synfältet före experimentet 9, 18, ​​19. Uranyl glas kommer fluorescensen (450 - 550 nm) när den belyses med UV-ljus för att åstadkomma en signal som kan användas som en stabil referens.

Ekvation 1

6. Representativa resultat

Främre och basala vyer av en biventrikulär arbetar kaninhjärta beredning visas i Figur 1. Vänstra ventrikulära trycket mättes genom att navigera en kateter tryckomvandlare (Millar SPR-407) förbi aortaklaffen och in i den vänstra ventrikeln. Aorta, lungartären, och vänstra ventrikulära tryck (LVP) visas i figur 1C. Diastoliskt LVP är vanligtvis mellan 0 och 10 mmHg. Det minsta diastoliska aortatrycket är cirka 60 mmHg. Peak systoliskt LVP är beroende av fyllnadstryck (förspänningen eller LA tryck) och kontraktilitetoch, optimalt, bör vara mellan 80 och 100 mmHg. Det maximala aortatrycket och maximal LVP bör noga matchen, som visas i figur 1C.

Monofasiska verkningspotentialer (MAPS) med en snabb depolarisering fas och en fas repolarisering som är typiska för kaninhjärtan visas i Figur 1D. Kartor kan spelas relativt enkelt från en upphandlande hjärta men har vanligtvis liten rörelseartefakt under diastole, som visas i figur 1D. Kartor är användbar för att bekräfta framgångsrikt indragning av hjärtat (capture) under stimulering och kan även användas för att mäta lokala elektrofysiologiska förändringar på grund av ischemi eller andra akuta störningar. En EKG kan också mätas genom att sänka ned hjärtat i ett bad av varm superfusate och placera en elektrod i badet på de vänstra och högra sidan av hjärtat. En tredje neutral elektrod är antingen placerad i badet, bort från hjärtat, eller är bunden till aortan.Ett EKG kommer att tillhandahålla information angående den globala excitation och repolarisation process, som är användbart för utvärdering av total elektrisk funktion och för att avslöja närvaron av ischemi.

fNADH avbildning avslöjar förändringar i den mitokondriella redoxtillstånd av hjärtat, som kan användas för att mäta Spatiotemporal progressionen av ischemiska eller hypoxiska regioner. För denna studie epikardiell fNADH uppmättes till övervaka förändringar i redox tillstånd under tre stimuleringsfrekvenser vid cykellängder (CLS) på 300, 200 och 150 ms. Genomsnittliga fNADH värden från ett område av intresse (röd ruta, figur 2) visar att grundläggande fNADH nivåerna ökar när cykeln längd förkortas. När stimuleringsfrekvensen ligger nära sinusrytm (CL = 300 ms) baslinjen fNADH nivå är relativt konstant. Som cykellängd förkortas under 300 msek, baslinjen fNADH nivåerna ökar, med den största ökningen på kortaste CL (150 msek). Högupplösande fNADH avbildning av hela främre ytavid 200 och 400 slag per minut, visas i figur 3. fNADH nivåer vid 200 slag per minut var konstant och rumsligt homogen. Vid 400 bpm, ökade fNADH nivåer betydligt över hela epikardiet. Betydande rumslig heterogenitet observerades med de största ökningarna sker inom septala regioner RV och LV.

Den fNADH signalen svänger med sammandragning (rörelseartefakt) och frekvensen av svängningen motsvarar hjärtfrekvens (figur 2). I biventrikulär kanylering, är basen hos hjärtat som innehas av 4 kanyler, vilka hjälper till att förhindra att kärnan från att svänga under kontraktion. Därför är svängningsamplitud alltid mindre än längre tidsperspektiv (5-10 sek) trender fNADH som orsakas av ischemi eller hypoxi.

Figur 1
Figur 1. Typiska tryck och monofasiska möjligheter åtgärder från en isolerad biventrikulär arbetar RABBIT hjärtat. A. Basal vy av hjärtat som visar fyr kanyler: 1, aorta; 2, lungartären; 3, vänster förmak; och 4, det högra förmaket B. Främre vy av hjärtat som visar den vänstra ventrikeln (LV) och den högra ventrikeln. (RV). C. Representativa tryck. Topp: vänster ventrikulärt tryck (heldragen linje) och aortatrycket (streckad linje). Nederst:. Pulmonary trycket D. Representativa monofasiska aktionspotentialer. Signalen är i linje med de påfrestningar som visas i panelen C. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2
Figur 2. fNADH avbildning av en isolerad biventrikulär arbetar kaninhjärta. Överst: en tecknad film av synfältet (vänster) och tre fNADH bilder visas. Motsvarande pacing cykellängd (CL) anges på varje bild.Området av intresse för fNADH signalen i den nedre panelen indikeras av röd ruta. Spetsen av den monofasiska aktionspotentialen elektroden ses till höger om det intressanta området. Epikardium belystes med kvicksilverlampa och ljusledare, såsom visas i figur 5. Endast epikardiella ytan som omger regionen av intresse var upplyst Nederst:. Genomsnittlig fNADH för regionen av intresse indikeras av den röda rutan i övre panelen. Genomsnittlig fNADH ökar med minskad cykellängd.

Figur 3
Figur 3. fNADH bilder av hela främre ytan av en isolerad biventrikulär arbetar kaninhjärta. Hjärtat var tempo från RA vid 200 bpm och 400 bpm. fNADH avbildades (2 fps, 128x128 pixlar och en upplösning på 0,4 mm) medan belysa hela främre epikardium med två lysdioder med hög effekt (Mightex PLS-0365-030-S, 365 nm, 4% intensity, 50 mW max).

Discussion

Den isolerade Langendorff perfunderade hjärtat fortfarande ett framstående verktyg för att studera hjärtats fysiologi 2. Det är speciellt användbart i studier av hjärtarytmier, i synnerhet de som använder fluorescerande avbildning av transmembranpotentialen 20. En fördel är att hela epikardium hos det isolerade hjärtat kan observeras 21, 22. En annan fördel är att, i motsats till blod, inte perfusion med en klar kristalloid buffertlösning inte störa fluorescenssignaler. En begränsning är att Langendorff tekniken inte är väl lämpad för studier av hjärt-metabolism, som ofta kräver hjärtat att utföra arbete inom ramen för fysiologiska preload och tryck afterload.

Att höja relevansen av isolerade hjärta förberedelserna för metaboliska studier, Neely infördes ändringar i Langendorff tekniken för att fastställa lämpliga vänster kammares (LV) preload och tryck afterload 3.Modellen är känd som det isolerade LV arbetande hjärta modell och har använts i stor utsträckning för att studera prestandan LV och metabolism 4-6. LV arbetar hjärtat modell är överlägsen den Langendorff modell för funktionella utvärderingar, men det ger inte en rätt placerat höger kammare (RV). Demmy et al. första rapporterade en biventrikulär modell (LV & RV) som en modifiering av LV arbetande hjärtat modell 7, 8. De fann att slagvolymen, hjärtminutvolym och tryck utveckling förbättras i hjärtat omvandlats från att arbeta LV läge till biventrikulär arbetsläge 8. En korrekt lastad RV förbättrar också septal funktion genom att minska onormala tryckgradienter över septum. Biventrikulär arbetande hjärtan har visat att upprätthålla aorta utgång, pulmonell flöde, menar aortatrycket, genomsnittliga pulmonella tryck, hjärtfrekvens och myokardiell ATP och kreatin fosfat i upp till 3 timmar 8. Biventrikulär arbetar hjärta studier använder oftast hjärtan frOm-små djur, såsom råttor och kaniner, eftersom hjärtminutvolym och den erforderliga volymen av perfusatet är mycket mindre än den för hjärtan större djur. Har dock biventrikulära arbetar hjärta studier genomförts med hjälp hjärtan från svin, hörntänder och till och med människor 23, 24.

Den metaboliska efterfrågan på isolerade hjärtan i biventrikulär arbetsläge är betydligt högre än Langendorff perfusion. Det är viktigt att perfusatet lösning tillhandahålla tillräckligt med syre och metaboliskt substrat för att stödja biventrikulär hjärtfunktionen. Standardmetoder kristalloida buffertlösningar, såsom Krebs-Henseleit-16, 17, 25 eller Tyrodes 26, 27, har syre lösligheter så hög som 5,6 mg / L. När dessa lösningar gasades med karbogen (en gasblandning av 95% O2 och 5% CO2) och innehåller lämpliga metaboliska substrat (glukos, dextros och / eller natrium-pyruvat), är de lämpliga för biventrikulära arbetande hjärtan slår på normenal sinus priser ca 180 bpm för en kanin).

Metabola efterfrågan ökar för snabba rytmer och mängden syre löst i vanliga perfusat kanske inte tillräckligt för att fullt ut stödja en biventrikulär arbetar hjärta som är upphandlande vid höga hastigheter. Kristalloida buffertlösningar innehållande erytrocyter eller blandade med helblod har använts i arbets hj förberedelser för att säkerställa tillräcklig syretillgång. Tidigare studier har visat att tillsats av erytrocyter till en Krebs-Henseleit-lösning förbättrad arbetsmiljö hjärtfunktionen under rigorösa stimulerings-protokoll och också minskat förekomsten av kammarflimmer 16. En begränsning av användning av erytrocyter eller blandningar av helblod är att hemoglobin stör ljusvåglängder som används för fluorescensavbildning 13. Andra substrat, såsom albumin, kan också läggas till perfusatet lösningar för att förlänga hjärtats livskraft och minska ödem 28.

Under fluorescensavbildning intensitet excitationsljuset bör vara hög och ljusfördelning bör vara enhetliga. Åstadkomma enhetlig belysning är inte alltid lätt på grund av krökningen av den epikardiella ytan. I våra studier har vi bilden fNADH genom att filtrera ljus (350 ± 25 nm) från en kvicksilverlampa. En förgrenad fiberoptisk ljusledare används för att rikta UV-ljus på den epikardiella ytan. Likformig belysning kan åstadkommas genom lämplig placering av två utgående hylsorna. UV LED ljuskällor också skulle kunna användas, såsom vi har visat i figur 3. LED källorna är relativt billiga så multipla källor kunna inkorporeras i ett avbildningssystem. LED kan också cykla på och av vid höga hastigheter för att synkronisera exciteringsljus med bild förvärvet.

Fotoblekning av NADH bör minimeras 29 genom att minska tiden för vävnaden belysning. Detta kan göras genom att cykla belysningen till och från med en elektronic slutare och en lampa eller med ett LED-belysning och en styrenhet. Om belysningen är synkroniserad med hjärtcykeln så fNADH bildinsamlande kan vara begränsad till diastol, vilket skulle reducera rörelseartefakt i de fluorescerande signalerna. Triggade belysning och bildinsamlande med användning av en trycksignal, såsom LV-tryck, skulle vara ett sätt att göra detta.

I våra studier har vi observerat att förändringar i fNADH per tidsenhet kan vara mer än 5 gånger högre vid 400 bpm än 200 bpm. Detta tyder på att snabba rytmer höja redox tillstånd hjärtat. Huruvida detta beror på hypoxi eller oförmåga myocyter att oxidera NADH till NAD + tillräckligt snabbt för att undvika ansamling av NADH är fortfarande en obesvarad fråga.

Prestandan hos en biventrikulär arbeta hjärta förberedelser är knuten till flera faktorer. En av de viktigaste är att fastställa lämpliga preload och afterload tryck att efterlikna den fysiologiskavillkor som är under utredning. I synnerhet måste LV afterload (aorta-tryck) justeras för att representera systemiskt tryck. Om den är alltför hög kommer LV inte att kunna övervinna trycket, vilket resulterar i reflux. Tryck som är för låg kommer att negativt påverka koronar genomblödning. LV förspänning trycket (till vänster förmak tryck) bör också justeras för att ge ett slut diastoliska volym som är lämplig för det experimentella protokollet.

fNADH avbildning av levande vävnad är en etablerad läge för fluorescensavbildning 13. Dess tillämpning på hjärtvävnad illustrerades av Barlow och Chance när de rapporterade slående förhöjda fNADH inom regionalt ischemisk vävnad efter ligering av ett kranskärl 14. Deras fNADH bilder registrerades på film med hjälp av en Fairchild oscilloskop kamera och UV fotografering med blixt. Coremans et al. expanderat på detta koncept med NADH fluorescensen / UV reflektans förhållande till mätE metaboliska tillståndet för epikardium för Langendorff blod-perfuserade råtthjärtan 30. En videofluorimeter användes för avbildning och data registrerades med användning av en videobandspelare. Senare, Scholz et al. används en spektrograf och fotodioduppsättningen att mäta genomsnittlig fNADH från ett stort område av LV. Detta tillvägagångssätt minskade effekterna av epikardiella fluorescens heterogeniteter och lokala variationer i omlopp samtidigt avslöja makroskopiska arbetsrelaterade varianter av fNADH 31. Detta tillvägagångssätt är liknar beräkningen av den genomsnittliga fNADH nivåer för en region av intresse i alla ramarna i en fNADH avbildning datamängd, som illustreras i figur 2. Som vi har presenterat i denna artikel ger dagens teknik med hög hastighet CCD-kameror och digitalt styrd hög effekt UV spotlights. Tekniken gör det möjligt Spatiotemporal dynamiken i fNADH och hjärt-metabolism kan studeras ur många nya perspektiv. Den relativt låga kostnaden för optik och ljuskällor gör att fNADH avbildning ett användbart tillbehör för konventionella hjärt optiska kartläggning. 9, 32

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av ett bidrag från NIH (R01-HL095828 till MW Kay).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma-Aldrich S-3014
KCl Sigma-Aldrich P3911-500G
CaCl2 Fisher Scientific C77-500
MgSO4 Sigma-Aldrich M-7506
NaHCO3 Fisher Scientific S-233
KH2PO4 Fisher Scientific 423-316
Glucose Sigma-Aldrich 158968-500G
NaPyruvate Sigma-Aldrich P2256-25G
Albumin Sigma-Aldrich A9418-100G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Langendorff, O. Untersuchungen am uberlebenden saugethierherzen [investigations on the surviving mammalian heart]. Arch. Gesante Physiol. 61, 291-332 Forthcoming.
  2. Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to langendorff---still viable in the new millennium. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 55, 113-126 (2007).
  3. Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart. Am. J. Physiol. 212, 804-814 (1967).
  4. Feng, H. Z., Jin, J. P. Coexistence of cardiac troponin T variants reduces heart efficiency. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299, H97-H105 (2010).
  5. Clemens, M. G., Forrester, T. Appearance of adenosine triphosphate in the coronary sinus effluent from isolated working rat heart in response to hypoxia. J. Physiol. 312, 143-158 (1981).
  6. Cole, M. A., Murray, A. J., Cochlin, L. E., Heather, L. C., McAleese, S., Knight, N. S., Sutton, E., Jamil, A. A., Parassol, N., Clarke, K. A high fat diet increases mitochondrial fatty acid oxidation and uncoupling to decrease efficiency in rat heart. Basic Res. Basic Res. Cardiol. 106, 447-457 (2011).
  7. Demmy, T. L., Curtis, J. J., Kao, R., Schmaltz, R. A., Walls, J. T. Load-insensitive measurements from an isolated perfused biventricular working rat heart. J. Biomed. Sci. 4, 111-119 (1997).
  8. Demmy, T. L., Magovern, G. J., Kao, R. L. Isolated biventricular working rat heart preparation. Ann. Thorac. Surg. 54, 915-920 (1992).
  9. Kay, M., Swift, L., Martell, B., Arutunyan, A., Sarvazyan, N. Locations of ectopic beats coincide with spatial gradients of NADH in a regional model of low-flow reperfusion. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 2400-2405 (2008).
  10. Swift, L., Martell, B., Khatri, V., Arutunyan, A., Sarvazyan, N., Kay, M. Controlled regional hypoperfusion in langendorff heart preparations. Physiol. Meas. 29, 269-279 (2008).
  11. High resolution contrast ultrasound and NADH fluorescence imaging of myocardial perfusion in excised rat hearts. Kay, M. W., Swift, L. M., Sangave, A., Zderic, V. 30th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, 1-4 (2008).
  12. Chance, B. Pyridine nucleotide as an indicator of the oxygen requirements for energy-linked functions of mitochondria. Circ. Res. 38, I31-I38 (1976).
  13. Mayevsky, A., Rogatsky, G. G. Mitochondrial function in vivo evaluated by NADH fluorescence: From animal models to human studies. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, C615-C640 (2007).
  14. Barlow, C. H., Chance, B. Ischemic areas in perfused rat hearts: Measurement by NADH fluorescence photography. Science. 193, 909-910 (1976).
  15. Mayevsky, A., Chance, B. Oxidation-reduction states of NADH in vivo: From animals to clinical use. Mitochondrion. 7, 330-339 (2007).
  16. Gillis, A. M., Kulisz, E., Mathison, H. J. Cardiac electrophysiological variables in blood-perfused and buffer-perfused, isolated, working rabbit heart. Am. J. Physiol. 271, H784-H789 (1996).
  17. Ôta, K., Peaker, M. Lactation in the rabbit: Mammary blood flow and cardiac output. Experimental Physiology. 64, 225-238 (1979).
  18. Ashruf, J. F., Ince, C., Bruining, H. A. Regional ischemia in hypertrophic langendorff-perfused rat hearts. Am. J. Physiol. 277, H1532-H1539 (1999).
  19. Ashruf, J. F., Coremans, J. M., Bruining, H. A., Ince, C. Increase of cardiac work is associated with decrease of mitochondrial NADH. Am. J. Physiol. 269, 856-862 (1995).
  20. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ. Res. 95, 21-33 (2004).
  21. Rogers, J. M., Walcott, G. P., Gladden, J. D., Melnick, S. B., Kay, M. W. Panoramic optical mapping reveals continuous epicardial reentry during ventricular fibrillation in the isolated swine heart. Biophys. J. 92, 1090-1095 (2007).
  22. Qu, F., Ripplinger, C. M., Nikolski, V. P., Grimm, C., Efimov, I. R. Three-dimensional panoramic imaging of cardiac arrhythmias in rabbit heart. J. Biomed. Opt. 12, 044019 (2007).
  23. Chinchoy, E., Soule, C. L., Houlton, A. J., Gallagher, W. J., Hjelle, M. A., Laske, T. G., Morissette, J., Iaizzo, P. A. Isolated four-chamber working swine heart model. Ann. Thorac. Surg. 70, 1607-1614 (2000).
  24. Hill, A. J., Laske, T. G., Coles, J. A., Sigg, D. C., Skadsberg, N. D., Vincent, S. A., Soule, C. L., Gallagher, W. J., Iaizzo, P. A. In vitro studies of human hearts. Ann. Thorac. Surg. 79, 168-177 (2005).
  25. Schenkman, K. A. Cardiac performance as a function of intracellular oxygen tension in buffer-perfused hearts. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281, H2463-H2472 (2001).
  26. Pijl, A. J., Pfaffendorf, M., Mathy, M., Van Zwieten, P. A. Cardioprotection by nifedipine in isolated working hearts: A comparative study on three different types of experimental ischemia. J. Cardiovasc. Pharmacol. 21, 70-76 (1993).
  27. Khatib, S. Y., Boyett, M. R. Effects of glyburide (glibenclamide) on myocardial function in langendorff perfused rabbit heart and on myocardial contractility and slow calcium current in guinea-pig single myocytes. Mol. Cell Biochem. 242, 81-87 (2003).
  28. Kates, R. E., Yee, Y. G., Hill, I. Effect of albumin on the electrophysiologic stability of isolated perfused rabbit hearts. J. Cardiovasc. Pharmacol. 13, 168-172 (1989).
  29. Combs, C. A., Balaban, R. S. Direct imaging of dehydrogenase activity within living cells using enzyme-dependent fluorescence recovery after photobleaching (ED-FRAP). Biophys. J. 80, 2018-2028 (2001).
  30. Coremans, J. M., Ince, C., Bruining, H. A., Puppels, G. J. (Semi-)quantitative analysis of reduced nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence images of blood-perfused rat heart. Biophys J. 72, 1849-1860 (1997).
  31. Scholz, T. D., Laughlin, M. R., Balaban, R. S., Kupriyanov, V. V., Heineman, F. W. Effect of substrate on mitochondrial NADH, cytosolic redox state, and phosphorylated compounds in isolated hearts. Am. J. Physiol. 268, 82-91 (1995).
  32. Holcomb, M. R., Woods, M. C., Uzelac, I., Wikswo, J. P., Gilligan, J. M., Sidorov, V. Y. The potential of dual camera systems for multimodal imaging of cardiac electrophysiology and metabolism. Exp. Biol. Med. (Maywood). 234, 1355-1373 (2009).

Comments

1 Comment

  1. This is an amazing video and resource! Thank you!

    Reply
    Posted by: stacy b.
    July 26, 2012 - 12:51 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics