İzole Biventriküler ve NADH Floresans Görüntüleme Tavşan Kalpler Çalışma

Medicine
 

Summary

Objektif fizyolojik preload ve afterload baskıların kapsamında izole kalplerin mitokondriyal redoks izlemektir. Bir biventriküler çalışma tavşan kalp modeli sunulmuştur. NADH, yüksek çözünürlükte zamanmekansal floresans görüntüleme epikardiyal doku mitokondriyal redoks izlemek için kullanılır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Asfour, H., Wengrowski, A. M., Jaimes III, R., Swift, L. M., Kay, M. W. NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts. J. Vis. Exp. (65), e4115, doi:10.3791/4115 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Langendorff 1 tarafından kuruluşundan bu yana, izole perfüze kalp kardiyak fizyoloji 2 eğitim için önemli bir araç. Ancak, kalp fizyolojik preload ve afterload baskılar çerçevesinde işin yapılması için gerekli kardiyak metabolizma çalışmaları için iyi bir şekilde uygun değildir. Uygun sol ventrikül (LV) preload ve afterload basınçları 3 kurmak Langendorff tekniğine Neely tanıttı değişiklikler. Modeli izole LV çalışma kalp model olarak bilinir ve LV performans ve metabolizma 4-6 incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak bu model, düzgün yüklenmiş sağ ventrikül (RV) sağlamaz. Demmy ve ark. İlk LV çalışan kalp modelinde 7, 8 bir modifikasyonu olarak biventriküler modeli bildirdi. Onlar biventriküler çalışma modu 8 için çalışan AG modundan dönüştürülür kalplerde arttığını atım volümü, kalp debisi ve basıncı gelişme bulundu 8 için aort çıkışı, pulmoner akım, aort basıncı, kalp atım hızı ve miyokard ATP seviyelerini korumak için gösterilmiştir.

Işemi olarak miyokardiyal yaralanmasının metabolik etkileri, okuyan, çoğu zaman, etkilenen dokunun konumunu belirlemek için gereklidir. Bu NADH (nikotinamid adenin dinükleotid indirgenmiş formu) 9-11 floresans, bir koenzim mitokondri içinde bol miktarda bulunan ve görüntüleme yapılabilir. NADH floresans (fNADH) yerel oksijen konsantrasyonu 12 ile yakın bir doğrusal ters ilişki görüntüler ve mitokondriyal redoks devlet 13 bir ölçüsünü verir. hipoksik ve iskemik koşullarında fNADH görüntüleme hipoksik bölgelerde 14, 15 tanımlamak ve ilerlemesini izlemek için bir boya içermeyen bir yöntem olarak kullanılmıştırZaman üzerinde 10 hipoksik koşullarda.

Yöntemin amacı miyosit metabolizma hızı değiştirmek veya hipoksi tetikleyebilir ya da ikisinin bir kombinasyonunu yaratmak protokolleri sırasında biventriküler çalışma kalplerin mitokondriyal redoks izlemektir. Yeni Zelanda beyaz tavşanı gelen Kalpler 37 ° C'de bir çalışma biventriküler kalp sistemi (Hugo Sachs Elektronik) bağlı ve modifiye Krebs-Henseleit solüsyonu 16 ile perfüze edildi Aort, AG, pulmoner arter ve sol ve sağ atriyum basınçları kaydedildi. Elektrik faaliyeti monofazik aksiyon potansiyeli elektrot kullanılarak ölçüldü. Görüntü fNADH için, bir cıva lambanın ışık süzüldü (350 ± 25 nm) ve epikarda aydınlatmak için kullanıldı. Yayılan ışık süzülür (460 ± 20 nm) ve bir CCD kamera kullanılarak görüntülendi. Farklı pacing hızları sırasında biventriküler çalışma kalplerin epikardiyal fNADH değişiklikler sunulmuştur. Kalp modeli ve fNADH görüntüleme kombinasyonugerçekçi fizyolojik koşullar çerçevesinde akut kardiyak patolojiler çalışılmasında yeni ve değerli bir deney aracı sağlar.

Protocol

1. Çalışma için Ayarlama

  1. 118 NaCl, 3.30 KCl, 2.00 CaCl2, 1.20 MgSO 4, 24,0 NaHCO 3, 1,20 KH 2 PO 4, 10,0 glukoz, 2.00 NaPyruvate ve 20.0 mg / L albümin: modifiye Krebs-Henseleit solüsyonu 16 dört litre (mM hazırlayın ). Çözeltisi mümkün olduğunca deney başlamadan yakın olarak hazırlanır. PH steril filtreleme (: 22 mikron, Corning gözenek boyutu) sonra 7.4 'e ayarlanmalıdır. Çözüm osmolalitesi 275 ve 295 mOsm / kg arasında olmalıdır.
  2. Arıtılmış su ile çalışan kalp sisteminin tüm tüpler ve odaları durulayın. Tüm su sistemi kaldırıldı kadar pompaları çalıştırın.
  3. Perfüzyon pompaları (Langendorff perfüzyon pompa, sol kalp perfüzyon pompası ve sağ kalp perfüzyon pompası) her doğrultusunda: selüloz membran filtre (5 mikron, Advantec gözenek boyutu) ekleyin.
  4. Her basınç sensörü için iki noktalı kalibrasyon (0 ve 60 mmHg) gerçekleştirin.
  5. Su banyoları açın. A ısıtmalı döner su banyosunda (Cole Palmer) su ceketli tüpler ve ısı değiştiriciler ısıtmak için kullanılır. Perfüzat ayrı bir su banyosunda (Oakton Instruments) önceden ısıtılır. Her iki hamam 37 ° C bir çözelti sıcaklığı korumak için ayarlanır
  6. Kapalı bir döngü içinde perfüzat dolaşmaya pompalar açın. Perfüzat 80 kPa'dan az% 95 O 2 ve% 5 CO2 ile gazlandırılan microfiber oxygenators (hemofilters) geçer. Oksijenli perfüzat ardından kalp kanüller girmeden önce 37 ° C arasında bir sıcaklıkta bunu korumak için ısı değiştirici aracılığıyla akar.

2. Kalp Eksizyon

  1. Sabit basınç Langendorff modunda çalıştırmak için çalışan kalp sistemini ayarlayarak başlayın. 50-60 mm Hg aralığında aortik bloğun basınç ayarlanır.
  2. Ketamin (44 mg / Kg) ve ksilazin (10 mg / Kg) intramüsküler enjeksiyonu ile tavşan uyutmak. Tavşan (, uyuşturulmuş pentobarbital sonra 50 mg / Kg) ve heparin (2000 U) intravenöz arka bacak iç kısmında marjinal kulak ven veya yanal safen ven yoluyla enjekte edilir.
  3. Tavşan tamamen sigara duyarlı olduğunda, ağrı refleksi eksikliği ile belirlenen, göğüs boşluğu hızla açıldı, perikard dilimlenmiş, aort kenetlenir ve kalp ve akciğerler eksize edilir. Bu noktada akciğerlerin pulmoner venlerin izole yardımcı olmak için kalp takılı kalmış olmalıdır.
  4. 60 mL perfüzat ve heparinin 200 birimleri ile doldurulmuş bir şırınga bağlı bir 5 mm çaplı kanül ile aorta izole etmek ve kanüle. Boyut sıfır ipek sütür ile kanül ile aorta sabitleyin ve yavaşça kan kalbi temizlemek için şırınga bastırın.

3. Biventriküler kanülasyonu

  1. Çalışan kalp sisteminin aort bloğuna kalp bağlayın. Koroner emboliye neden olabilir aorta, giren hava önleyin. Bu aort bl için kanül eklemek en iyisidireğik bir açı ile aort bağlayıcı yaklaşırken ve takılı iken perfüzat yavaşça kanül içine bağlayıcı ile damla izin vererek ock.
  2. Kalp sabit basınç Langendorff modunda perfüze edilirken, yağ ve bağ dokusu kaldırmak ve aşağıdaki gemileri bulun: inferior ve superior vena kava, azygos ven, pulmoner arter, pulmoner venler.
  3. Superior vena kava Ligate. Sadece aşağıdaki pulmoner arter Kes sağ ve sol pulmoner arterler için nerede dalları.
  4. Grup kalp ve akciğerler ve bir sütür kullanarak hepsini ligate arasında kalan tüm damarları (pulmoner venler). Akciğerleri çıkarın.
  5. Sol atriyal apendiks köşesinde küçük bir delik kesin. LA perfüzat ile dolu olduğundan emin olun. Eklemeden ise tamamen perfüzat kanül ile doldurulmuş olduğu sağlarken LA kanüle. Apendiks için kanül dikin.
  6. T akışını sağlamak için sol taraftaki pompa (pompa # 2) açınO sol atriyum. 6 mmHg ve ayarlamak ± 2 mmHg olarak atriyal dilatasyon tarafından belirlenir - 2 arasındaki preload basıncı ayarlayın.
  7. Langendorff pompası (pompa # 1) kapatarak çalışma kalp moduna kalp geçin.
  8. An 10 mmHg aort basıncını düşürmek ve sonra yavaş yavaş 80-100 mmHg aralığı içinde, bu artar. Bu aort kapağı açın ve normal fizyolojik koşullar sırasında olduğu gibi çalışması için izin verecektir. Nihai afterload basıncı LV kontraktilite bağlıdır. Bu tepe LV basıncı yaklaşık 20 mmHg daha az bir değere ayarlanması gerekir.
  9. LV kardiyak çıktı aortik blok (ml / dakika) çıkmadan perfüzat akış hızı ölçülmesiyle belirlenebilir. Normal kardiyak output ise 14.77 ila 16.43 ml / 100 vücut ağırlığı 17 g ve ortalama başına en az 340 mL / 2.2 kg tavşan için min. Aortik basınç Şekil 1'de gösterildiği gibi basınçlı sinyali benzer.
  10. I ile RA kanülenferior vena kava. RA ve kanül hem de tamamen perfüzat ile doldurulması sağlanır ve hava kabarcığı oluşumunu önlerken kanül yerleştirin. Vene kanül dikin.
  11. Sağ atriyuma akışını sağlamak için sağ tarafında pompa (pompa # 3) açın. Yaklaşık 3 mmHg basınç ayarlayın.
  12. RV perfüzat ile dolu olduğundan emin olun ve pulmoner arter kanüle. Bu hava kabarcıklarını engellemek için takılıyken kanül tamamen perfüzat ile dolu olduğundan emin olun. Pulmoner arter kanülü dikin.

4. Sinyal Toplama: Baskılar, Monofazik Aksiyon Potansiyelinin ve fNADH

  1. Biventriküler kanülasyon tamamlandıktan sonra, dikkatle aort kanülasyonu ile aorta basınç dönüştürücü kateter (Millar) yerleştirin. Yavaşça aort kapak geçmiş ve LV içine gidin. Kateter ucu uygun pozisyonun sağlanması için LV basınç sinyali izleyin. LV basınçlı bir örneği gösterilmiştirŞekil 1 'de.
  2. Yavaşça ventriküler epikarda karşı monofazik aksiyon potansiyeli elektrot basın. Uygun aksiyon potansiyeli ölçümleri elde etmek sinyali izleyin. Sinyal hafif hareket artefaktı normaldir.
  3. Kalp adımlamak için sağ atrium bir bipolar uyaran elektrot yerleştirin. Bizim protokolde, kupa sırasıyla 200 ve 400 bpm karşılık gelen 300 ve 150 milisaniye arasında döngü uzunlukları, az tempolu idi.
  4. LV epikardiyal yüzeyi sıcaklığını ölçün. Çalışma sıcaklığı 37 tutulur gerektiriyorsa ° C daha sonra bir su-ceketli kalp boşluklarında veya batığın kalp boyunca sabit sıcaklık korumak için ısıtılmış superfusate banyosunda kalp içinde kalp yerleştirin.
  5. CCD kamera (Andor iXon DV860, 128x128 piksel) yerleştirin ve görünümü uygun bir alan olduğu gözlendi Lens odak. Kamera bir iş istasyonu bağlı ve görüntüleri Andor Solis softwa kullanarak 2 fps elde edilenyeniden.
  6. Önceden görüntüleme başlamasından cıva lambası ışığı açın. Işık kalbin yüzeyine aydınlatmak için bir harekete geçirici filtre (350 ± 25 nm, Chroma Teknolojisi) aracılığıyla ve bir fiber optik ışık kılavuzu (Horiba Jobin Yvon modeli 1950 1M) içine yönlendirilir. Işık kılavuzu ile UV ışık zayıflatma küçüktür. UV aydınlatma ayrıca LED spot oluşan yüksek güçlü LED sistemi (Mightex PLS-0365-030-S) ve bir kontrol ünitesi (Mightex SLC-SA04-ABD) kullanılarak sağlanabilir.
  7. Oda ışığı kapatın ve herhangi bir ortam aydınlatması en aza indirmek. Üniforma epikardiyal aydınlatma elde etmek için kalbi ışık kılavuzu (veya LED spot) ve yüksükler yöneltin. Yayılan NADH floresans (fNADH) bir emisyon filtresi (460 ± 20 nm Chroma Teknolojisi) geçer ve CCD kamera ile görüntülenmektedir.
  8. Görüntüleme yazılımı kullanılarak ilgilenilen bölge seçerek zamanla fNADH değişiklikleri izleyin. Bölgede o içinde ortalama piksel yoğunluğu izlemek için canlı-güncellemek modunu seçinf faiz.
  9. Kalp uygun baskılar oluşturmak için biventriküler çalışma modunda çalıştığında edilmelidir. fNADH seviyesinin yeterli koroner perfüzyon onaylamak için epikardiyal yüzeyi üzerinde düşük ve istikrarlı olmalıdır. Çalışmada bu noktada belirli bir deney protokolünde bir hipotezi test etmek için uygulanmalıdır.
  10. Çalışma tamamlandıktan sonra, sistem kalp kaldırmak ve tüm tahliye perfüzat. Arıtılmış su ile sistem tüp ve odaları durulayın. Rutin bakım için, sistem periyodik Mucasol çözüm veya gerektiği gibi bir seyreltilmiş hidrojen peroksit çözeltisi ile durulanmalıdır.

5.. FNADH Görüntüler off-line İşleme

  1. NADH veri setleri karşılaştırmak için bir yolu (fNADH (i, j, t)) deneyleri arasında bir referans görüntü kullanılarak her floresan görüntü normalleştirmek için aşağıdaki denklemde gösterilen dataset 9 (fNADH (i, j, t 0)), . NADH floresans normalleştirmek için başka bir yolu pl etmektirace deney 9, 18, ​​19 öncesi görüş alanında uranil cam küçük bir parça. Stabil bir referans olarak kullanılmak üzere bir sinyal sağlamak için UV ışığı uygulanır - uranil cam olacak floresans (550 nm 450).

Denklem 1

6. Temsilcisi Sonuçlar

Bir biventriküler kalp çalışma tavşan hazırlanması ön ve bazal kez Şekil 1 'de gösterilmiştir. Sol ventrikül basıncı aort kapak geçmiş ve sol ventrikül içine bir basınç dönüştürücü kateter (Millar SPR-407) gezinme tarafından ölçüldü. Aort, pulmoner arter ve sol ventrikül basınçları (LVP) Şekil 1C gösterilmiştir. Diyastolik LVP genelde 0 ile 10 mmHg. Minimum diyastolik aort basıncı yaklaşık 60 mmHg. Pik sistolik LVP dolum basıncı (preload veya LA basıncı) ve kontraktilite bağlıdırve, en iyi, 80 ve 100 mmHg arasında olmalıdır. Şekil 1C gösterildiği gibi maksimum aort basınç ve maksimum LVP yakından eşleşmesi gerekir.

Tavşan kalp için tipik olan hızlı depolarizasyonu faz ve bir repolarizasyon fazı ile aksiyon potansiyeli (MAP) Şekil 1B 'de gösterilmiştir. Şekil 1D gösterildiği gibi MAP'ler, bir müteahhitlik kalpten nispeten kolayca kaydedilebilir ancak genellikle diyastolde küçük hareket artifakı olacaktır. MAP uyarım esnasında kalp (yakalama) başarılı sürüklenmesini doğrulanması için yararlı olan ve aynı zamanda diğer akut iskemi ya da bağlı düzensizlikler, yerel elektrofizyolojik değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir. EKG de sıcak superfusate bir banyoda kalp batırma ve kalbin sol ve sağ tarafında banyosunda bir elektrot yerleştirerek ölçülebilir. Üçüncü bir kayıtsız elektrot ya uzağa kalpten, banyosuna yerleştirilir veya aorta eklenir.Bir EKG genel elektrik fonksiyonu değerlendirmek için ve iskemi varlığının ortaya çıkarılması için yararlıdır küresel uyarma ve repolarizasyon sürecinin, hakkında bilgi sağlayacaktır.

fNADH görüntüleme iskemik ya hipoksik bölgelerin zamanmekansal ilerlemesini ölçmek için kullanılabilir kalp mitokondriyal redoks değişiklikler ortaya çıkarmaktadır. Bu çalışma için, epikardiyal fNADH döngüsü 300 uzunlukları (CL), 200 ve 150 milisaniye az üç pacing hızları sırasında redoks durumundaki değişiklikleri izlemek için ölçüldü. Bir ilgi bölgesi (kırmızı kutu, Şekil 2) Ortalama fNADH değerleri siklus uzunluğu kısalır gibi temel fNADH düzeylerini artırmak olduğunu göstermektedir. Hızı pacing bazal fNADH seviyesi nispeten sabit sinüs ritmi (CL = 300 milisaniye) yakındır. Siklus uzunluğu en kısa CL (150 ms) de büyük artış ile 300 milisaniye, bazal fNADH düzeylerinin artışı, altında kısaltılmış olarak. Tam ön yüzeyinin yüksek çözünürlüklü görüntüleme fNADH200 ve 400 dak Şekil 3 'de gösterilmiştir. 200 bpm ile fNADH düzeyleri sabit ve mekansal homojen idi. 400 bpm, fNADH seviyeleri epikarda boyunca önemli ölçüde artmıştır. Önemli mekansal heterojenite RV ve LV septal bölgeleri içinde meydana gelen büyük artışlar gözlenmiştir.

FNADH sinyal kasılması (hareket artefakt) ile salınım ve salınım frekansı kalp atım hızı (Şekil 2) karşılık gelir. Biventriküler kanülasyon ise, kalbin kasılması sırasında tabanı sallanan gelen kalp engellemeye yardımcı olur 4 kanüller, tarafından düzenleniyor. Bu nedenle, titreşim genliği artık zaman ölçeği (5-10 sn) iskemi veya hipoksi kaynaklanır fNADH eğilimleri daima daha azdır.

Şekil 1
Şekil 1.. Izole bir biventriküler tipik bir baskı ve aksiyon potansiyeli ra çalışmabbit kalp. Dört kanüller gösteren kalp A. Bazal görünümü:; 2, pulmoner arter; 1, aort sağ atriyal ve 4 B. sol ventrikül (LV) gösteren kalbin ön görünümü ve sağ ventrikül, 3, atriyal bıraktı. (RV). C. Temsilcisi baskılar. Top: sol ventrikül basıncı (düz çizgi) ve aort basıncı (noktalı çizgi). Alt:. Pulmoner basınç D. Örnek aksiyon potansiyeli. Sinyal paneli C'de gösterildiği baskıları ile aynı hizaya büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2
Şekil 2. tavşan kalp çalışan izole biventriküler ve fNADH görüntüleme. Top: görünümü (solda) ve üç fNADH görüntü alan bir karikatür gösterilmiştir. İlgili Pacing döngüsü uzunluğu (CL) her bir görüntü gösterilir.Alt panelinde fNADH sinyali için ilgi bölgesi kırmızı kutu ile gösterilir. Monofazik aksiyon potansiyeli elektrot ucu ilgi bölgenin sağında görülür. Epikarda Şekil 5 'de gösterildiği gibi, civa ve lambanın ışık kılavuz kullanılarak aydınlatılır edildi. Sadece ilgi bölgenin çevresindeki epikardiyal yüzeyi aydınlattı Alt:. Ilgi bölge için ortalama fNADH üst panelinde kırmızı kutu ile gösterilir. Azalan döngü süresini ortalama fNADH artar.

Şekil 3
Şekil 3. tavşan kalp çalışma izole bir biventriküler tam ön yüzeyinin fNADH görüntüler. kalp 200 bpm ve 400 bpm ile RA gelen tempolu oldu. İki adet yüksek güçlü LED (Mightex PLS-0365-030-S, 365 nm,% 4 ile tüm ön epikarda aydınlatırken fNADH (2 fps, 0.4 mm çözünürlükte 128x128 piksel) görüntülendi intensity, 50 mW maks).

Discussion

Izole Langendorff perfüze kalp kardiyak fizyoloji 2 eğitim için önemli bir araç. Özellikle kardiyak aritmiler, transmembran potansiyeli 20 floresans görüntüleme kullananlar çalışmalarında özellikle yararlıdır. Bir avantajı, izole kalp tamamını epikarda 21, 22 görülebilir olmasıdır. Diğer bir avantajı, kan aksine, açık bir kristalloid tampon çözeltisi ile perfüzyon flöresan sinyalleri ile etkileşmeyen olmasıdır. Bir sınırlama Langendorff tekniği sıklıkla kalp fizyolojik preload ve afterload baskılar çerçevesinde işin yapılması için gerekli kalp metabolizması, çalışmaları için çok uygun olmasıdır.

Neely Uygun sol ventrikül (LV) preload ve afterload basınçları 3 kurmak Langendorff teknik değişiklikler tanıttı metabolik çalışmalar için izole kalp preparatları ile ilgisini yükseltmek için.Modeli izole LV çalışma kalp model olarak bilinir ve LV performans ve metabolizma 4-6 incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. LV çalışan kalp modelinde fonksiyonel değerlendirme için Langendorff modeli üstündür, buna rağmen o düzgün yerleştirildiğinden sağ ventrikül (RV) sağlamaz. Demmy ve ark. İlk LV çalışan kalp modelinde 7, 8 bir modifikasyonu olarak biventriküler modeli (LV ve RV) bildirdi. Onlar biventriküler çalışma modu 8 için çalışan AG modundan dönüştürülür kalplerde arttığını atım volümü, kalp debisi ve basıncı gelişme bulundu. Bir düzgün yerleştirildiğinden RV da septum boyunca anormal basınç farkları azaltarak septal fonksiyonu iyileştirir. Biventriküler çalışma kalpleri 3 saate kadar 8 için aort çıkışı, pulmoner akım, aort basıncı, pulmoner basıncı, kalp hızı ve miyokardiyal ATP ortalama ve kreatin fosfat seviyelerini korumak için gösterilmiştir. Biventriküler çalışan kalp çalışmaları tipik kalpleri fr kullanınBu tür sıçan ve tavşan gibi om küçük hayvanlar, kardiyak output ve perfüzat gerekli hacmi daha az büyük hayvan kalpleri için daha çünkü. Bununla birlikte, biventriküler kalp çalışma çalışmalarda domuz, köpek ve hatta insanlarda 23, 24 gelen kupa kullanılarak yapılmıştır.

Biventriküler çalışma modunda izole kalplerin metabolik talebi Langendorff perfüzyon epeyce daha yüksektir. Bu perfüzat çözüm yeteri kadar oksijen ve biventriküler kalp fonksiyonları desteklemek için metabolik substrat sağlamak önemlidir. Böyle Krebs-Henseleit 16, 17, 25 ya da Tyrodes 26, 27 gibi standart kristalloid tampon çözeltisi, olduğu kadar yüksek oksijen çözünme yeteneğine sahip 5.6 mg / L. Bu çözüm carbogen (% 95 O2 ve% 5 CO2 gaz karışımı) ile gaz olmuş ve uygun metabolik substrat (glikoz, dekstroz, ve / veya sodyum piruvat) içermesi, bunlar norm az dövme biventriküler kalp çalışma için uygunark sinüs oranları (bir tavşan için yaklaşık 180 bpm).

Metabolik talebin hızlı ritimler için artar ve standart perfüzat çözünmüş oksijen miktarını tam olarak yüksek oranda sözleşme bir çalışma biventriküler kalp desteklemek için yeterli olmayabilir. Eritrosit veya tam kan ile karışık içeren kristalloid tampon çözeltiler yeterli oksijen kullanılabilirliğini sağlamak için çalışan kalp preparatları kullanılmaktadır. Önceki çalışmalar bir Krebs-Henseleit solüsyonu eritrositlerin ekleyerek titiz uyarım protokolleri sırasında çalışan kalp fonksiyonlarında iyileşme ve ventriküler fibrilasyon 16 insidansını azalttığını göstermiştir. Eritrosit veya tam kan karışımları kullanarak bir sınırlaması, hemoglobinin floresans görüntüleme 13 için kullanılan ışık dalga boyu müdahale olduğunu. Böyle albümini gibi diğer substratlar, kalp canlılığı uzatan ve ödem 28 azaltmak için çözüm perfüzyon için ilave edilebilir.

Floresans görüntüleme sırasında uyarma ışık şiddeti yüksek olmalı ve ışık dağılımı aynı olmalıdır. Düzgün bir aydınlatma elde etmek zaman epikardiyal yüzeyinin eğrilik nedeniyle kolay değildir. Bizim çalışmalarımızda, bir cıvalı lamba ışık (350 ± 25 nm) filtreleyerek biz görüntü fNADH. A çatallı fiber optik ışık kılavuz epikardiyal yüzeyine UV ışığı yönlendirmek için kullanılır. Uniform ışık uygun konumlandırma iki çıkış ferrules ile elde edilebilir. UV biz Şekil 3 'de gösterildiği gibi ışık kaynakları, aynı zamanda, kullanılan olabilir LED. LED kaynaklar nispeten ucuz böylece birden fazla kaynaktan bir görüntüleme sistemi içine dahil edilebilir. LED'ler de görüntü alımı ile ikaz ışığı eşitlemek için yüksek oranda açık ve kapalı dolaşılan edilebilir.

NADH Photobleaching doku aydınlatma zamanı azaltarak 29 minimize edilmelidir. Bu, üzerinde aydınlatma bisiklet tarafından ve bir elektron kullanılarak kapalı yapılabiliric perde ve lamba veya LED aydınlatma sistemi ve bir denetleyici ile. Aydınlatma kalp döngüsü ile senkronize edilirse, fNADH görüntü alımı floresan sinyalleri hareket artifakı azaltabilecek, diyastol sınırlı olabilir. Gibi LV basıncı gibi bir basınç sinyali kullanarak Trigging aydınlatma ve görüntü alma, bunu yapmanın tek yolu olacaktır.

Bu çalışma kapsamında birim zamanda fNADH değişiklikleri 200 bpm ile 400 bpm ile daha fazla 5X olabileceğini gözlemledim. Bu hızlı ritim, kalbin redoks yükseltmesine gösterir. Bu hipoksi veya NAD NADH okside miyosit yetersizliği nedeniyle olup olmadığı + NADH birikimini önlemek için yeterince hızlı bir şekilde hala cevaplanmamış bir sorudur.

Biventriküler kalp çalışma hazırlığı performansı çok etkene bağlı olduğu. En önemlilerinden biri fizyolojik taklit etmek için uygun preload ve afterload basınçlarının ayarlanması içinsoruşturma kapsamında koşullar. Özellikle, LV afterload (aortik basınç) sistemik basınç temsil ayarlanması gerekir. Çok yüksek ise, LV yetersizliğinin neden basınç üstesinden gelmek için mümkün olmayacaktır. Çok düşük basınç koroner perfüzyon olumsuz etkileyecektir. LV preload basıncı (sol atrial basınç) ayrıca deneysel protokol için uygun olan bir diyastol sonu hacmi sağlamak için ayarlanmalıdır.

canlı doku fNADH görüntüleme floresans görüntüleme 13 kurulu bir moddur. Bir koroner damar 14 bağlanmasından sonra bölgesel iskemik doku içindeki fNADH çarpıcı yükselmeleri rapor ne zaman kalp dokusuna uygulama Barlow ve Şans tarafından izah edildi. Onların fNADH görüntüleri Fairchild osiloskop kamera ve UV flaşlı fotoğraf kullanarak film kaydedildi. Coremans ve ark. sinyal kuv için NADH / UV floresans yansıma oranını kullanarak bu kavramı üzerine genişlettie Langendorff kan-perfüze sıçan kalpleri 30 epikarda metabolik durumu. A videofluorimeter görüntüleme için kullanıldı ve verilerin bir video kayıt cihazı kullanılarak kaydedildi. Daha sonra, Scholz ve ark. LV geniş bir alandan ortalama fNADH ölçmek için bir tayfçeker ve fotodiyot dizisi kullanılır. FNADH 31 makroskopik işle ilgili değişimler açığa çıkarırken Bu yaklaşım epikardiyal floresans heteronjenitelerin ve dolaşımdaki yerel farklılıkların etkileri azaltılabilir. Bu yaklaşım, Şekil 2'de gösterildiği gibi, bir fNADH görüntü veri kümesi, her çerçeveleri arasında bir ilgi bölge için işlem ortalama fNADH seviyeleri ile benzerdir. Biz bu makalede sunulan gibi, bugünün teknolojisi yüksek hızlı CCD kamera sağlar ve dijital yüksek güç UV spot ışıkları kontrol. Bu teknolojiler fNADH ve kardiyak metabolizmanın zamanmekansal dinamikleri çok farklı bir perspektiften ele alınmalıdır sağlar. Optik ve ışık kaynağının nispeten düşük maliyetli f yaparNADH görüntüleme konvansiyonel kardiyak optik haritalama sistemleri için kullanışlı bir aksesuar. 9, 32

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

Bu çalışma NIH (MW Kay için R01-HL095828) bir hibe ile desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma-Aldrich S-3014
KCl Sigma-Aldrich P3911-500G
CaCl2 Fisher Scientific C77-500
MgSO4 Sigma-Aldrich M-7506
NaHCO3 Fisher Scientific S-233
KH2PO4 Fisher Scientific 423-316
Glucose Sigma-Aldrich 158968-500G
NaPyruvate Sigma-Aldrich P2256-25G
Albumin Sigma-Aldrich A9418-100G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Langendorff, O. Untersuchungen am uberlebenden saugethierherzen [investigations on the surviving mammalian heart]. Arch. Gesante Physiol. 61, 291-332 Forthcoming.
  2. Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to langendorff---still viable in the new millennium. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 55, 113-126 (2007).
  3. Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart. Am. J. Physiol. 212, 804-814 (1967).
  4. Feng, H. Z., Jin, J. P. Coexistence of cardiac troponin T variants reduces heart efficiency. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299, H97-H105 (2010).
  5. Clemens, M. G., Forrester, T. Appearance of adenosine triphosphate in the coronary sinus effluent from isolated working rat heart in response to hypoxia. J. Physiol. 312, 143-158 (1981).
  6. Cole, M. A., Murray, A. J., Cochlin, L. E., Heather, L. C., McAleese, S., Knight, N. S., Sutton, E., Jamil, A. A., Parassol, N., Clarke, K. A high fat diet increases mitochondrial fatty acid oxidation and uncoupling to decrease efficiency in rat heart. Basic Res. Basic Res. Cardiol. 106, 447-457 (2011).
  7. Demmy, T. L., Curtis, J. J., Kao, R., Schmaltz, R. A., Walls, J. T. Load-insensitive measurements from an isolated perfused biventricular working rat heart. J. Biomed. Sci. 4, 111-119 (1997).
  8. Demmy, T. L., Magovern, G. J., Kao, R. L. Isolated biventricular working rat heart preparation. Ann. Thorac. Surg. 54, 915-920 (1992).
  9. Kay, M., Swift, L., Martell, B., Arutunyan, A., Sarvazyan, N. Locations of ectopic beats coincide with spatial gradients of NADH in a regional model of low-flow reperfusion. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 2400-2405 (2008).
  10. Swift, L., Martell, B., Khatri, V., Arutunyan, A., Sarvazyan, N., Kay, M. Controlled regional hypoperfusion in langendorff heart preparations. Physiol. Meas. 29, 269-279 (2008).
  11. High resolution contrast ultrasound and NADH fluorescence imaging of myocardial perfusion in excised rat hearts. Kay, M. W., Swift, L. M., Sangave, A., Zderic, V. 30th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, 1-4 (2008).
  12. Chance, B. Pyridine nucleotide as an indicator of the oxygen requirements for energy-linked functions of mitochondria. Circ. Res. 38, I31-I38 (1976).
  13. Mayevsky, A., Rogatsky, G. G. Mitochondrial function in vivo evaluated by NADH fluorescence: From animal models to human studies. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, C615-C640 (2007).
  14. Barlow, C. H., Chance, B. Ischemic areas in perfused rat hearts: Measurement by NADH fluorescence photography. Science. 193, 909-910 (1976).
  15. Mayevsky, A., Chance, B. Oxidation-reduction states of NADH in vivo: From animals to clinical use. Mitochondrion. 7, 330-339 (2007).
  16. Gillis, A. M., Kulisz, E., Mathison, H. J. Cardiac electrophysiological variables in blood-perfused and buffer-perfused, isolated, working rabbit heart. Am. J. Physiol. 271, H784-H789 (1996).
  17. Ôta, K., Peaker, M. Lactation in the rabbit: Mammary blood flow and cardiac output. Experimental Physiology. 64, 225-238 (1979).
  18. Ashruf, J. F., Ince, C., Bruining, H. A. Regional ischemia in hypertrophic langendorff-perfused rat hearts. Am. J. Physiol. 277, H1532-H1539 (1999).
  19. Ashruf, J. F., Coremans, J. M., Bruining, H. A., Ince, C. Increase of cardiac work is associated with decrease of mitochondrial NADH. Am. J. Physiol. 269, 856-862 (1995).
  20. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ. Res. 95, 21-33 (2004).
  21. Rogers, J. M., Walcott, G. P., Gladden, J. D., Melnick, S. B., Kay, M. W. Panoramic optical mapping reveals continuous epicardial reentry during ventricular fibrillation in the isolated swine heart. Biophys. J. 92, 1090-1095 (2007).
  22. Qu, F., Ripplinger, C. M., Nikolski, V. P., Grimm, C., Efimov, I. R. Three-dimensional panoramic imaging of cardiac arrhythmias in rabbit heart. J. Biomed. Opt. 12, 044019 (2007).
  23. Chinchoy, E., Soule, C. L., Houlton, A. J., Gallagher, W. J., Hjelle, M. A., Laske, T. G., Morissette, J., Iaizzo, P. A. Isolated four-chamber working swine heart model. Ann. Thorac. Surg. 70, 1607-1614 (2000).
  24. Hill, A. J., Laske, T. G., Coles, J. A., Sigg, D. C., Skadsberg, N. D., Vincent, S. A., Soule, C. L., Gallagher, W. J., Iaizzo, P. A. In vitro studies of human hearts. Ann. Thorac. Surg. 79, 168-177 (2005).
  25. Schenkman, K. A. Cardiac performance as a function of intracellular oxygen tension in buffer-perfused hearts. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281, H2463-H2472 (2001).
  26. Pijl, A. J., Pfaffendorf, M., Mathy, M., Van Zwieten, P. A. Cardioprotection by nifedipine in isolated working hearts: A comparative study on three different types of experimental ischemia. J. Cardiovasc. Pharmacol. 21, 70-76 (1993).
  27. Khatib, S. Y., Boyett, M. R. Effects of glyburide (glibenclamide) on myocardial function in langendorff perfused rabbit heart and on myocardial contractility and slow calcium current in guinea-pig single myocytes. Mol. Cell Biochem. 242, 81-87 (2003).
  28. Kates, R. E., Yee, Y. G., Hill, I. Effect of albumin on the electrophysiologic stability of isolated perfused rabbit hearts. J. Cardiovasc. Pharmacol. 13, 168-172 (1989).
  29. Combs, C. A., Balaban, R. S. Direct imaging of dehydrogenase activity within living cells using enzyme-dependent fluorescence recovery after photobleaching (ED-FRAP). Biophys. J. 80, 2018-2028 (2001).
  30. Coremans, J. M., Ince, C., Bruining, H. A., Puppels, G. J. (Semi-)quantitative analysis of reduced nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence images of blood-perfused rat heart. Biophys J. 72, 1849-1860 (1997).
  31. Scholz, T. D., Laughlin, M. R., Balaban, R. S., Kupriyanov, V. V., Heineman, F. W. Effect of substrate on mitochondrial NADH, cytosolic redox state, and phosphorylated compounds in isolated hearts. Am. J. Physiol. 268, 82-91 (1995).
  32. Holcomb, M. R., Woods, M. C., Uzelac, I., Wikswo, J. P., Gilligan, J. M., Sidorov, V. Y. The potential of dual camera systems for multimodal imaging of cardiac electrophysiology and metabolism. Exp. Biol. Med. (Maywood). 234, 1355-1373 (2009).

Comments

1 Comment

  1. This is an amazing video and resource! Thank you!

    Reply
    Posted by: stacy b.
    July 26, 2012 - 12:51 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics