טיהור vacuoles הפתוגן מ

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

מאמר זה מתאר שיטה בידוד וטיהור של שלמה

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Hoffmann, C., Finsel, I., Hilbi, H. Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes. J. Vis. Exp. (64), e4118, doi:10.3791/4118 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

פתוגן אופורטוניסטי הלגיונלה pneumophila הוא חיידק עמיד אמבה, אשר גם משכפל ב מקרופאגים מכתשיים ובכך גורם לדלקת ריאות חמורה "הליגיונרים" מחלה "1. ב phagocytes protozoan ו יונקים, ל pneumophila מעסיקה מנגנון משומר כדי ליצור מסוים, שכפול התא, מתירנית, "הלגיונלה המכיל vacuole" (LCV). היווצרות LCV דורש חיידקי ICM / דוט סוג מערכת הפרשת IV (T4SS), אשר translocates רבים כמו 275 "מפעיל" חלבונים לתוך התאים המארחים. Effectors לתפעל את החלבונים המארחות, כמו גם שומנים לתקשר עם הפרשה, האברונים endosomal ואת המיטוכונדריה 2-4.

היווצרות LCVs מהווה תהליך מורכב, חזק מיותר, שהיא קשה להבנה בצורה רדוקציוניסטית. גישה אינטגרטיבית נדרש להבין באופן מקיף היווצרות LCV, כולל ניתוח גלובלי של נתיבעוגן מארח גורם האינטראקציות והדינמיקה הזמן והמרחב שלהם. כצעד ראשון לקראת מטרה זו, LCVs שלמים הם מטוהרים ונותחו על ידי proteomics ו lipidomics.

הרכב היווצרות של הפתוגן המכילים vacuoles נחקר על ידי ניתוח proteomic באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית או 2-D ג'ל אלקטרופורזה מצמידים את ספקטרומטר מסה. Vacuoles מבודד או discoideum אדמה חברתית אמבה Dictyostelium או phagocytes יונקים טיפח שושנת יריחו 5, 6 ליסטריה, Mycobacterium 7, Rhodococcus 8, 9 או סלמונלה הלגיונלה spp. 10. עם זאת, הפרוטוקולים טיהור המועסקים מחקרים אלה זמן רב ומייגע, כפי שהם דורשים מיקרוסקופ אלקטרונים למשל לנתח מורפולוגיה LCV, יושר וטוהר. בנוסף, פרוטוקולים אלה אינם מנצלים תכונות ספציפיות של vacuole הפתוגן עבור enrichment.

השיטה המוצגת כאן מתגבר על מגבלות אלה על ידי העסקת ד discoideum לייצר סמן פלואורסצנטי LCV ועל ידי מיקוד SidC חיידקי חלבון מפעיל, אשר סלקטיבי עוגנים קרום LCV באמצעות קשירה phosphatidylinositol 4-פוספט (PtdIns (4) P) 3,11. LCVs מועשרים בשלב הראשון על ידי הפרדה חיסונית מגנטי באמצעות נוגדן זיקה-מטוהרים העיקרי נגד SidC ו נוגדנים משני מצמידים את החרוזים מגנטיים, ולאחר מכן בשלב השני על ידי צנטריפוגה קלאסית צפיפות Histodenz שיפוע 12,13 (איור 1) .

המחקר proteome של LCVs מבודד ד discoideum עולה יותר מ 560 התא המארח חלבונים, כולל חלבונים הקשורים שלפוחית ​​phagocytic, המיטוכונדריה, מיון, Golgi, כמו גם GTPases שונים, אשר לא היו מעורבים ביצירת LCV לפני 13. LCVs מועשר מטוהרים עםפרוטוקול המתואר כאן ניתן לנתח עוד יותר על ידי מיקרוסקופ (immunofluorescence, במיקרוסקופ אלקטרונים), בשיטות ביוכימיות (מערב כתם) וגישות proteomic או lipidomic.

Protocol

1. ההכנות בידוד LCV

  1. פס ייצור את הלגיונלה pneumophila DsRed-Express 13,14 ממניות וגליצרול על צלחות אגר CYE עם 5 מיקרוגרם / מ"ל chloramphenicol (רמ"א) ארבעה ימים לפני בידוד LCV. דגירה של חיידקים על 37 ° C.
  2. את זרעי 1 x 10 7 ד discoideum בהפקת ה-GFP-calnexin או RAW264.7 מקרופאגים Murine ב 75 התרבות 2 ס"מ רקמות צלוחיות 1 זיהום לפני יום. השתמש 10 מ"ל HL5 בינוני עם 20 מיקרוגרם / מ"ל G418 של ד discoideum ו דגירה אמבות ב 23 ° C. עבור RAW264.7 מקרופאגים להשתמש 10 מ"ל RPMI 1640 בינוני השלימו עם FCS 10% (חום מומת) ו גלוטמין 1%, ולהגדיל את התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. השתמש לפחות שלוש צלוחיות 75 2 ס"מ לכל זיהום המדגם (6 מינימום 7 x 10 תאים).
  3. לחסן תרבות בין לילה עם ל ' pneumophila מהצלחת CYE. קח מבחנה 15 מ"ל עם 3 מ"ל בינוני כןו 5 מיקרוגרם / CAM מ"ל. לחסן עם μl 100 ההשעיה חיידקי להניב OD 600nm של 0.1. דגירה התרבות לילה על ההגה סיבוב מעל הראש ב 37 מעלות צלזיוס במשך 21-22 שעות.

2. LCV בידוד

  1. לשנות את המדיום של ד תאים discoideum להסיר את האנטיביוטיקה, אשר יפריע זיהום הבאה.
  2. למדוד את OD של תרבות לילה. חיידקים צריכים להגיע infectivity לשיאם ב 600nm OD של ≥ 3, אשר תואמים את 2 x 10 9 חיידקים למ"ל.
  3. להדביק את התאים על ידי הוספת כ 500 μl של ל ' pneumophila התרבות לילה לתאים הגדלים בינוני HL5 10 מ"ל (discoideum ד) או 10 מ"ל RPMI 1640 (מקרופאגים). זה מתאים ריבוי של זיהום (משרד הפנים) 50. לאחר מכן הזיהום מסונכרן על ידי צנטריפוגה של החיידק לתוך התאים ב 500 × ג'10 דקות. צנטריפוגה אחריועל דגירה של ד discoideum תאים במהירות של 25 ° C ואת RAW264.7 מקרופאגים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, בהתאמה. זמן ההדבקה של שעה 1 כוללת את הצעד צנטריפוגה.
  4. לאחר ההדבקה להסיר בינוני לשטוף את התאים פעם אחת כדי להסיר את החיידקים תאיים. השתמש קר כקרח חיץ Sorc עבור ד discoideum וקרח קר PBS עבור RAW264.7 מקרופאגים. הוסף 3 מ"ל HS חיץ, השלימו עם מעכבי פרוטאז (רוש) על כל בקבוק ולאסוף את התאים באמצעות מגרד התא. בריכת דגימות המתאימים במבחנה 15 מ"ל.
  5. עבור homogenization של השימוש מדגם 3 מ"ל פלסטיק Luer-נעל מזרקים פלדה אל חלד הכדור homogenizer. ודא כי אתה עובד על קרח. לפני שמתחילים, לשטוף homogenizer הכדור עם מים מזוקקים, כדי למנוע זיהום חומר ניקוי ולשטוף אותו עם חיץ קר קרח HS להיפטר בועות אוויר. השתמש 8 אישור הכדור מיקרומטר.
  6. מלא מ"ל 1 3 לתוך und את המזרק להרכיב אותו על הדואר homogenizer. לחצו על מדגם הלוך ושוב תשע פעמים דרך homogenizer. להחליף את המזרקים לאחר מכן, כדי למנוע זיהום בחומר הלא הומוגני. איסוף ובריכת מדגם הומוגני במבחנה 15 מ"ל ולקחת מדגם 150 μl ניתוח מיקרוסקופי. לפני שתמשיך מדגם שונה לפרק ולשטוף homogenizer הכדור.
  7. חסום homogenate עם CS 2% או FCS למשך 30 דקות על שאכר על הקרח או על גלגל תקורה-ספינינג (10-20 סל"ד) בשעה 4 ° C.
  8. לאחר חסימת משתמשים נוגדן זיקה-מטוהרים העיקרי נגד SidC (דילול 1:3000) או נגד הסמן כל חיידקי אחר מחייב אך ורק קרום LCV. מערבולת נוגדנים פתרון לפני הוספתו homogenate. דגירה לדוגמה עבור שעות 1 על שאכר על הקרח או על הגלגל מעל הראש, ספינינג (10-20 סל"ד) בשעה 4 ° C.
  9. בינתיים, מכינים את שיפוע Histodenz. השתמש מבחנה 15 מ"ל לכל צבע ושלושה 75 ס"מ 2 בקבוקי מדגם 1. אשוחרחוב, להוסיף 5.75 מ"ל של Histodenz 35% ל הצינור, ושנית, בזהירות להוסיף 5.75 מ"ל של תמיסת Histodenz 10% למעלה. לאחר מכן בזהירות להניח את הצינורות לאורך אופקית של 1 שעה.
  10. לאחר דגירה של homogenate מגיב עם חסימת נוגדן ראשוני, צנטריפוגות ב × 600 גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C עד גלולה המדגם. מחק supernatant ו resuspend גלולה במאגר HS 1.5 מ"ל. להעביר את דגימות צינור טרי 15 מ"ל הבדיקה לקחת דגימה 40 μl ניתוח מיקרוסקופי בהמשך.
  11. דגירה גלולה עם נוגדנים משני - מחשבי Mac נגד ארנב עיזים IgG חרוזים Micro (דילול 01:25) - למשך 30 דקות על שאכר ב 4 ° C. בינתיים, לשים את העמודות על בעל MACS מגנטי לאזן אותם עם מאגר 0.5 HS מ"ל.
  12. לאחר מכן, החל את דגימות לעמודה. איסוף 150 μl של זרימה באמצעות ניתוח מיקרוסקופי לאחר מכן. לשטוף את הטור שלוש פעמים עם חיץ 0.5 HS מ"ל.
  13. הסר את העמודות מ tהוא מגנט eluate את LCVs עם חיץ 0.5 HS מ"ל של גמירה מיידית. קח לדוגמה 20 μl לניתוח מיקרוסקופיים. שלב טיהור על ידי הפרדה חיסונית מגנטי צפוי להניב ל 1 × 10 7 נגוע ד discoideum תאים כ -1 × 10 6 LCVs שלמים, אשר על פי שבעה מועשר ב eluate לעומת זרימה עד 13.
  14. שים את צינורות מעבר צבע Histodenz בחזרה למצב אנכי ובזהירות לטעון eluate למעלה. בצנטריפוגה צינורות ב 3350 × g עבור שעות 1 ב 4 ° C.
  15. לאחר צנטריפוגה לקחת 1.5 מ"ל שברים החל מהחלק התחתון של המבחנה באמצעות ארוכה זכוכית פיפטה פסטר. בסך הכל שמונה לאסוף שברים, כל אחד מהחלק התחתון של הצינור. שכבות לא נראים לעין נצפות שיפוע Histodenz מתמשך. התשואה הגבוהה ביותר LCVs צפוי בדרך כלל ביחס של ~ 2 בשבריר 4 × 10 5 LCVs שלמים לכל 1 × 10 7fected אמבות 13. כמויות קטנות של LCVs נוכחים גם שברים 3 ו -5 בהתאמה. כך, התשואה הכוללת של LCVs מטוהרים הוא ~ 1 × 10 6 LCVs שלמים לכל 6 × 10 7 נגוע ד discoideum תאים 13. ההתאוששות של LCVs יכול להתבצע בטמפרטורת החדר (RT), ו LCVs נראים יציבים במשך כמה שעות.

3. ניתוח מיקרוסקופי של דגימות שנאספו

  1. הכן 24 גם שטוח התחתונה התרבות צלחת רקמות עם פולי-L-ליזין coverslips מצופים.
  2. פיפטה כל מדגם נלקח במהלך טיהור LCV בתוספת 150 μl של חלק זה צפיפות הדרגתי לתוך צלחת של 24 הבאר. הוסף 0.5 מ"ל חיץ HS היטב בכל לדלל את ריכוז גבוה Histodenz. לאחר מכן, בצנטריפוגה צלחת ב 600 × ג'10 דקות ב 4 ° C. מוציאים בזהירות את supernatant ולתקן את הדגימות עם paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 20 דקות ב RT. לאחר קיבוע לשטוף את דגימות פעמיים. לנודואר Sorc עבור ד discoideum ו PBS עבור RAW264.7 מקרופאגים.
    1. הר את דגימות ה-GFP-calnexin המבטאים ד discoideum, נלקחה ב שלבים שונים במהלך הבידוד LCV, ישירות למוצרי שקופיות הזכוכית באמצעות Vectashield למשל.
    2. דגירה של דגימות RAW264.7 מקרופאגים, שצולמו במהלך שלבים שונים בידוד LCV, עם פתרון חסימת (1% BSA ב PBS) 10 דקות ב RT. השתמש נוגדנים נגד SidC העיקרי להכתים את LCVs ו דגירה של 1h בחדר רטוב ב RT (זיקה, מזוכך הארנב נגד SidC: 1:1000 בחסימת המאגר). לאחר מכן לשטוף את דגימות שלוש פעמים עם PBS. דגירה עם נוגדנים משני (למשל נגד ארנב Cy5: 1:200 לבלום פתרון) למשך 30 דקות בחדר רטוב כהה RT. סוף סוף, לשטוף את דגימות שלוש פעמים עם PBS ו הר להם on-שקופיות הזכוכית באמצעות Vectashield למשל.
  3. , מורפולוגיה שלמות וכמות של LCVs מבודד GFP-calnexin להביע ד דיסcoideum או RAW264.7 מקרופאגים הם נותחו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצוידים במסננים הולמים.

4. נציג תוצאות

איכות תשואה של טיהור LCV ידי הפרדה חיסונית הזיקה ואת שיפוע צנטריפוגה צפיפות יכולה להיות מלווה מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1). סקירה של דגימות שנאספו במהלך הבידוד LCV מ ד discoideu מ 'או מקרופאגים מוצג (איור 2). Homogenate של ל pneumophila נגועים phagocytes מראה LCVs שלמים, אבל גם הרבה פסולת תאים וחיידקים תאיים. לאחר pelleting לדוגמה, התמונה דומה homogenate, לפעמים קצת צפוף. מאז LCVs שלמים לדבוק הטור, זרימה דרך מכיל בעיקר חיידקים תאיים ופסולת התא. לאחר משחררי מדגם מהעמודה, eluate מכיל LCVs שלמים בכמות גדולה. בידינו, LCV purificati ב נראה יעיל יותר עבור ד discoideum מאשר מקרופאגים. ב ד את discoideum vacuoles פתוגן מופיעים עגולים תשואה של LCVs מבודדים הוא יותר מ -10 פעמים גבוה יותר בהשוואה מקרופאגים (איור 3). ב מקרופאגים שלמים LVCs מוכתמים נוגדנים שונים מופיעים גם יותר צורה בלתי מוגדרת.

איור 1
1. תרשים סכמטי סקירה של בידוד LCV. א) בידוד של LCVs ידי הפרדה חיסונית מגנטי באמצעות נוגדן זיקה, מטוהרים מפני SidC חלבון חיידקי מפעיל, למקם אך ורק קרום LCV. MACS משני מיקרו חרוז מצמידים נוגדנים ואת מגנט משמשים לבודד LCVs מן ההריסות התא. ב) לאחר חיסוני מגנטיים LCVs ההפרדה מטוהרים עוד יותר על ידי צנטריפוגה שיפוע Histodenz צפיפות. LCVs מועשרים בשבריר 4.

upload/4118/4118fig2.jpg "/>
דוגמאות באיור 2. שנאסף במהלך טיהור LCV. תמונות homogenate, גלולה, זרימה דרך eluate ו מ ד discoideum או מקרופאגים מתוארים. דגימות עולה ל pneumophila לייצר DsRed-Express (אדום) ד discoideum בהפקת ה-GFP-calnexin האות (על לוח ירוק, העליון) או מקרופאגים מוכתמים נוגדנים נגד SidC (ציאן, הפאנל התחתון). ברים, 10 מיקרומטר.

איור 3
איור 3. מטוהרים LCVs מ ד discoideum או מקרופאגים. הדגימות להראות חלק 4 לאחר צנטריפוגה צפיפות Histodenz שיפוע של ל pneumophila לייצר DsRed-Express (אדום) (א) ד discoideum בהפקת ה-GFP-calnexin האות (ירוק) או (ב) מקרופאגים מוכתמים נוגדנים נגד SidC (ציאן). ברים, 10 מיקרומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בניגוד לשיטות שפורסמו בעבר, פרוטוקול זה מבוסס על שני שלבים, 1 הפרדת LCVs ידי גישה חיסונית מגנטי, והשני, טיהור LCVs על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות. בידוד LCV ניתן בעקבות בקלות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כאשר גם חיידקים שכותרתו fluorescently ו-GFP תאים מייצרי נוגדנים או כתמים משמש. פרוטוקול המתואר כאן הוא פשוט, ישר קדימה השיטה, מה שגורם להעשרת LCVs עם טוהר גבוה. חשוב לציין, מעכבי פרוטאז במאגר homogenization נדרש RAW264.7 מקרופאגים, אבל לא חובה עבור discoideum ד 13.

בעיקרון, פרוטוקול יכול להיות מאומץ על פתוגנים אחרים או תאים מארחים, כל עוד סמן ספציפי, סלקטיבי לאיתור קיים, אשר יש צורך לשלב ההפרדה. באופן אידיאלי, סמן מובהק הוא ממוצא חיידקי, מועברים אל קרום vacuole,ND סלקטיבי למקם שם. מיקוד התא המאכסן סמן תוצאות סביר רצוי שיתוף טיהור vacuole הפתוגן עם תאים תאים אחרים המארחות.

לאחר סמן מובהק של vacuole הפתוגן מזוהה, נוגדן חד שבטי או polyclonal מתאים צריך לגדול. עבור כל נוגדן ראשוני ריכוז מגיב חסימת צריך להיות מותאם, כמו חסימת חומרים כימיים שאינם FCS יכול להיות מתאים יותר (למשל ה-BSA, דה lipidated חלב, חומרים כימיים אחרים החוסמים זמינים מסחרית).

עוד נקודה קריטית היא infectivity של הפתוגן. החיידקים המשמשים זיהום צריך להיות בשלב ביותר שלהם מזהם. ל pneumophila, למשל, צריך להיות מבוגר לשלב הצמיחה נייח post-exponential/early בתרבות נוזלי. בתנאים אלה, החיידקים גם מורפולוגית אחידה (~ 2 x 0.5 מיקרומטר), לעומת חיידקים הגדלים על צלחות אגר CYE. יתר על כן, antibiotics בשימוש ואולי במדיום תרבית תאים יש להסיר לפני ההדבקה, כדי למנוע נזק infectivity נמוך על חיידקים. כדי למנוע השפעה שלילית על יעילות ספיגת, phagocytes צריכים הגיעו confluency של כ% 80 (לא יותר) בזמן של זיהום. לבסוף, אם כי תקופת הדגירה של שעה 1 זה הזמן זיהום תקן ל pneumophila, מניב האוכלוסייה הומוגנית למדי ויציב של LCVs, בנקודות זמן אחרות ניתן לבחור ללימודי proteomic או ביוכימי על היווצרות LCV 13.

פעם השיטה הנ"ל היא הוקמה עבור זוג הפתוגן-מארח נתון בתא, אפשר גם לבחון זני חיידקים מוטנטים ו / או תאים מארחים שונים, כולל ד ' discoideum מוגדר מוטציות המחיקה. באופן כללי, vacuoles פתוגן מטוהרים עם פרוטוקול זה ניתן לנתח בשיטות שונות, כולל מיקרוסקופיה (מיקרוסקופ פלואורסצנטי אלקטרונים), ביוכימיות (מבחני המערבי כתם), כפי שאנוLL כמו proteomics ו lipidomics. על שיטות האחרונים, מומלץ לתאם עם הממונה על proteomics / lipidomics ניתוח התנאים חיץ, כמויות מדגם ועיבוד במורד מטוהרים vacuoles הפתוגן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגוד עניינים הצהיר.

Acknowledgements

מחקר במעבדה שלנו נתמך על ידי מקס פון Pettenkofer המכון, לודוויג מקסימיליאן, אוניברסיטת מינכן, קרן המחקר הגרמנית (DFG, HI 1511/3-1) ואת הפרווה Bundesministerium Bildung und Forschung (BMBF) "Genomics זיהום רפואי" היוזמה ( 0315834C).

References

  1. Hilbi, H., Hoffmann, C., Harrison, C. F. Legionella spp. outdoors: colonization, communication and persistence. Environ. Microbiol. Rep. 3, 286-296 (2011).
  2. Zhu, W. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS ONE. 6, e17638 (2011).
  3. Hilbi, H., Weber, S., Finsel, I. Anchors for effectors: subversion of phospho-inositide lipids by Legionella. Front Microbiol. 2, 91 (2011).
  4. Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
  5. Kima, P. E., Dunn, W. Exploiting calnexin expression on phagosomes to isolate Leishmania parasitophorous vacuoles. Microb. Pathog. 38, 139-145 (2005).
  6. Lührmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22, 329-341 (2000).
  7. Sturgill-Koszycki, S., Haddix, P. L., Russell, D. G. The interaction between Mycobacterium and the macrophage analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. 18, 2558-2565 (1997).
  8. Fernandez-Mora, E., Polidori, M., Lührmann, A., Schaible, U. E., Haas, A. Maturation of Rhodococcus equi-containing vacuoles is arrested after completion of the early endosome stage. Traffic. 6, 635-653 (2005).
  9. Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y. pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur. J. Cell Biol. 77, 35-47 (1998).
  10. Shevchuk, O. Proteomic analysis of Legionella-containing phagosomes isolated from Dictyostelium. Int. J. Med. Microbiol. 299, 489-508 (2009).
  11. Brombacher, E. Rab1 guanine nucleotide exchange factor SidM is a major phosphatidylinositol 4-phosphate-binding effector protein of Legionella pneumophila. J. Biol. Chem. 284, 4846-4856 (2009).
  12. Urwyler, S., Finsel, I., Ragaz, C., Hilbi, H. Isolation of Legionella-containing vacuoles by immuno-magnetic separation. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 (2010).
  13. Urwyler, S. Proteome analysis of Legionella vacuoles purified by magnetic immunoseparation reveals secretory and endosomal GTPases. Traffic. 10, 76-87 (2009).
  14. Mampel, J. Planktonic replication is essential for biofilm formation by Legionella pneumophila in a complex medium under static and dynamic flow conditions. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2885-2895 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics