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Lebertransplantation bei der Ratte

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Summary

Wir präsentieren einen einfach zu etablieren Revision der klassischen Zwei-Manschette Technik zur orthotopen Lebertransplantation in der Ratte.

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Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C. Orthotopic Liver Transplantation in Rats. J. Vis. Exp. (65), e4143, doi:10.3791/4143 (2012).

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Abstract

Klinische Fortschritte auf dem Gebiet der Lebertransplantation wurde weitgehend durch Tiermodelle 1,2 unterstützt. Seit der Veröffentlichung des ersten orthotopen Ratten-Lebertransplantation im Jahr 1979 von Kamada et al. 3, ist dieses Modell blieb der Goldstandard trotz verschiedener vorgeschlagenen alternativen Techniken 4. Dennoch wird seine breitere Nutzung durch seine steile Lernkurve 5 beschränkt.

In diesem Video-Papier zeigen wir, eine einfache und leicht zu etablieren Revision Kamada Zwei-Manschette Technik. Die suprahepatische Hohlvene Anastomose wird manuell mit einer fortlaufenden Naht durchgeführt, und die Pfortader und Hohlvene infrahepatische Anastomosen unter der Verwendung einer Schnell-Linker Ärmel-System 6. Die Herstellung des Quick-Linker-Kit wird in einem separaten Video-Papier gezeigt.

Protocol

1. Donor Betrieb

  1. Anesthetize männlichen Ratten mit einem Gewicht von 200 ± 20 Gramm mit Isofluran auf Kegel-Maske (3% für die Induktion, 2% während der Operation, 1 l / min Luftmenge, FiO2 70%).
  2. Führen Sie eine große mediane und transversale Laparotomie und ätzen die epigastrischen Gefäße auf beiden Seiten.
  3. Schneiden Sie das Lig. falciforme, und trennen Sie die linke Zwerchfell-Vene aus dem suprehepatic Hohlvene. Schließlich teilen die Zwerchfell-Ader zwischen zwei 7-0 Seidenligaturen.
  4. Schneiden Sie den linken dreieckigen und die Magen-und Leber-Bänder.
  5. Teilen Sie die Leber-und Speiseröhren-Band-und Arterie zwischen 7-0 Ligaturen (Koagulation ist eine gute Alternative).
  6. Isolieren Sie die infrahepatische Hohlvene bis in die linke Nierenvene. Trennen der rechte Nierenvene von den umgebenden Geweben und teilt ihn zwischen einer 10-0 und einem 7:0-Ligatur an seinem proximalen und distalen Enden.
  7. Teilen Sie die rechte Nebenniere Vene zwischen 7-0 LigaturES und frei von der Leber seiner hinteren Bänder durch Abschneiden unter leichtem Zug.
  8. Isolieren der gastro-Vene und teilt ihn zwischen einer 10-0 und einem 7:0-Ligatur an seinem proximalen und distalen Enden.
  9. Teilen Sie die A. hepatica propria zwischen 7-0 Krawatten.
  10. Isolieren der duodenojejunalis Pankreas Vene und teilte sie zwischen einer 10-0 und einem 7:0-Ligatur an seinem proximalen und distalen Ende, jeweils.
  11. Legen Sie eine 22G, 3,5-mm-Stent in den Gallengang durch Üben einen kleinen Schnitt bei 1 cm Abstand von der Leber Hilus. Sichern Sie den Stent in Position mit einer 7-0 Ligatur.
  12. Injektion von 10 UI von Heparin in 1 ml physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, durch die dorsale Vene des Penis.
  13. Kanülieren die Pfortader (so weit wie möglich aus dem Hilus) mit einer 21G-Nadel und schonend spülen Sie die Leber mit 20 ml kaltem Ringer-Laktat (oder andere Konservierungslösungen). Gleichzeitig, schneiden die Vena cava unterhalb der Nierenarterien Venen, um eine ausreichende outfl ermöglichenow. Leber kalte Perfusion sollte zwischen einer und zwei Minuten dauern.
  14. Schneiden Sie die Pfortader unterhalb der duodeno-pankreatischen Vene.
  15. Schneiden Sie den Choledochus distal der Ligatur um den Stent herum.
  16. Füllen Sie das Anschneiden des infrahepatische Hohlvene.
  17. Schneiden Sie die suprahepatische Hohlvene zu überfliegen, um die Membran zu entfernen und die Leber.
  18. Legen Sie die Leber in ein Becken mit kaltem Ringer-Laktat gefüllt und legen Sie das Becken auf einer Eis-Pad.

2. Graft Vorbereitung

  1. Legen Sie die Pfortader in die Manschette, dann evertieren das Schiff um den Rand, um die Intima aussetzen. Sichern Sie den umgestülpten Segment an der Manschette mit einem 7-0 Ligatur.
  2. Den gleichen Vorgang auf der infrahepatische Hohlvene.
  3. Positionieren eines Mikro-Klemme (4-6 mm Länge) auf dem proximalen Teil des infrahepatische Hohlvene. Dieser Vorgang vermeidet Blutverlust nach Reperfusion Portal.
  4. Kippe das Leber und legen Sie zwei Prolene 8-0 Nähtenan den gegenüberliegenden seitlichen Kanten des suprahepatische Hohlvene, von außen nach innen.
  5. Bewahren Sie das Transplantat (eingetaucht in die Ringer-Laktat-Lösung) im Kühlschrank bei 0-4 ° C

3. Der Betrieb des Empfängers:

  1. Anesthetize männlichen Ratten mit einem Gewicht von 200 ± 20 Gramm mit Isofluran auf Kegel-Maske (3% für die Induktion, 2% während der Operation, 1 l / min Luftmenge, FiO2 70%) und halten an einem warmen Pad. Zu beachten ist, sollten Empfänger und Spender Gewichte abgestimmt (± 40 Gramm) werden.
  2. Injektion von 10 ml physiologischer Kochsalzlösung subkutan und 0,03 g Piperacillin / Tazobactam intramuskuläre vor Laparotomie.
  3. Führen Sie eine Mittellinie xipho-Scham-Laparotomie.
  4. Kehren Sie die Schwertfortsatz mit einer Auto-static Zange, um besser entlarven die Leber.
  5. Schneiden Sie die vorderen Bänder und teilen Sie die linke Zwerchfell-Ader zwischen zwei Verbindungen 7-0.
  6. Teilen Sie die Leber-und Speiseröhren-Band-und Arterie zwischen 7-0 Ligaturen (coagulation ist eine gute Alternative). Nicht im Video (identisch mit Spender-Betrieb) dargestellt.
  7. Isolieren Sie die infrahepatische Hohlvene bis in den rechten Nierenvene.
  8. Teilen Sie die rechte Nebenniere Vene zwischen 7-0 Ligaturen und frei von der Leber seiner hinteren Bänder durch Abschneiden unter leichtem Zug (nicht im Video gezeigt (identisch mit Spender Betrieb)).
  9. Legen Sie eine 7-0 Ligatur um den Choledochus, knapp unterhalb seiner Division. Anders Ligatur unterhalb einem Millimeter geschnitten und dazwischen.
  10. Isolieren Sie die Leberarterie am Hilus und teilen es zwischen 7-0 Ligaturen.
  11. Sanft getrennte linke und rechte Portal Filialen. Achten Sie nicht auf die gemeinsame Leberarterie oder den Magen-Milzvene beschädigen.
  12. Positionieren Sie den caval Ring um die Vena Cava, kranial auf der rechten Nierenvene. Dann sichern Sie die Gefäßwand in den Ring, indem sie vier Himmelsrichtungen 9-0 Nähten.
  13. Den gleichen Vorgang mit dem Portal-Ring auf der Pfortader. Injektion von 10 UI von Heparin in 1 ml physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, durch die dorsale Vene des Penis.
  14. Stellen Sie die Anästhesie auf 0,25% und die FiO2 auf 100%.
  15. Klemmen Sie den infrahepatische Hohlvene knapp oberhalb der rechten Nierenvene, dann klemmen die Pfortader direkt über den Magen-Milzvene. Schließlich klemmen die suprahepatische Hohlvene dass auf jeden Fall mindestens 2 mm von Membran enthalten.
  16. Schneiden Sie die suprahepatische Hohlvene in der Nähe des Parenchyms.
  17. Schneiden Sie das linke und das rechte Portal Niederlassungen und teilen das Septum dazwischen.
  18. Schneiden Sie die infrahepatische Hohlvene in der Nähe des Parenchyms, achten nicht auf eine der Nähte vorher einzuschneiden positioniert. Entfernen Sie die Leber und legen Sie das Transplantat in die Bauchhöhle.
  19. Führen Sie eine End-to-End-Anastomose zwischen der suprahepatische Hohlvene des Transplantats und des Empfängers. Beginnen Sie mit der fortlaufenden Naht der Hinterwand von links nach rechts, dann an der vorderen Wand von rechts nach Le vorgehenm Halten der vordere Naht lose bis zum Ende, um eine großzügige Spülung des inneren Lumen vor dem Anziehen der Enden zu ermöglichen.
  20. Legen Sie die kaudalen Zweig der Approximator in das Portal Ringgriff, dann legen Sie die Pfortader des Transplantats in den Schlitz des kranialen Zweig der Approximator, mit dem Portal zu finden Manschette seine Position in den Steckplatz.
  21. Schließen Sie die Näherungseinrichtung bei der Spülung des Empfängers Pfortader mit normaler Kochsalzlösung und lassen sich die Manschette in das Gefäß einzuführen. Sichern des Empfängers Pfortader um seine Manschette mit einem umlaufenden Band 7-0.
  22. Entfernen Sie die Approximator. Öffnen Sie die Klemme an der suprahepatische Hohlvene und die Pfortader in Ordnung: Portal Flow ist nun wieder hergestellt.
  23. Entfernen Sie das Portal Ring durch Schneiden der 9-0 Ligaturen mit extra-feinen Schere.
  24. Legen Sie die kaudalen Zweig der Approximator in den Griff caval Ring, dann legen Sie die infrahepatische Hohlvene des Transplantats in den Schlitz an der Schädelbasis Zweig der Approximator, mit der Manschette zu finden caval seine Position in den Steckplatz.
  25. Schließen Sie die Näherungseinrichtung bei der Spülung des Empfängers infrahepatische Hohlvene mit normaler Kochsalzlösung und lassen sich die Manschette in das Gefäß einzuführen. Sichern des Empfängers Hohlvene um seine Manschette mit einem umlaufenden Band 7-0.
  26. Entfernen Sie die Approximator. Öffnen Sie die microclamps auf der infrahepatische Hohlvene des Transplantats und des Empfängers in dieser Reihenfolge: venöse Strömung wird jetzt wieder hergestellt.
  27. Führen Sie eine partielle Inzision des Empfängers Choledochus, wenden Sie einen leichten Zug in Richtung des Kopfes, und legen Sie die freie Seite des Stents zuvor in den Gallengang des Transplantats eingesetzt. Sichern Sie den Stent mit einem umlaufenden 7-0 Unentschieden.
  28. Schließen Sie das Tier durch Schichten mit 5-0 Nähten. Erlauben Sie kostenlos Wasser und Nahrung aus Erwachen.
  29. Verwalten effektive Analgesie nach lokaler institutioneller Protokolle. Eine Mindestdauer von 24 h wird empfohlen.
_content "> Zu beachten ist: End-to-End-Leberarterie Anastomose durchgeführt werden, wenn durch den Experimenten (die Arterie nicht für ein langfristiges Überleben nach der Transplantation erforderlich Rattenleber) erforderlich.

4. Repräsentative Ergebnisse

Die beschriebene Technik konnte erfolgreich von unserem Team werden nach etwa 10 Operationen Ausbildung gemeistert. Es erlaubt 100% langfristig (> 21 Tage) Überleben auf 36 aufeinander folgenden Lewis-to-Lewis und Dark Agouti-to-Lewis Transplantationen, nach der kurzen Einarbeitungszeit (eine Reihe von syngenen Leber Transplantat-Empfänger wurden am Leben gehalten werden seit über 12 Monate jetzt). Post-syngene Transplantation Tag 1 Leberwerte zeigten mediane Aspartat-Transaminase (AST): 84 U / l (51,7-92,7) und die mediane Alanin-Transaminase (ALT): 172,5 U / l (127,5-240,2). Die mittlere anhepatischen Phase (ab Pfortader Spannen zu pfropfen Re-Perfusion) lag bei 14 ± 2 min, mit der längsten Schritt die suprahepatische Hohlvene Anastomose (s läuftukunft) Zeit 9 ± 2 min.

Die Schnell-Linker-System erlaubt die Positionierung der 1,55 mm-Bohrung Bündchen an Pfortader und 2,40 mm-Bohrung Bündchen an Hohlvene (Empfänger mit einem Gewicht von 200 ± 20 g). Im Gegensatz dazu, wenn wir die Transplantation mit Kamada die Technik ausprobiert, konnten sie nicht mehr als 1,40 mm und 2,16 mm bzw. (Ratten passend für Belastung und Gewicht). Wie in 7 gezeigt, sind praktischen-Linker Ringe zur Empfängers Schiffe optimale Dehnung zu halten, so dass mindestens Dicke und Länge Verschwendung, die näher zu physiologischen hämodynamischen Ergebnisse ergibt.

1
Abbildung 1. Ringe Maßnahmen.

2
Abbildung 2. Microclamps Maßnahmen.

Abbildung 3
Abbildung 3. Quick-Linker-Kit.

Abbildung 4
Abbildung 4. Quick-Linker bewaffnet.

Abbildung 5
Abbildung 5. Quick-Linker geschlossen.

6
Abbildung 6. SHVC Klemme.

7
Abbildung 7. Classic vs Quick-Linker assistierten Manschette-Anastomose Hämodynamik.

8
Abbildung 8. Spender und Empfänger die Haut Vorbereitung und Schnitt.

Discussion

Die vorliegende Ratte Lebertransplantation Modell kann leicht festgestellt werden. Nach unserer Erfahrung helfen, ein paar wichtige Punkte, um das Risiko des Todes (≤ 20%). Frühen Tod, innerhalb der ersten drei Stunden von Reperfusion, sind meistens auf einer Darminfarkt, als Folge einer langen Portal Spannen. Es wird daher empfohlen, um die anhepatischen Phase innerhalb der idealen Grenze von 15 Minuten (20 Minuten noch akzeptabel) zu halten. Zentral Luftembolie kann auch eine Ursache des plötzlichen Todes sein und ist es Pflicht, alle Adern vor der Anastomose zu spülen.

Todesfälle zwischen postoperativen Tag eins und drei sind häufig durch Leberversagen oder Thrombose der Vena Cava. Man sollte daher vermeiden aggressive Transplantat Spülung vor der Explantation beim Spender (wir mit 20 ml spülen über ca. 60 Sekunden) und eine angemessene Konservierung (vollständiges Eintauchen in die 0-4 ° C Ringer-Laktat-Lösung). Das Risiko von Thrombosenkann durch die Minimierung der Manipulation der Intima und zur Gewährleistung ihrer Integrität verringert werden. Wir empfehlen nicht den Einsatz von Antikoagulation nach der Operation.

Todesfälle zwischen postoperativen Tag vier und neun werden oft zu bakterieller Cholangitis 7 bezogen. Basierend auf unserer Erfahrung, eine einzige Dosis von Piperacillin / Tazobactam (0,03 g) gegeben, bevor Laparotomie ist genug, um das Risiko von Choledochus Infektion zu minimieren.

Der Tod ist ein seltenes Ereignis nach dem 10. Tag. Jedoch, aufgrund der Abwesenheit von arterieller Strömung, können einige Probleme mit Gallengang cholastasis 8 beobachtet werden. Je nach den Anforderungen der Forscher ein Arterialisation kann dies von 9 werden. Zu beachten ist, kann eine kalte Ischämiezeit bis zu 24 Stunden als akzeptabel angesehen werden 10.

Die Schnell-Linker-System wurde ursprünglich entwickelt, um Lebertransplantation mit drei Manschette Anastomosen (sehr kurze anhepatischen Phase) durchzuführen. Allerdings ist die Drei-te Manschettechnique erfordert den Einsatz von sehr kleinen Bremssättel für die suprahepatische Hohlvene (SHVC) Manschette und es wurde noch nicht weit verbreitet, da das Risiko von Leber-Probleme Abfluss 11-14 akzeptiert. Wir favorisieren daher eine Quick-Linker unterstützte Drei-Manschette Technik nur, wenn warme Ischämie mal kürzer als 10 Minuten erforderlich sind. In den meisten Studien jedoch Implantation Phasen bis zu 15-18 Minuten akzeptabel sind, wodurch die Verwendung des Zwei-Manschette Technik und einer physiologischen SHVC Drainage. Wie in diesem Video Papier gezeigt, verwenden wir routinemäßig die praktischen-Linker-System im zweiten Teil der Implantation nur. Während einige zusätzliche chirurgische Zeit ist erforderlich, um die Quick-Linker Griff zu positionieren, wird dieser Teil des Verfahrens, mit minimalen Risiken verbunden und ermöglicht eine Verkürzung der kritischen anhepatischen Phase dank einfacher Manschetten Insertionen. Weitere Vorteile der praktischen-Linker-System sind eine bessere Transplantat-Empfängers Gefäßausrichtungsrichtung und die Verwendung von breiteren Manschetten mit bessere hämodynamische Ergebnisse im Vergleichbisher beschriebenen Techniken (einschließlich der von Kamada et al.) 6 (Abb. 7).

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

CT wurde vom Schweizerischen Nationalfonds (SNF SCORE Zuschuss 3232230-126233) unterstützt. Die Studie wurde von der Artères Stiftung, der Stiftung Astellas Europa und den Boninchi Stiftung unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tool / Reagent Company Catalogue n. Comment
Portal cuff altecweb.com or smiths-medical.com Coil 01-96-1729 800/100/420 Bore : 1.55mm
Wall : 0.30mm
Length: 3.5 mm
Infrahepatic v. cava cuff altecweb.com or smiths-medical.com Coil 01-96-1733 800/100/540 Bore : 2.40mm
Wall : 0.30mm
Length: 3.5 mm
Common bile duct stent common 22G venflon    
7-0 silk ties georgetiemann.com 160-1226-7/0  
10-0 prolene ethicon.com    
9-0 prolene ethicon.com    
8-0 prolene ethicon.com    
Straight micro forceps s-and-t.net FRC-15RM-8  
Curved micro forceps s-and-t.net FRS-15-RM-8  
Dissection needle-holder s-and-t.net B-15-8.2  
Anastomosis needle-holder rumex.net 8-021T  
Micro clamps finescience.com 18055-03 6 x 1mm
Micro clamps applicator finescience.com 18057-14  
Suprahepatic v. cava clamp pharmap.ch 13.349.14  
Quick-Linker rings dltchiropody.co.uk PAR 10 modified scalpel blades
Quick-Linker approximator pharmap.ch UD-04-275 modified Kocher’s forcep

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References

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Comments

1 Comment

  1. Dear Professor/s

    Congratulations for an excellent paper and a very neat video of the procedure. It would have been even more remarkable with explanation and commentary while performing the procedures. While performing the procedure every word of an experienced surgeon is worth and it makes learning easy and minimizes mistakes.

    Sincerely

    Pramod Upadhyay
    National Institute of Immunology, New Delhi, India

    Reply
    Posted by: Pramod U.
    July 14, 2012 - 7:16 AM

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