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Trapianto di fegato in ratti

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Vi presentiamo uno facile da stabilire revisione della classica due-bracciale tecnica di trapianto di fegato nel ratto.

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Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C. Orthotopic Liver Transplantation in Rats. J. Vis. Exp. (65), e4143, doi:10.3791/4143 (2012).

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Abstract

Progressi clinici nel campo del trapianto di fegato è stata ampiamente supportata da 1,2 modelli animali. Dopo la pubblicazione del primo trapianto ortotopico di fegato di ratto nel 1979 da Kamada et al. 3, questo modello è rimasto il gold standard, nonostante le varie tecniche proposte alternative 4. Tuttavia, il suo utilizzo più ampio è limitato dalla sua curva di apprendimento ripida 5.

In questo documento video, mostrano una revisione semplice e facile da stabilire-di Kamada a due bracciale tecnica. La vena cava sovraepatica anastomosi viene eseguita manualmente con una sutura continua, e la vena porta e infraepatica anastomosi vena cava vengono eseguite utilizzando un sistema di quick-linker bracciale 6. Produzione del quick-linker kit è indicato in un documento video separato.

Protocol

1. Donatori di funzionamento

  1. Anestetizzare ratti maschi peso 200 ± 20 grammi con isoflurano sul cono maschera (il 3% per l'induzione, 2% durante l'operazione, 1 'aria l / min di flusso, FiO2 70%).
  2. Eseguire una laparotomia mediana larga e trasversale e cauterizzare i vasi epigastrici su entrambi i lati.
  3. Tagliare il legamento falciforme, e separare la vena diaframmatica sinistra dal suprehepatic vena cava. Infine, dividere la vena diaframmatica tra due 7-0 legature di seta.
  4. Tagliare il triangolare di sinistra ed i legamenti gastro-epatiche.
  5. Dividere il legamento epato-esofageo e l'arteria tra 7-0 legature (coagulazione è una valida alternativa).
  6. Isolare il infraepatica vena cava fino alla vena renale sinistra. Separare la vena renale destra dai tessuti circostanti e dividerlo tra 10-0 e 7-0 legatura, sulle sue estremità prossimale e distale, rispettivamente.
  7. Dividere la vena surrenale destra tra 7-0 ligaturES e libera il fegato dai suoi legamenti posteriori, tagliando sotto una leggera trazione.
  8. Isolare la vena gastrosplenico e dividerlo tra 10-0 e 7-0 legatura, sulle sue estremità prossimale e distale, rispettivamente.
  9. Dividere l'arteria epatica corretta tra 7-0 legami.
  10. Isolare il duodeno-pancreatico vena e divisa fra un 10-0 e 7-0 uno legatura, sulla sua estremità prossimale e distale, rispettivamente.
  11. Inserire un 22G, stent 3,5 mm nel dotto biliare comune, praticando una piccola incisione di 1 cm di distanza dal ilo epatico. Fissare la stent in posizione con una legatura 7-0.
  12. Iniettare 10 UI di eparina, diluito in 1 ml di soluzione salina normale, attraverso la vena dorsale del pene.
  13. Incannulare la vena porta (per quanto possibile dall'ilo) con un ago 21G e delicatamente lavare il fegato con 20 ml di lattato suoneria freddo (o altre soluzioni di conservazione). Al tempo stesso, tagliare la vena cava inferiore le vene renali per consentire un adeguato outflow. Perfusione epatica freddo dovrebbe durare tra uno e due minuti.
  14. Tagliare la vena porta al di sotto del duodeno-pancreatico vena.
  15. Tagliare il dotto biliare comune distalmente alla legatura attorno allo stent.
  16. Completa l'incisione della vena cava infraepatica.
  17. Tagliare il sovraepatica vena cava skim al diaframma e rimuovere il fegato.
  18. Mettere il fegato in una bacinella piena di Ringer lattato freddo e laici del bacino su una base di ghiaccio.

2. Preparazione Graft

  1. Inserire la vena porta nel suo bracciale, poi questi vanno rovesciati con la nave intorno al bordo per esporre il intima. Bloccare il segmento di estroflesso sul bracciale con una legatura 7-0.
  2. Ripetere la stessa operazione sul infraepatica vena cava.
  3. Posizionare un micro-clamp (4-6 mm di lunghezza), sulla parte prossimale del sottoepatica vena cava. Questa operazione evita la perdita di sangue dopo riperfusione portale.
  4. Capovolgere il fegato e inserire due Prolene 8-0 punti di suturai bordi laterali opposti della sovraepatica vena cava, dall'esterno verso l'interno.
  5. Conservare l'innesto (immerso in soluzione di Ringer lattato) in frigorifero a 0-4 ° C.

3. Destinatario di funzionamento

  1. Anestetizzare ratti maschi peso 200 ± 20 grammi con isoflurano sul cono maschera (il 3% per l'induzione, 2% durante l'operazione, 1 'aria l / min di flusso, FiO2 70%) e mantenere su un blocco caldo. Da notare, pesi beneficiari e dei donatori dovrebbe essere abbinato (± 40 grammi).
  2. Iniettare 10 ml di soluzione fisiologica per via sottocutanea e 0,03 g di piperacillina / tazobactam intramuscolare prima della laparotomia.
  3. Eseguire una linea mediana xifo-pubica laparotomia.
  4. Inverso il processo xifoideo con un auto-statici forcipe per esporre meglio il fegato.
  5. Tagliare i legamenti anteriori e dividere la vena diaframmatica sinistra, tra due legami 7-0.
  6. Dividere il legamento epato-esofageo e l'arteria tra 7-0 legature (coagulation è una valida alternativa). Non mostrato nel video (identico al funzionamento del donatore).
  7. Isolare il infraepatica vena cava fino alla vena renale destra.
  8. Dividere la vena surrenale destra tra 7-0 legature e liberare il fegato dai suoi legamenti posteriori, tagliando in trazione leggera (non mostrato nel video (identico al funzionamento dei donatori)).
  9. Posizionare un 7-0 legatura attorno al dotto biliare comune, proprio sotto la sua divisione. In altre parole legatura uno millimetri al di sotto e tagliare in mezzo.
  10. Isolare l'arteria epatica all'ilo e dividerlo tra i 7-0 legature.
  11. Separare delicatamente i rami portale di sinistra e di destra. Prestare attenzione a non danneggiare l'arteria epatica comune o gastro-vena splenica.
  12. Posizionare l'anello attorno alla cava vena cava, cranialmente alla vena renale destra. Quindi fissare la parete del vaso per l'anello mettendo quattro cardinali 9-0 punti di sutura.
  13. Ripetere la stessa operazione con l'anello portale sulla vena porta. Iniettare 10 UI di eparina, diluito in 1 ml di soluzione salina normale, attraverso la vena dorsale del pene.
  14. Impostare l'anestesia 0,25% e la FiO2 al 100%.
  15. Bloccare il infraepatica vena cava appena sopra la vena renale destra, quindi fissare il porta appena sopra la vena gastro-vena splenica. Infine bloccare la vena cava sovraepatica essere sicuri di includere almeno 2 mm di diaframma.
  16. Tagliare il vicino sovraepatica vena cava al parenchima.
  17. Tagliare la sinistra ei rami portale di destra e dividere il setto in mezzo.
  18. Tagliare il vicino infraepatica vena cava al parenchima, facendo attenzione a non incidere uno dei punti di sutura precedentemente posizionati. Rimuovere il fegato e posizionare l'innesto nella cavità addominale.
  19. Eseguire un end-to-end anastomosi tra la vena cava sovraepatica del graft e del destinatario. Iniziare con la sutura continua della parete posteriore da sinistra a destra, quindi procedere sulla parete anteriore da destra verso left Mantenere la sutura anteriore sciolto fino alla fine per consentire un lavaggio generosa del lume interno prima di serrare le estremità.
  20. Inserire il ramo caudale del approssimatore nel manico anello portale, quindi inserire la vena porta dell'innesto nella fessura del ramo craniale del approssimatore, con il polsino portale trovando la sua posizione nella fessura.
  21. Chiudere la approssimatore durante il lavaggio del destinatario vena porta con soluzione fisiologica e consentire il bracciale da inserire nel vaso. Fissare il destinatario vena porta attorno al suo polso con un pareggio 7-0 circonferenziale.
  22. Rimuovere il approssimatore. Aprire il morsetto sul sovraepatica vena cava e vena porta al fine di: flusso portale è ora ristabilita.
  23. Rimuovere l'anello portale tagliando i 9-0 legature con olio extra-fini forbici.
  24. Inserire il ramo caudale della approssimatore nel manico ad anello caval, quindi inserire il infraepatica vena cava del trapianto nella fessura del cranio ramo del approssimatore, con il polsino cava trovando la sua posizione nella fessura.
  25. Chiudere la approssimatore durante il lavaggio del destinatario sottoepatica vena cava con soluzione fisiologica e consentire il bracciale da inserire nel vaso. Fissare il destinatario vena cava attorno al suo polso con un pareggio 7-0 circonferenziale.
  26. Rimuovere il approssimatore. Aprire le microclamps sul infraepatica vena cava dell'innesto e creditore in ordine: il flusso venoso è ora ristabilita.
  27. Eseguire una incisione parziale del dotto biliare comune del destinatario, applicare una leggera trazione verso la testa, e inserire il lato libero dello stent precedentemente inserita nel dotto biliare dell'innesto. Fissare lo stent con un pareggio 7-0 circonferenziale.
  28. Chiudere l'animale da strati con 5-0 punti di sutura. Lasciare l'acqua libera e alimenti provenienti da risveglio.
  29. Amministrare analgesia efficace secondo i protocolli locali istituzionali. Una durata minima di 24 h è raccomandato.
_content "> Da notare: end-to-end anastomosi dell'arteria epatica può essere eseguita, quando richiesto dal disegno sperimentale (l'arteria non è necessario per sopravvivenza a lungo termine dopo trapianto di fegato di ratto).

4. Risultati rappresentativi

La tecnica descritta può essere masterizzato con successo dal nostro team, dopo circa 10 interventi di formazione. Ha permesso al 100% a lungo termine (> 21 giorni) la sopravvivenza a 36 consecutive Lewis-to-Lewis e scuri Agouti-to-Lewis trapianti, dopo il periodo di formazione breve (un certo numero di destinatari singenici trapianto di fegato sono stati tenuti in vita per oltre 12 da mesi). Post-trapianto singenici giorno 1 test di funzionalità epatica ha mostrato mediana aspartato transaminasi (AST): 84 U / l (51,7-92,7) e alanina mediana transaminasi (ALT): 172,5 U / l (127,5-240,2). La fase anepatica media (dalla vena porta di bloccaggio ad innesto re-perfusione) è stata del 14 ± 2 minuti, con la più lunga fase è la vena cava sovraepatica anastomosi (in esecuzione sFUTURO) Tempo di 9 ± 2 min.

Il rapido linker sistema ha permesso il posizionamento di 1,55 mm-foro manette vena porta e 2,40 mm a canna manette vena cava (destinatari peso 200 ± 20 g). Al contrario, quando abbiamo provato il trapianto usando la tecnica Kamada, essi non potevano di 1,40 mm e 2,16 millimetri, rispettivamente (ratti corrispondenti per tensione e peso). Come mostrato in Figura 7, rapido-linker anelli sono progettati per mantenere destinatario su navi ottimale stiramento, permettendo minimo spreco pinza e lunghezza, che si traduce in risultati emodinamici più a-fisiologiche.

Figura 1
Figura 1. Misure Anelli.

Figura 2
Figura 2. Misure Microclamps.

Figura 3
Figura 3. Quick-linker kit.

Figura 4
Figura 4. Quick-linker armata.

Figura 5
Figura 5. Quick-linker chiuso.

Figura 6
Figura 6. Morsetto SHVC.

Figura 7
Figura 7. Classic vs quick-linker assistita bracciale-anastomosi emodinamica.

Figura 8
Figura 8. Donatore e la preparazione della cute del destinatario e incisione.

Discussion

L'attuale modello di ratto trapianto di fegato può essere stabilita facilmente. Nella nostra esperienza, alcuni punti chiave ridurre al minimo il rischio di morte (≤ 20%). Morti precoci, che si verificano entro le prime tre ore da riperfusione, sono spesso causa di un infarto intestinale, come conseguenza di un portale lungo bloccaggio. Si raccomanda pertanto di mantenere la fase anepatica entro il limite ideale di 15 minuti (20 minuti ancora accettabile). Central embolia gassosa può anche essere una causa di morte improvvisa ed è obbligatoria per scaricare tutte le vene prima di anastomosi.

I decessi che si verificano tra il giorno post-operatorio uno e tre sono spesso dovute ad insufficienza epatica o trombosi della vena cava. Bisogna dunque evitare qualsiasi innesto aggressiva lavaggio prima della espianto nel donatore (che a filo con 20 ml in circa 60 secondi) e garantire una conservazione adeguata freddo (full immersion in 0-4 ° C soluzione di Ringer lattato). Il rischio di trombosipuò essere diminuito minimizzando la manipolazione dell'intima e preservare l'integrità. Si sconsiglia l'uso di terapia anticoagulante dopo l'intervento chirurgico.

Morti tra il giorno post-operatorio quattro e nove sono spesso legati alla colangite batterica 7. Sulla base della nostra esperienza, una singola dose di piperacilline / tazobactam (0,03 g) data prima della laparotomia è sufficiente per ridurre al minimo il rischio di infezione dotto biliare comune.

La morte è un evento raro dopo giorno 10. Tuttavia, a causa della mancanza di flusso arterioso, alcuni problemi dotto biliare può essere osservato con cholastasis 8. A seconda delle esigenze del ricercatore uno arterializzazione può essere considerato 9. Da notare, un tempo di ischemia fredda fino a 24 ore può essere considerato accettabile 10.

Il rapido linker sistema è stato originariamente progettato per eseguire il trapianto di fegato con tre gemelli (anastomosi fase anepatica molto breve). Tuttavia, a tre bracciale TEchnique richiede l'uso di pinze molto piccole per la sovraepatica vena cava (SHVC) bracciale e non è stato ampiamente accettato a causa del rischio di problemi al fegato deflusso 11-14. Abbiamo quindi favorire una rapida linker assistito a tre bracciale tecnica solo quando i tempi di ischemia calda inferiori a dieci minuti sono obbligatori. Nella maggior parte degli studi tuttavia, fasi di impianto fino a 15-18 minuti sono accettabili, consentendo l'uso di due bracciale tecnica, e un drenaggio più fisiologico SHVC. Come mostrato in questo documento video, si usa abitualmente il rapido-linker sistema nella seconda parte del solo impianto. Mentre po 'di tempo chirurgico è necessario per posizionare le maniglie quick-linker, questa parte del procedimento è associato a rischi minimi e permette una riduzione dei critici fase anepatica grazie alla maggiore facilità di inserimento polsini. Altri vantaggi del sistema rapido-linker sono meglio un innesto-destinatario allineamento nave e l'uso di più ampi polsini con risultati migliori rispetto al emodinamicitecniche precedentemente descritte (compreso quello descritto da Kamada et al.) 6 (Fig. 7).

Disclosures

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Acknowledgments

CT è stato sostenuto dal Fondo nazionale svizzero (SCORE concessione 3.232.230-126.233). Lo studio è stato sostenuto dalla Fondazione Artères, la Astellas Foundation Europe e la Fondazione Boninchi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tool / Reagent Company Catalogue n. Comment
Portal cuff altecweb.com or smiths-medical.com Coil 01-96-1729 800/100/420 Bore : 1.55mm
Wall : 0.30mm
Length: 3.5 mm
Infrahepatic v. cava cuff altecweb.com or smiths-medical.com Coil 01-96-1733 800/100/540 Bore : 2.40mm
Wall : 0.30mm
Length: 3.5 mm
Common bile duct stent common 22G venflon    
7-0 silk ties georgetiemann.com 160-1226-7/0  
10-0 prolene ethicon.com    
9-0 prolene ethicon.com    
8-0 prolene ethicon.com    
Straight micro forceps s-and-t.net FRC-15RM-8  
Curved micro forceps s-and-t.net FRS-15-RM-8  
Dissection needle-holder s-and-t.net B-15-8.2  
Anastomosis needle-holder rumex.net 8-021T  
Micro clamps finescience.com 18055-03 6 x 1mm
Micro clamps applicator finescience.com 18057-14  
Suprahepatic v. cava clamp pharmap.ch 13.349.14  
Quick-Linker rings dltchiropody.co.uk PAR 10 modified scalpel blades
Quick-Linker approximator pharmap.ch UD-04-275 modified Kocher’s forcep

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References

  1. Starzl, T. E., Marchioro, T. L., Porter, K. A. Experimental and clinical observation after homotransplantation of the whole liver. Revue internationale d'hepatologie. 15, 1447 (1965).
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  10. Urata, K. Decreased survival in rat liver transplantation with extended cold preservation: role of portal vein clamping time. Hepatology. 28, 366-373 (1998).

Comments

1 Comment

  1. Dear Professor/s

    Congratulations for an excellent paper and a very neat video of the procedure. It would have been even more remarkable with explanation and commentary while performing the procedures. While performing the procedure every word of an experienced surgeon is worth and it makes learning easy and minimizes mistakes.

    Sincerely

    Pramod Upadhyay
    National Institute of Immunology, New Delhi, India

    Reply
    Posted by: Pramod U.
    July 14, 2012 - 7:16 AM

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