病変の特異的分子ビーコンを活用した細胞ライセート中の塩基除去修復活性の定量、リアルタイム分析

Biology

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Summary

我々は、細胞核溶解物中のDNAグリコシラーゼとAPエンドヌクレアーゼ活性の定量的、リアルタイム測定のための方法を説明します。アッセイは、動態解析に従順DNA修復活性の速度を得られる組織および腫瘍溶解液または精製したタンパク質とDNA修復活性の定量化のための適応可能である。

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Svilar, D., Vens, C., Sobol, R. W. Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons. J. Vis. Exp. (66), e4168, doi:10.3791/4168 (2012).

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Abstract

我々は塩基除去修復(BER)分子ビーコンを用いたDNAグリコシラーゼと細胞核溶解物中のAPエンドヌクレアーゼ活性の定量的、リアルタイム測定のための方法を説明します。基板(ビーコン)が6 - カルボキシフルオレセイン(6-FAM)5 '末端およびオリゴヌクレオチドの3'末端に結合しDABCYL部分に結合した部分を有する単一の基本病変を含むデオキシオリゴヌクレオチドで構成されています。 BER分子ビーコンは、長さ43塩基であるとシーケンスは、幹1,2のループで13個のヌクレオチド、15塩基対のステム-ループ構造の形成を促進するために設計されています。この構成では、折り畳まれたときに6-FAM部分はフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)3,4を介した非蛍光性の方法でDABCYLによってクエンチされています。病変は6-FAMの部分を含む残りの5つのベースオリゴヌクレオチドは、幹から放出されるように、次の基本病変の除去と鎖切断に配置されている。解放するDNA修復のレベルに比例する蛍光の増加にクエンチャー(DABCYL)の結果から数量剥離。蛍光値の読み込み複数集めることによって、BERの活動のリアルタイム評価が可能です。標準的な定量的リアルタイムPCR装置の使用は、多数のサンプルの同時分析を行うことができます。単一の基本病変、これらのBERの分子ビーコンのデザインは、運動解析、BERの定量化と阻害剤の検証に従順であり、組織や腫瘍細胞溶解物や精製されたタンパク質とDNA修復活性の定量化のための適応可能である。これらの分子ビーコンを使用して、腫瘍ライセートや組織の吸引のBER活動の分析は、機能的なバイオマーカーの測定にも適用可能である。また、この定量的なアッセイを用いて精製したタンパク質とBERの活動の分析は、BER阻害剤の発見と検証のための迅速、ハイスループットな方法を提供します。

Protocol

1。分子ビーコンのデザイン

1.1は、あなたの分子ビーコンの設計と発注

あなたの分子ビーコンの設計では、次のことを考慮する必要があります。

  1. 我々は43-merのDNAオリゴヌクレオチドとの良好な結果を持っています。 GC含量> 32%であるべきである。 5 '末端のGベースを除外します。
  2. リクエスト6-FAM(6 - カルボキシフルオレセイン)の5 '末端および3 DABCYL'修飾に関する共役。
  3. 病変の位置は、5 '末端からベース#6上になければなりません。
  4. ステムまたはヘアピン二本鎖の長さは15 bpの最小値である必要があります。
  5. 推奨されるループの長さは13塩基である。
  6. ビーコンの全体的な構造は、 図1に示されています。
  7. シーケンスおよび病変型が決定されると、オリゴヌクレオチドは、ほとんどのオリゴヌクレオチドの企業から注文することができます。我々は、IDTから我々のオリゴヌクレオチドを​​注文して、オリゴヌクレオチドはHPLC精製とのprovidであることを要求粉体として、または乾燥した形式でED。

あなたの分子ビーコンのアニール1.2

  1. 40μMの濃縮された分子ビーコンストック溶液を与えるために、オリゴ希釈バッファー(0.1mMのEDTA、10mMのトリス-HCl、pH 8.0)で凍結乾燥したDNAオリゴヌクレオチドを​​溶解する。
  2. BER反応緩衝液(下記参照)を使用して、40μMの分子ビーコンストック溶液から200nmの分子ビーコンワーキング溶液を調製します。滅菌黒1.5 mlチューブに200 nMの分子ビーコン、ワーキング溶液を追加します。
  3. 3分間沸騰したお湯の大ビーカーに200 nMの分子ビーコンワーキング溶液を含むチューブをインキュベートします。
  4. 3分後に、熱源からビーカーを削除し、アニーリングを促進するために一晩水の分子ビーコンをインキュベートします。断熱冷却過程を遅くする以上、ビーカーの下に両方の材料を使用しています。
  5. 滅菌、ブラック1.5mlチューブに分注ビーコン、各チューブに100μL。
  6. -30℃で保存

あなたの分子ビーコンの1.3品質評価

  1. BER分子ビーコンは、最適な溶融温度を決定し、加熱すると、各ビーコンは蛍光を発することを確認するために、加熱された蛍光を発するまでないことを確認するために融解曲線解析を行います。
  2. 各ビーコンの高速光96ウェルプレートの6ウェル(アプライドバイオシステムズ社製、カタログ番号4346906)には、 表1に示されている分子ビーコン実用的なソリューションとBER反応緩衝液は、200 nMの指定されたボリュームを追加します。
  3. そのようなStepOnePlus(Applied Biosystems社)システムまたは類似の融解曲線分析の間にFAM色素励起を監視するなどのリアルタイムPCR装置を使用しています。
  4. 融解曲線分析のために少しずつ増加し、温度の関数としてFAM色素励起を監視するためのリアルタイムPCR機器(StepOnePlusシステム)プログラムです。 StepOnePlusシステムは、FAMは蛍光を測定するようにプログラムされてい25日からNCEとランプ°C〜95°C 0.5℃間隔インチ典型的な溶融曲線を図2に示されています。
  5. ほとんど、あるいは全くバックグラウンドの蛍光が50℃以下の温度で見えるはずです純粋で高品質のビーコンの示す蛍光の制服と急増、を確認してください。約60 Tm値°C〜80°C有利であり、すべての希釈のために等しくなければなりません。
  6. この分析からのT max、最大の蛍光[FL(最大)]の値の温度を決定します。ビーコン入力(濃度)のT m以上のT maxでの蛍光値の比例は線形でなければなりません。 T maxは、フロリダ州(最大)での蛍光値は°C少なくとも5倍で37のバックグラウンド値を超えている必要があります。

2。核ライセートの調製

2.1塩基除去修復反応バッファ5の準備

  1. 記載されているすべてのコンポーネントを追加する表2とのddH 2 Oで900 mLに、バッファのボリュームを持って
  2. 水酸化カリウム8.0 N(Sigma、カタログ番号#17-8)を使用して7.8にpHを調整します。
  3. のddH 2 Oを使用して1000 mlにバッファーの量をもたらす
  4. 0.22μmのフィルター、ナルゲン1 Lフィルタ(猫#167から0020)を使用してバッファをフィルタリングします。
  5. BER反応バッファーを使用する前に、すぐにジチオスレイトール(DTT)を追加します。

2.2細胞培養と細胞の分離

  1. それは90〜100%コンフルエントまで培養細胞に提案されている。分析のフルセット(約5×10 7細胞の合計)のために十分な核ライセートを得るために4月6日料理(150ミリメートル)から細胞を分離します。
  2. それは、生物学的には、それぞれの分析のために複製され得るために3つの独立した細胞ペレットの3つの独立した文化を準備することをお勧めします。
  3. 核の溶解を容易にNucBus​​ter分離手順(EMDバイオカルビオケム猫#71183から3)a​​lthを用いて製造されるウワーッ、核の分離プロトコル(下記参照、セクション2.3)。適切であろう。

2.3核ライセートの調製

  1. 起動する前に、凍結乾燥したプロテアーゼインヒビターカクテル(Calbiochem社、カタログ番号539131、セット1)は最初の100倍の在庫を準備し、100μlの滅菌水に再懸濁します。すぐに使用したり、長期保存のために-20℃でアリコートで凍結します。必要に応じてすべての10 7抽出されたセルの100倍株式1μlを、計算します。
  2. 抽出手順の実行中にすべてのステップは、タンパク質の安定性を確保するため°C氷上または4で実行する必要があります。
  3. ラベル15mlファルコンチューブと氷の上の場所。
  4. 細胞から増殖培地を除去し、冷PBS 7.5 mLで2回洗浄する。
  5. セルリフターを用いてプレートから各皿とこすり細胞を冷PBS 5 mLを追加します。冷水15mlファルコンチューブに細胞を移します。
  6. 5分間低速(500分の1グラム、4℃)で遠心します。上清を除去と比較してパックされた細胞の体積を推定する。 (最大250μlのパック細胞容積は、単一の1.5 mlチューブで処理することができます)
  7. 500分の1 gでさらに1分間遠心し、ピペットで、残りのPBSを削除します。 150μlのNucBus​​ter抽出試薬150μlのパック細胞容積当たり:パック細胞容積の大きさに応じてNucBus​​ter抽出試薬1で細胞ペレットを再懸濁します。 (あるいは、細胞ペレットをドライアイスや液体窒素で急速冷凍されたことと°C準備が整うまで続行するには-80℃で保存することができます)。
  8. 再懸濁後、あらかじめ冷却した1.5​​ mlチューブにライセートを転送します。
  9. 高速で高速、5分間氷上でインキュベートし、ボルテックスボルテックス15秒、再び15秒。
  10. 4℃で5分間13,000 xgで遠心分離
  11. 上清を細胞質画分を含んでいます。削除し、-80℃で保存するか、または破棄します。
  12. 1&M、再懸100xのプロテアーゼインヒビターカクテルを1μlの混合物中にペレットを再懸濁U; 100mMのDTT、50μlのパック細胞容積当たり75μlのNucBus​​ter抽出試薬2リットル。
  13. 高速でボルテックス15秒は、高速で5分間氷上でインキュベートし、再びボルテックス15秒。
  14. 4℃で5分間13,000 xgで遠心分離上清を核タンパク質を含んでいます。上清を収集し、次のステップに進みます。

2.4透析、タンパク質定量と分注

  1. 透析手順の実行中にすべてのステップは、抽出の品質を確保するために予備冷却ソリューションは、材料や機器で実行する必要があります。
  2. 表3で説明するように、透析バッファー(サンプルごとに必要な1 L)を準備します。重要:Bufferは(4°C)冷でなければなりません。我々は、少なくとも前日に準備することをお勧めします。ろ過透析バッファーは4℃で保存することができます°C、無期限にDTTが追加されていない場合。
  3. プリチルビーカー(1サンプルあたり1リットルのビーカーの2)、透析緩衝液、透析室、マイクロ遠心機チューブ、注射器と針。
  4. 右の前に使用 - 透析バッファのリットルあたり1 mLの1 M DTTを追加します。
  5. 4℃で90分間、0.5 Lあらかじめ冷却し透析バッファ内のステップ2.3で調製したライセートを透析°C PIERCEスライド-Lyzer透析カセット(7,000 MWのカットオフ0.5から3 mLの透析カセット)を使用して、穏やかに撹拌した。
  6. 0.5 Lあらかじめ冷却し、透析バッファーを含む第二のビーカーに透析カセットを移し、4℃で90分間ライセートを透析°Cを穏やかに撹拌しながら。
  7. 注射器(フィッシャー、猫#309659)を使用して、透析カセットから透析核タンパク質溶液を収集します。透析カセットにタンパク質を注入するために以前使用して異なるガスケットを使用しています。抽出物は、高濃度のタンパク質に起因する結晶化した可能性があることに注意してください。透析核タンパク質の溶液を除去曇り探して結晶を含めるようにしてください。
  8. マイクロ遠心チューブに、20μlのアリコートそれぞれにサンプルを。ドライアイスとSTOR上で急速凍結-80°C、Eを使用するまで。
  9. 標準プロトコルを使用して透析したタンパク質の濃度を決定します。期待される核ライセートの濃度の例を表4に示す。
  10. 最後に、ライセートを品質管理のために評価されるべきである。ライセートの評価は、実験によって異なります。前述のように、我々は日常的に免疫1,2を介して複数のBERのタンパク質の発現のためにライセートを分析します。
  11. 透析の手順は、比較を容易にする細胞株を越えて、均一な反応溶液を作るために使用されています。塩溶液と反応条件が必要な種々の希釈に起因する種々の細胞株および製剤にはもはや同一であるため、透析ステップを省略すると、酵素レートと動態解析に影響を与える可能性があります。しかし、我々は、以上を5μg/μlのライセートを用いて、十分な反応バッファーを追加すると、透析の手順(データは示さず)の省略を許可しないことを観察した。阻害剤の研究番目のために異なる細胞ライセートとの比較を必要としないで、透析が必要になることがないかもしれません。示されているしかし、我々は、透析をお勧めします。

3。分子ビーコンアッセイ

3.1機器の要件

  1. そのようなStepOnePlus定量RT-PCRまたは同等の、またはリアルタイムでFAMの蛍光を検出し、測定することができる96ウェルプレート蛍光光度計として定量的リアルタイムPCR装置、。注意:この手順ではビーコンの蛍光値を読み取り、リアルタイムでそれらを記録することができる任意のマシンにも適用可能である。マシンは、しかし、ユーザーがデータ解析のための生の蛍光値にアクセスできるようにする必要があります。
  2. 使用されている光定量RT-PCRチューブまたはプレートと互換性の遠心操作を行います。
  3. 収集したデータを分析するためのMicrosoft Excelの。

3.2バッファと試薬

  1. 対応するカバー付き光定量RT-PCRチューブまたはプレート。
  2. BER反応バッファー(参照ボーブと表2)。
  3. 透析核タンパク質は、ステップ2.3と2.4で調製し、DTTを含むBER反応バッファーで2μg/μLのタンパク質に希釈した抽出します。
  4. 分子ビーコンは、分子ビーコンワーキング溶液(上記参照)を作成するBER反応緩衝液を200μMに希釈した。

3.3測定のセットアップ(表5)

  1. runメソッドを変更する必要がありますので、定量RT-PCRのマシンは、通常、蛍光計として使用されません。
    1. プログラム最初のステージを、180サイクル(以上、修復アッセイデザインに応じて)の最小値と20秒のサイクルタイム(測定の時点)で37℃に反応温度を設定します。サイクルの間データを収集することを確認してください。したがって、マシンが1時間の合計は20秒のデータを収集します。
    2. 特定のビーコンのTmaxまでの温度、最大蛍光の温度、ランプとして阻止する第2ステージを作成ステップ1.3(あなたの分子ビーコンの品質評価)で採掘。サイクルタイムは再び15サイクルの合計で20秒でなければなりません。これは、ビーコンの可能な最大の蛍光で5分間、20秒ごとにデータを収集します。 Tmaxの時サイクルの間に測定される蛍光の値は、各ウェルの蛍光値(ステップ4.2A)を正規化するために使用されています。いくつかの異なるビーコンを使用している場合と同様に、これらのビーコンのTmaxは、同様の反復的な値を提供する手順を含めるようにしてください。
    3. 25μLの反応液量を設定します。
  2. アプライドバイオシステムズ社製のソフトウェアを使用して定量RT-PCRマシン上のプレートのデザインを設定します。実験の種類 - 我々は唯一の生の蛍光値に興味を持っているので、 "標準曲線"を選択してください。
  3. プレートレイアウトを完了します。例を表5に示されています。標準曲線として選択したウェルには何も追加しないでください。

3.4ラン検定

  1. インプortant:予備冷却材料とソリューションを使用します。を実行し、検出されるまで冷静さを保つ。
  2. 使用するBER反応バッファーにDTTの適切な量を追加します。
  3. BER反応バッファー(DTTを含む)の使用は2μg/μLの濃度になるようにタンパク質溶液を希釈します。
  4. 最初の実験のために我々は、40 nMの最終濃度(5μL/ウェル)で、ウェルあたり透析核ライセート(5μL/ウェル)を10μgと基板1ピコモルを使用する分子ビーコンを示唆している。それは異なった細胞ライセートまたはビーコン基板が高いか低いタンパク質濃度を決定することが可能であるが、我々は一貫して、細胞ライセート10μgの高品質と再現性のある結果を得ています。
    1. 各ウェルのアッセイ成分は、15μLのBER反応バッファー、5μLビーコンと5μL核ライセートである。三重の各ビーコン/ライセートを組み合わせて実行します。
    2. いくつかのネガティブコントロールは、例えば25&としてビーコンなしでサンプルを含め、全てのビーコンに必要とされるムー、唯一のBER反応バッファー、5μl​​のライセートとライセートせずにビーコンの5μLとBER反応緩衝液20μL、20μLのBER反応バッファのL。
    3. 複数のコントロールのサンプルが各核ライセートが必要になります。これらは、負の制御[15μLBER反応バッファー、5μLのコントロールビーコン(無病変)と5μLサンプル溶解液を]などがあります。我々はまた、脱塩基部位を含むオリゴヌクレオチドを​​模倣すると容易に[15μLBER反応バッファー、5μLTHFビーコンと5μLサンプルのライセート]を切開されているビーコンを含むTHFの包含などの実験のポジティブコントロールを含めることが示唆された。もちろん、正確な陽性対照は、全体的な実験デザインに依存します。
  5. 例として、プレートレイアウトについては、下記表5に従います
  6. 信号検出する前に、反応の開始を最小限に抑えるために氷や冷却スタンドの間に光チューブまたはプレートにピペット。
  7. すべてのウェルに最初のピペットBER反応バッファー。
  8. ザ nの正しい井戸と常にピペットにプレートレイアウトに従ってピペットビーコン信号検出する前に、反応の開始を最小限に抑えるためにウェルに最後のライセート。
  9. シールチューブまたはプレートは、徹底的に混合し、チューブまたはプレートの下にソリューションを収集するために遠心機でスピン
  10. 定量RT-PCRマシンにプレートを挿入し、アッセイを開始します。
  11. 終了後、好ましくは、Excel形式で、生データをエクスポートします。 StepOnePlusシステムのためにのみ、多成分のデータが必要とされている。これは、染料の色とよく並び順を読み取り、複数のすべての蛍光値が含まれています。

4。分子ビーコンアッセイの分析

我々は、これらの分析と計算を実行するMicrosoft Excelのソフトウェアを使用していました。我々は標準的な96ウェルフォーマットから派生したデータに基づいて、簡単かつ迅速な分析とグラフ表示を許可する確立テンプレートとマクロをお勧めします。

背景4.1取外し

">
  • 多成分データから生の蛍光値を使用して、最初に/ウェルサンプルでデータを編成します。個々の複数の表示行を持つExcelファイルの結果、これは "列にまたがって"データをエクスポートすることによって達成することができますStepOnePlusシステムのために列の異なるウェルに異なるサイクルで読み込みます。
  • すべての個々の分子ビーコンは、その分子ビーコンを使用して、すべてのウェルの各サイクルでの蛍光値から陰性コントロール(BER反応緩衝液の20μLとビーコンの5μL)で検出されたバックグラウンド蛍光値を減算します。これは、将来の分析からライセートに関連付けられていないバックグラウンド蛍光の変更を削除します。
  • 4.2 FL(Tmax)を正規化

    異なるウェルにピペッティングし、蛍光検出のばらつきに対処するために、我々は最大蛍光値(ビーコン入力と相関している)にデータを正規化します。

    1. FL(T max)と(ステップ3.3aii):よく、個々のT maxでのサイクルの平均蛍光値を計算します。
    2. 比はFL(サイクル×)/ FL(T max)を計算し、100を掛けます。完全に切開したときにFL(T max)は最大の可能な蛍光値に対応している可能性が高いという仮定の下、これらの正規化されたデータは%無料のFAMを(=%のBER切開ビーコン)を表します。
    3. サイクルごとの3坑井のデータ(%フリーFAM)(サイクル180まで)平均することによって、三重のサンプルを組み合わせて、各エラーを計算します。
    4. サイクルごとに20秒を乗じて時間を計算します。
    5. 蛍光検出のウェル間の差異が重要であることができるので、我々はこのような個々のウェルの再調整蛍光値などの標準的な機能分子ビーコン株式にROXの蛍光染料を追加することをお勧めします。このケースでは、ROX色素がよく、すべての単一の内部標準(パッシブリファレンス)として使用されます。 ROX励起および発光スペクトル(励起 - 588 nmの発光608 nm)は、アッセイに用いた6-FAM色素( - 495 nmの発光 - 520 nmで励起)のそれとは異なります。 ROX色素はアーティファクトすることにより発生したウェル間差の正規化を可能にする従来のRT-PCRの手順に似て正規化ステップを可能にするでしょう。これらのエラーをピペッティングあるいは蛍光検出効率のウェル間の変動に由来することがありますから、可能性があります。

    4.3プロット

    1. 対応するエラーが発生した散布図での時間(秒単位)に対してプロット正規化された蛍光データ(%フリーFAM)。
    2. 我々は、生物学的複製さを表す少なくとも三つの異なる核ライセート調製物中に修復動態を分析することをお勧めします。分散を評価するために、個々の実験の平均値から計算間の実験誤差が表示されるはずです。
    3. 2つの腫瘍細胞溶解物の代表的な分析:LN428、神経膠腫メチルプリンDNAグリコシラーゼ(MPG)とLN428/MPG、MPGの上昇した発現のために設計された同じセルラインの検出不可能なレベルを持つ細胞株、両方の細胞株は、APエンドヌクレアーゼ1(APE1)1,2と同等のレベルを持っています。それぞれがBER THF分子ビーコン( 図3)およびTHF =テトラヒドロフラン(APE1の基質)とHx =ヒポキサンチン(MPG用の基板)BER Hxは分子ビーコン( 図4)を使用して 、APE1活動とMPG活性のためにプローブした。注:LN428ライセートと比較すると、図3(THF基板)では、LN428/MPGライセートからの結果が低い最大の絶対的な蛍光を示しています。これは、Tmaxは値(3.3Aを参照)を用いて測定し下にビーコンの入力値の結果です。この低い値は、結果を正規化するために使用されたとき、それはプロットの大きな変化をもたらす。これは、うまくデータを正規化することの重要性を示しています。単独で絶対的な蛍光値をプロットするとREPAを示唆するLN428とLN428/MPG細胞間のIR率が異なっています。ただし、データはウェル間のばらつきを考慮して正規化されたときに、APE1媒介修復率の差が最小であることが示されている。

    5。代表的な結果

    我々は塩基除去修復を使用して細胞核溶解物中のDNAグリコシラーゼとAPエンドヌクレアーゼ活性の定量的、リアルタイム測定(BER)分子ビーコン( 図1)の方法を説明します。一度アニール、我々はあなたの分子ビーコンの品質評価( 図2)として、融解曲線分析( 表1)を実行をお勧めします。核の溶解物は、 表2に記載されているバッファコンポーネントを使用して、調製することができる。 4℃で90分間、0.5 Lあらかじめ冷却し、透析バッファーでライセートを透析°C 表3に記載されている透析緩衝液に対してPIERCEスライド-A-Lyzer透析カセットを使用して穏やかに撹拌した。収集するシリンジを用いて透析カセットからの核タンパク質溶液を透析した。透析カセットにタンパク質を注入するために以前使用して異なるガスケットを使用しています。標準プロトコルを使用して透析したタンパク質の濃度を決定します。期待される核ライセートの濃度の例を表4に示す。 表5に示すようにプレートのレイアウトを使用して、上記に示した反応(手順3.4)を実行します。両方の細胞株は、APと同等のレベルを持っています。LN428、メチルプリンDNAグリコシラーゼ(MPG)とLN428/MPG、MPGの上昇した発現のために設計された同じセルラインの検出不可能なレベルでの神経膠腫細胞株:2つの腫瘍細胞溶解物の代表的な分析エンドヌクレアーゼ1(APE1)1,2。それぞれがBER THF分子ビーコン( 図3)およびTHF =テトラヒドロフラン(APE1の基質)とHx =ヒポキサンチンBER Hxは分子ビーコン( 図4)を使用して 、APE1活動とMPG活性のためにプローブした(MPG用基板)。最後に、ウラシルグリコシラーゼ活性に報告されるBER DU /分子ビーコンを使用して、我々は、信号出力または信号強度はタンパク質の10μgので最大であり、タンパク質の0.62μgの( 図5)で検出できないレベルに減少を示しています。

    図1
    図1。 BER分子ビーコンの全体的な構造。に示される配列と溶融した後、再度アニーリングとした後、一本鎖分子として本明細書中で使用されるBER分子ビーコンの全体的なデザインです。シーケンスの太字、斜体の部分は、ステム(15塩基)であり、配列の下線部分は、ループ(13拠点)である。 FAM = 5 '蛍光色素6 - カルボキシ[5'末端に、Abmax = 495 nmであり、Emmax = 520 nmの吸光係数(260 nm)で:20960、吸光係数(吸光度最大時):75000]とDABCYL = 3 '消光剤スマック [3 '末端に、Abmax = 453 nmで、焼入れ範囲= 425から520 nm]でシリンダ。X =病変(研究課題に応じて異なります)とY =病変反対ベース(研究課題に応じて異なります) 。

    図2
    図2。代表的な融解曲線()はBER分子ビーコンコントロールが示されています。曲線を溶かし 、テトラヒドロフラン(THF)部分(B)またはヒポキサンチン(Hx)が部分(C)を含むBER分子ビーコン。オリゴヌクレオチドの濃度は128 nMで(オレンジ)、青0 NM(ダークブルー)、8 nm(赤色)、16 nm(緑)、32ナノメートル(紫)、64 nMの範囲であった。 、ステップ1.3で説明したように、アニールオリゴヌクレオチドは、25から加熱した°C〜95°C 0.5°C間隔およびStepOnePlusシステムは各0.5℃間隔でFAMの蛍光を測定するためにプログラムされています。

    コンテンツ "> 図3
    図3。 BER THF分子ビーコンを使用した代表的なデータが。脱塩基部位アナログテトラヒドロフラン(THF)の加水分解のために特定のAPエンドヌクレアーゼ活性は、対照細胞株(LN428)とMPG過剰発現細胞株(LN428/MPG)から核ライセートで測定した。またはBER THF分子ビーコン(LN428、青、LN428/MPG、赤)、各ライセートは、BER分子ビーコン制御(LN428/MPG、紫LN428、緑)のいずれかを用いて解析した。結果は、(A)の平均蛍光応答単位と(B)(THF =テトラヒドロフラン)上記第4項で説明したようにビーコンの入力に正規化され、同じデータをとして報告されます。

    図4
    図4。 MPG基板hの除去のためのBER Hxは分子ビーコン DNAグリコシラーゼ活性を用いた代表的なデータの特定ypoxanthine(HX)は、コントロール細胞株(LN428)とMPG過剰発現細胞株(LN428/MPG)から核ライセートで測定した。またはBER Hxは分子ビーコン(LN428、青、LN428/MPG、赤)、各ライセートは、BER分子ビーコン制御(LN428/MPG、紫LN428、緑)のいずれかを用いて解析した。結果は、(A)の平均蛍光応答単位と(B)(HX =ヒポキサンチン)上記第4項で説明したように正規化され、同じデータをとして報告されます。

    図5
    図5。 BER DU /別の蛋白質レベルでの分子ビーコンを使用した代表的なデータです。ウラシルの除去(DU / A)の特定のDNAグリコシラーゼ(UNG)活性は、T98G細胞からの核溶解物中で測定した。 fに示すように、T98Gライセートを、10、5、2.5、1.25または0.62μgのタンパク質レベルで、BER分子ビーコンコントロールまたはBER DU /分子ビーコンのいずれかを使用して分析したigure。上記のセクション4で説明したように結果が正規化されたデータです。

    ビーコンの濃度(nM) 0 8 16 32 64 128
    分子ビーコンワーキング溶液 (約200nm)を加え(μL) 0 1 2 4 8 16
    BERの反応緩衝液(W / O DTT)(μL) 25 24 23 21 17 9

    表1。融解曲線実験のレイアウト。

    1リットルの合計 必要に応じてストック溶液の体積 コン。ストック溶液 最終的なコン。
    HEPES-KOH 25 mLの 1M pH7.8では 25 mMの</ TD>
    塩化カリウム 75 mLの 2 M 150mMの
    EDTA 1 mLの 0.5M pH8.0 0.5mMの
    グリセロール 10 mLの N / A 一パーセント
    DTT(使用前に追加) 0.5 mLの 1 M 0.5mMの
    H 2 O 888.5 mLの N / A N / A

    表2。 BER反応バッファー。

    1リットルの合計 必要に応じてストック溶液の体積 コン。ストック溶液 最終的なコン。
    HEPES-KOH 50 mLの 1M pH7.5 50mMの
    塩化カリウム 50 mLの 2 M 100 mMの
    EDTA 1 mLの 0.5M pH8.0 0.5mMの
    グリセロール 200mLの N / A 20パーセント
    DTT(使用前に追加) 1 mLの 1 M 1mMの
    H 2 O 698 mLの N / A N / A

    表3。透析バッファー。

    細胞株 蛋白質濃度(μg/μL)
    LN428 5.34
    LN428/MPG 4.79

    表4。タンパク質定量の結果。

    ネガティブコントロール25μLBERバッファー (バックグラウンド制御)20μLBERバッファー
    5μLコンビーコン
    NOのライセートません
    (3回のテスト)<BR />15μLBERバッファー
    5μLコンビーコン
    5μLLN428ライセート
    (3回のテスト)
    15μLBERバッファー
    5μLコンビーコン
    5μLLN428/MPGライセート
    ネガティブコントロール25μLBERバッファー (バックグラウンド制御)20μLBERバッファー
    5μLTHFビーコン
    NOのライセートません
    (3回のテスト)15μLBERバッファー
    5μLTHFビーコン
    5μLLN428ライセート
    (3回のテスト)15μLBERバッファー
    5μLTHFビーコン
    5μLLN428/MPGライセート
    負の制御
    20μLBERバッファー
    5μLライセート
    (バックグラウンド制御)20μLBERバッファー
    5μLHxはビーコン
    NOのライセートません
    (3回のテスト)
    15μLBERバッファー
    5μLHxはビーコン
    5μLLN428ライセート
    (3回のテスト)15μLBERバッファー
    5μLHxはビーコン
    5μLLN428/MPGさLyサテ
    負の制御
    20μLBERバッファー
    5μLライセート

    表5。分子ビーコンアッセイセットアップ。

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    Discussion

    ヘリカーゼ活性6を含む多数の分子や酵素活性を検出および定量のための用語"分子ビーコン'を使用して600の引用は、DNAポリメラーゼ活性7,8、DNAリガーゼ活性9、テロメラーゼ活性10、DNA光回復酵素活性を11とDNA /超えています他の多くの間RNAハイブリッド12。上記のDNA修復活性の測定のための分子ビーコンの使用に加えて、我々と他のBER活動1,2,13-15の分析のためにこれらのプローブの有用性を実証した。

    我々はここに記述リアルタイムBER活性アッセイは、単一の修飾塩基を搭載し、病変と反対ベースのさまざまな病変や変化のBER率の定量的評価が可能になります。アプリケーションは、分子機構の研究から阻害画面に及ぶことができます。我々はリサを比較することにより、BER特異性を実証MPGからTESは、非発現細胞とコントロールビーコンの活動の欠如を持つ細胞を発現している。アッセイは、BERタンパク質MPG 2またはXRCC1 1の発現の欠陥の検出を可能にする、高感度であり、[投稿準備中]マイナーDNA修復速度論的パラメータの変化とDNA修復阻害剤の効果を検出するのに十分である。複数の、運動率とそれらの運動率の変更の意義を算出し、アクティブな修理時間のサポートを通して読み込みます。 BER分子ビーコンアッセイは、したがって、DNA修復酵素阻害剤(インヒビターの画面)または個々の核成分の役割に関する研究のための画面にハイスループットの研究に適しています。核溶解物の分析では、BER複合体の完全なコンテキストにおけるDNA修復の評価はそのためにもBERの機械(例えば、翻訳後修飾や変異)を間接的な変化や影響を描いたことができます。

    ザプロトコルは、説明したように、再現性の高いと定量的な結果が得られます。しかし、適切な分析を確保するために考慮すべきいくつかの詳細があります:(1)ネガティブコントロールのバックグラウンド値が高すぎるかもしれません:これは、悪い記憶またはオリゴヌクレオチドの製造に起因することがあります。ビーコンなしの溶解物中の高バックグラウンド値が交絡自動蛍光(汚染または外因性の蛍光タンパク質の細胞内発現によるIE)を示しています。蛍光タンパク質の発現は避けられない場合は、レポーター色素と蛍光タンパク質の励起/発光スペクトルは重なっていてはならない、(2)FL(Tmaxは)低く、DNA濃度は、与えられたとは異なります。光度計を使用して、例えば吸光光度法によるDNA濃度(OD 260nmのチェックしてください。低FLの高いDNA濃度(Tmaxは)ビーコンに十分なFAMのロードを示しています。 HPLC精製は、未修飾DNA(上記参照)による汚染を防止、(3)修復活性は不良である:FL(Tmax)を値でない場合最後のサイクルが十分なビーコンの入力と蛍光検出を示し、これは、核抽出物の準備が失敗したことを示唆しているかもしれません。核抽出物の品質が重要である。低い温度は、-80℃で長期保管を含む手順全体を通して保証されるべき°C(4)修復活性曲線は、高い値で開始し、室温へのサンプルであっても非常に短いの暴露は、分析前に修復を開始します。すべての回で冷静さを保つ。

    この高感度で定量的なBER測定法に応じて分子ビーコンを変更することにより、基質特異性に関する研究を可能にし、また、精製タンパク質の分析に適用可能である。最後に、アッセイは、我々はアルキル化剤テモゾロマイド2のPARP1阻害剤の増強のために腫瘍を評価するために提案されているように、レスポンスまたは治療効果のマーカーとして機能するDNA修復のエンドポイントを測定する機会を提供し、腫瘍組織溶解物の分析に適用可能である。

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    Disclosures

    RWSはTrevigen社、著者の他の利害の衝突が存在しないことを宣言する科学コンサルタントです。

    Acknowledgments

    この作品は、ピッツバーグ財団と米国立衛生研究所(NIH)からの補助金によって支えられて[GM087798。CA148629。ES019498] RWSに。 UPCIレンチウイルス機能のサポートは、国立衛生研究所からがんセンター·サポート·グラント[P30 CA047904]でRWSに提供されました。サポートは、ピッツバーグ大学の薬理学教室&DSのケミカルバイオロジーによって提供されました。サポートもCVにエストロゲンによって提供されました。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Potassium Chloride Fisher P217-500 Molecular grade
    EDTA Fisher BP120-500
    Glycerol Fisher BP229-1 Molecular grade
    DTT Fisher BP172-5
    HEPES- Solution Invitrogen 15630
    HEPES-Salt Sigma H4034-500G
    Potassium Hydroxide Sigma 17-8
    0.22μM filter Nalgene 167-0020
    Slide-A-Lyzer Dialysis Products Pierce 66373 MW 7000
    Syringe Fisher 309659
    Needle Fisher 305196
    1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher 05-408-129 Black
    15 mL Falcon Tubes Fisher 352097
    NucBuster Protein Extraction Kit Calbiochem 71183
    PBS Invitrogen 14190
    Molecular Beacons IDT
    BioRad Protein assay dye reagent concentrate BioRad Cat# 500-0006

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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